枇杷srap标记体系及枇杷矮化杂交种的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业应用领域，具体涉及一种枇杷SRAP标记体系及枇杷矮化杂交种 的鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.)系蔷薇科苹果亚科（Mloideae)枇杷属 (Eriobotrya) -种常绿乔木果树，果实营养丰富，并具有止咳、抗癌等药用价值，栽培经济 价值高。我国是枇杷的起源地，种质资源丰富，原产于我国的枇杷属植物有21个大种类，而 我国培育的枇杷栽培品种已超过100种。然而目前我国枇杷栽培品种仍以大或中冠乔化稀 植树体为主，缺少矮化密植品种，易导致管理不便，产量、品质和效益降低，以及难以适应设 施栽培等现实问题。我们经过多年的实践探索，从半矮化枇杷双亲品种甜种与白玉杂交的 Fl代植株在性状分离后，通过形态学鉴定获得了矮化性状突出、稳定的枇杷杂交株系861。 进一步利用分子标记技术对枇杷矮化杂交种真实性进行分子水平鉴定及评价，是加快枇杷 矮化育种进程的必需工作。目前，RAPD、SSR等分子标记技术已在桃、梨、杨梅、香橙、李、石 榴等果树品种遗传多样性与亲缘关系评价、杂交后代鉴定等育种工作方面进行了应用。
[0003] SRAP 标记（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性） 是2001年由美国加州大学蔬菜系Li&Qurios等人发明的一种基于PCR反应的分子标记技 术，具有简便、快速高效、共显性、产率高、重复性好、多态性丰富、成本低及无需预知物种序 列信息等众多优点。SRAP标记克服了 RAH)标记的重复性差、AFLP标记的繁锁昂贵和ISSR 属显性标记的不足。SSR标记也以多态性高、重复性好、共显性等优点获得高度公认，但其 高效引物的开发依赖于物种基因组序列（枇杷基因组尚未测序），而且SSR标记位点与目 标基因相距一般较远，对性状预测准确性降低。SRAP标记主要针对开放阅读框（ORFs)进 行扩增（上游引物针对外显子区域，下游引物针对内含子、启动子区域进行扩增），因不同 物种、个体的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性，且引物设计无需预知物种基 因组序列 [12]。SRAP技术目前已广泛应用于植物遗传多样性分类、遗传图谱构建、亲缘关系 分析、品种指纹图谱鉴别、杂交后代与种子纯度鉴定、目标基因定位等分子标记辅助育种方 面。
[0004] SRAP最佳反应体系与植物种类有关系，前人在苹果、葡萄、三华李、桔柑、柿、澳洲 坚果、核桃等果树上进行了 SRAP体系优化，乔燕春等[11]以西班牙枇杷品种'Javierin'为 试材进行了 SRAP体系优化，但多次实践发现其在实生冠玉、丰玉等国内某些枇杷品种扩增 中并不能获得良好条带。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种能够良好适用于枇杷杂种鉴定和亲缘关 系分类的枇杷分子辅助育种工作的枇杷SRAP标记体系及枇杷矮化杂交种的鉴定方法。
[0006] 本发明采用以下技术方案：枇杷SRAP标记体系，由SRAP引物、从枇杷幼叶提取的 DNA、dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液构成，其特征在于，所述的SRAP引物由表1中的正向引物 mel~9和反向引物eml~11组合成的至少一对引物构成；当SRAP引物中引物Tm最低值 >48°C时，枇杷DNA扩增的退火温度为50°C ;当SRAP引物中引物Tm最低值<48°C时，枇杷 DNA扩增的退火温度为45°C。
[0007] 前述的枇杷SRAP标记体系，枇杷DNA扩增的条件为：94°C预变性5min，先进行5个 PCR循环，每个循环94°C变性Imin，35 °C退火Imin，72 °C延伸Imin ;再进行35个循环，每个 循环 94°C变性 lmin，50°C或 45°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，最后 72°C延伸 lOmin。
[0008] 前述的枇杷SRAP标记体系，所述的枇杷幼叶包括半矮化双亲品种白玉和甜种、白 玉和甜种的Fl代杂交种861品系、实生冠玉、冠玉、美玉、丰玉、青种、宁海白。
[0009] 前述的枇杷SRAP标记体系，以枇杷SRAP标记体系的总体积为15 μ L，包括 10\卩〇?缓冲液、0.6-0.841]了&9酶，0.18-0.361^0嫩，1.2-1.44 4 1^的2.5臟〇1/^1^(1犯138， 0· 36-0. 48 μ L 的 10 μ mol/ μ L 的 SRAP 引物。
[0010] SRAP 引物的组合方式包括 em3me5、em5me6、eml0me7、em4me5、em8me6、em9me3、 emllme2、em6me6〇
[0011] 枇杷矮化杂交种的鉴定方法，包括如下步骤：
[0012] 以枇杷矮化杂交种861品系及其父本甜种和母本白玉的幼叶分离的DNA为材料， 应用权利要求4所述的批杷SRAP标记体系，用筛选出的em3me5、em5me6、eml0me7、em4me5、 em8me6、em9me3、emllme2引物组合分别进行SRAP扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳检测；判断 杂交种861品系的SRAP图谱中是否存在父本特征带，若有则确定为父母本真实杂交后代；
[0013] 以枇杷矮化杂交种861品系及其双亲品种白玉与甜种、5个江苏枇杷资源品种一 实生冠玉、冠玉、美玉、丰玉、青种和1个浙江资源品种一宁海白的幼叶分离的DNA为材料， 应用权利要求4所述的枇杷SRAP标记体系用16对引物组合进行扩增和电泳检测，筛选出 能区分开9个品种的SRAP多态性图谱；根据电泳图谱中条带的有无转化成[0, 1]距阵，利 用NTSYS-PC 2. IOe软件计算相似系数，并根据相似系数SM矩阵采用UPGM法聚类分析， 构建遗传多样性树状图，分析9个品种间亲缘远近关系；所述的16对引物组合为emlme6、 em3me5、 em4me5、 em5mel、 em5me6、 em6me6、 em6me7、 em7me7、 em8me6、 em9me3、 em9me7、 eml0me2、eml0me5、eml0me7、eml0me8、emllme2〇
[0014] em9me3、em6me6、em4me5三对引物能将9个枇杷品种完全区分开，3对引物共扩增 出41个多态性位点，平均每对引物扩增出13. 6个位点。
[0015] 本发明以枇杷为试材，先通过单因素分析试验对枇杷SRAP扩增程序中退火温度 和扩增体系中4个主要因子DNA、dNTPs、Taq酶及Primers含量进行优化，在此基础上对枇 杷矮化杂交种861品系的真实性及其与8个白沙枇杷品种间亲缘远近关系进行了 SRAP标 记鉴定与分析。实验结果表明：（1)优化后的枇杷SRAP体系（15 μ L)为：1. 5 μ L 10XPCR buffer (添加了 Mg2+)，9. 9 μ L ddH20, 36ng DNA，1. 2 μ L 2. 5mM dNTPs，0· 48 μ L 10 μ M 上下 游Primer (上下游引物摩尔比或质量比I :1)，(λ 24 μ L 2. 5U/μ L Taq酶。SRAP后35个循 环中退火温度优化为50°C (引物Tm>48°C时）或45°C (引物Tm〈48°C时）复性lmin。（2)6 对SRAP引物在矮化杂种861中均扩增出父本特异带，表明其为父母本真实杂交种。（3)SRAP 聚类分析表明，杂种861品系与8个白沙枇杷品种间可被划分为三大类群（由近及远）：5 个江苏枇杷资源品种群（包含杂种861及其父本）、浙江资源宁海白栽培品种和实生冠玉类 群（3个品种）。本发明表明优化后的SRAP体系能良好适用于枇杷杂种鉴定和亲缘关系分 类等枇杷分子辅助育种工作。摩尔质量指的是引物分子量，因此1:1不太可能
【附图说明】
[0016] 图1为9个枇杷品种（系）DNA电泳检测图谱；
[0017] 图2为枇杷SRAP-PCR退火温度的优化电泳图谱；
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