急性心肌梗死早期诊断标志物的制作方法_2

文档序号:9642354阅读:来源:国知局
包括DSG3基因以及DSG3基因的任何功能等 同物的多核苷酸。DSG3基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中DSG3基因 (NC_000018. 10)DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
[0023] 优选地,DSG3基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子:
[0024] (1)序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列;
[0025] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
[0026] (3)与(1)或⑵限定的DNA序列具有70%、优选地,90%以上同源性,且编码相 同功能蛋白质的DNA分子。
[0027] 在本发明的具体实施方案中,所述DSG3基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0028] 在本发明的上下文中,DSG3基因表达产物包括DSG3蛋白以及DSG3蛋白的部分肽。 所述DSG3蛋白的部分肽含有与急性心肌梗死相关的功能域。
[0029] "DSG3蛋白"包括DSG3蛋白以及DSG3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括DSG3蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性衍生物,等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与DSG3的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0030] 优选地,DSG3蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白质:
[0031] (1)由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
[0032] (2)将SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个,较佳地 1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个。
[0033] (3)与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一 性),更优选地,与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性,常为96%、 97 %、98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0034] 在本发明的具体实施方案中,所述DSG3蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白质。
[0035] 通常,已知的是,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0036] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是DSG3蛋白的融合 蛋白。对于与DSG3蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制,只要所得的融合蛋白保留DSG3蛋 白的生物学活性即可。
[0037] 本发明的DSG3蛋白也包括对SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的非保守修饰,只要 经过修饰的蛋白质仍然能够保留DSG3蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变 的氨基酸数目通常是10个或者更少,例如6个或者更少,例如3个或者更少。
[0038] 在本发明的上下文中,"诊断急性心肌梗死"既包括判断受试者是否已经患有急性 心肌梗死、也包括判断受试者是否存在患有急性心肌梗死的风险。
[0039] 本发明的优点和有益效果:
[0040] 本发明首次发现了 DSG3基因表达与急性心肌梗死相关,通过检测受试者中DSG3 的表达,可以判断受试者是否患有急性心肌梗死、或者判断受试者是否存在患有急性心肌 梗死的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0041] 本发明发现了一种新的分子标记物-DSG3基因,相比传统的检测手段,基因诊断 更及时、更特异、更灵敏,能够实现急性心肌梗死的早期诊断,从而降低急性心肌梗死的死 亡率。
【附图说明】
[0042] 图1显示利用基因芯片检测DSG3基因在急性心肌梗死患者和正常人中的表达差 异;
[0043] 图2显示利用QPCR检测DSG3基因在急性心肌梗死患者和正常人中的表达差异。 具体的实施方式
[0044] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条 件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0045] 实施例1筛选急性心肌梗死患者和正常人中差异表达的基因
[0046] 1、研究对象:
[0047] 收集体检健康者5例(正常对照组),选择门诊急性心肌梗死患者5例。男女不 限,年龄不限。AMI患者均符合1979年国际心脏病学会和协会及WHO临床命名标准化联合 专题组制定的标准。所有患者均排除恶性肿瘤、急性感染、外伤及严重肝、肾疾病、脑栓塞、 肺栓塞、下肢静脉栓塞、DIC和急性肾功能不全等疾病。
[0048] 所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
[0049] 2、采血方法
[0050] 受试者于清晨安静状态下,空腹肘前静脉抽血2ml。
[0051] 3、血液中总RNA的提取
[0052] (1)勾衆处理(Homogenization)
[0053] 直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10分钟, 10, OOOrpm离心1分钟。彻底吸弃上清,收集白细胞沉淀。每100-200 μ 1血液收集的白细 胞沉淀加入1ml TRIzol。
[0054] (2)分层(Phase Separation)
[0055] a.样品加入TRIzol后,室温放置5min,使样品充分裂解。
[0056] b.每1ml TRIzol加入200 μ 1氯仿,剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分 相。
[0057] (3) RNA 沉淀(RNA Precipitation)
[0058] a. 4°C 12, OOOrpm离心10_15min。样品会分成三层:黄色的有机相,中间层和无色 的水相,RNA主要在水相中,把水相(通常可吸取550 μ 1)转移到新管中。
[0059] 13.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇,室温放置10-2011^11。4°(: 12,000印111离心 10min,弃上清,RNA沉淀于管底。
[0060] (4) RNA 漂洗(RNA Wash)
[0061] a. RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇(用RNase-free水配制),温和振荡离心管,悬浮 沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75%乙醇。
[0062] b. 4°C 5, 000-8, OOOrpm离心l-2min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上 清,室温放置1-2分钟晾干沉淀。
[0063] (5)溶解 RNA(Redissolving the RNA)
[0064] 沉淀中加入50-100 μ I RNase-free水,轻弹管壁,以充分溶解RNA,-70°C保存。
[0065] 4、RNA质量和纯度检测
[0066] RNA质量:通过RNA完整性来表示,可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:1. 2% 胶;0. 5XTBE电泳缓冲液;150v,15分钟)检测完整性。
[0067] RNA纯度:0D260/0D280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA 样品,0D260/0D280 值(IOmM Tris, ρΗ7· 5)在 2. 0 左右。
[0068] 5、基因芯片杂交及扫描
[0069] 总RNA经线性化扩增后,cy3-UTP标记,荧光标记后的cRNAs采用R
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