Nk718三系配套杂交种制种方法
【专利摘要】本发明公开了一种NK718三系配套杂交种制种方法，本发明提供了一种杂交制种的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京464为不育系，玉米自交系京464为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种NK718。本发明的实验证明，本发明利用育成的不育系S京464、保持系京464和恢复系京2416进行NK718三系配套杂交种制种，配制的不育化杂交种NK718种子在产量、抗性及其他农艺性状上与常规制种方法生产的NK718种子基本相同。CGMCC No.86572013.12.25
【专利说明】NK718三系配套杂交种制种方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种NK718三系配套杂交种制种方法。
【背景技术】
[0002] 强优势杂交种的选育和推广是提高玉米产量的重要途径。利用常规的制种方法配 制杂交种需要对母本进行人工去雄，不仅耗费大量的劳动力，增加种子生产成本，且存在由 于去雄不及时、不彻底影响种子质量的潜在风险。利用雄性不育系制种是保证种子纯度提 高玉米产量的一种有效方法。
[0003] 早在上世纪五六十年代，国内外就开始了对玉米不育化制种的研究。细胞质雄性 不育由于容易实现不育系、保持系和恢复系的配套，是玉米育种中利用的主要类型。细胞质 雄性不育系可划分为T、S和C型。60年代初，T型不育系引入我国。由于对玉米小斑病"T 小种"专化性侵染，T型不育系的应用受到严重限制。70年代，我国育种工作者从国外引进 C型、S型不育系。C型不育系虽然不育性较稳定、彻底，但其恢复系通常需要重新转育，周 期长且步骤繁琐，导致该型不育系在实践中难以普及应用。S型不育系是3种类型中最大的 一个组，已有研究证明昌7-2等黄改系材料是其天然强恢复系。但S型不育系的育性因基 因型背景的不同而有较大差异，在特定的遗传背景下育性高度稳定。国内优良玉米杂交种 的父本多属黄改种质，因此充分利用S型不育系可以节省恢复系的转育工作，是实现快速 不育化制种研究和应用的有效途径。
[0004]实现玉米细胞质雄性不育化制种的关键是不育系、保持系和恢复系的选育。选育 不育系最常用的方法是回交转育法，即用稳定的不育系作非轮回亲本，选择优良自交系作 轮回亲本，进行多代回交，育成不育性稳定的优良不育自交系，而原轮回亲本便是该不育系 的保持系。但仅仅利用传统的回交转育方法，一般需回交5-6代，转育周期较长，延缓了不 育化制种技术在玉米杂交种上的应用。利用回交转育方法进行恢复系的选育比不育系更为 复杂，在回交的同时要进行测交，以测交结果作为恢复系的选择标准；或在回交转育中利用 不育细胞质提供育性的指标性状。由于选育过程相对繁琐，在恢复系尚未育成或只有部分 恢复性的情况下，须将不育化的杂交种子与正常杂交种种子按适当比例掺合使用，这就给 种子生产在技术和管理上提出了更高的要求。因此，如何加快不育系的选育速度、简化恢复 系的选育过程，是目前雄性不育化制种技术亟需解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种杂交制种的方法。
[0006] 本发明提供的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京464为不育系，玉米自交系 京464为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种NK718。
[0007] 上述方法中，所述不育系S京464为按照包括如下步骤的方法转育：
[0008]a)玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F1 ;
[0009]b)以所述雄性不育杂交子代F1为母本、与京464回交，得到雄性不育BC1代群体；
[0010]C)以所述雄性不育BC1代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性 不育系。
[0011] 上述方法中，在步骤b)和C)之间，还包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR 核心引物umc2105k3、bnlg240kl、umcl231k4对所述雄性不育BC1代群体单株进行PCR扩增 实现分子鉴定，选取扩增图谱与用同样引物对所述京464PCR扩增得到的图谱相同的雄性 不育BC1代单株；由于40个SSR核心引物中，S京724和京464只在umc2105k3、bnlg240kl、 umcl231k4这三对引物上存在差异，因此只需要检测这三对引物。
[0012] 所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序 列10所示的单链DNA分子组成的引物对；
[0013] 所述核心引物bnlg240kl是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中 序列30所示的单链DNA分子组成的引物对；
[0014] 所述核心引物umcl231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中 序列76所示的单链DNA分子组成的引物对。
[0015] 上述方法中，为了减少工作量，在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还包括表型鉴定 的步骤，所述表型鉴定为选取所述雄性不育BC1代群体中表型与京464 -致的BC1代单株。
[0016] 上述表型与所述玉米京464 -致为表型与玉米京464完全相同或接近；表型具体 为株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和/或果穗性状等。
[0017] 上述方法中，所述不育系S京724为按照包括如下步骤的方法选育：以玉米S型细 胞质雄性不育系MD32CGMCCNo. 8657为供体、玉米自交系京724为受体，进行回交转育，得 到京724的雄性不育系S京724。
[0018] 上述方法中，所述回交次数为3次。
[0019] 上述方法中，所述回交转育包括如下步骤：
[0020] 1)以玉米雄性不育系MD32CGMCCNo. 8657为供体、玉米自交系京724为受体，杂 交，得到雄性不育杂交子代F1;
[0021] 2)以雄性不育杂交子代F1为母本、与京724回交，得到雄性不育BC1代群体；
[0022] 3)以雄性不育BC1代单株为母本、与京724继续回交，得到雄性不育BC2代群体；
[0023] 4)以雄性不育BC2代单株为母本、与京724继续回交，得到京724的雄性不育系S 京 724。
[0024] 上述方法中，在步骤2)和步骤3)之间，还包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性 不育BC1代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在92. 5-95%的雄性不育BC1代单株。
[0025] 上述方法中，所述从所述雄性不育BC1代群体中选取与所述玉米京724遗传相似 度在92. 5-95 %的雄性不育BC1代单株的方法包括如下步骤：用40对SSR核心引物分别对 雄性不育BC1代单株和玉米自交系京724进行PCR扩增，得到SSR谱带，通过比较BC1代单 株和玉米自交系京724的SSR图谱，计算遗传相似度；
[0026] 所述遗传相似度计算公式：[1_(差异等位基因数八2父比较总位点数））]X100%
[0027] 所述差异等位基因数为用SSR核心引物扩增得到的所述雄性不育BC1代单株SSR 谱带带型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；所述比较总位 点数为40。
[0028] 上述40对SSR核心引物中各个引物的序列分别为序列表中序列1-80所示，具体 见实施例的表1。
[0029] 上述方法中，为了减少工作量，在所述分子鉴定前还包括如下步骤：从所述雄性不 育BC1代群体中选取表型与所述玉米京724 -致的雄性不育BC1代单株。
[0030] 上述方法中，在步骤3)和步骤4)之间，还具体包括如下分子鉴定的步骤：从所述 雄性不育BC2代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在98. 75 % -100 %的雄性不育BC2 代单株。
[0031] 所述从所述雄性不育BC2代群体中选取与所述玉米自交系京724遗传相似度在 98. 75% -100%的雄性不育BC2代单株的方法包括如下步骤：用引物A分别对雄性不育BC2 代单株和玉米自交系京724进行PCR扩增，得到SSR谱带，通过比较BC2代单株和玉米自交 系京724的SSR图谱，计算遗传相似度；
[0032] 所述引物A为BC2代单株对应的母本BC1代与京724相比扩增带型不同的SSR引 物；
[0033] 所述遗传相似度计算公式：[1_(差异等位基因数八2父比较总位点数））]X100%
[0034] 所述差异等位基因数为用引物A扩增得到的所述雄性不育BC2代单株SSR谱带带 型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；
[0035] 所述比较总位点数为40。
[0036] 上述方法中，在所述分子鉴定前还具体包括如下步骤：从所述雄性不育BC2代群体 中选取表型与所述玉米京724 -致的雄性不育BC2代单株。
[0037] 上述表型与所述玉米京724 -致为表型与玉米京724完全相同或接近；表型具体 为株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和/或果穗性状等。
[0038] 本发明的另一个目的是提供培育不育系S京464的方法。
[0039] 本发明提供的的方法，包括如下步骤：
[0040]a)玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F1 ;
[0041]b)以所述雄性不育杂交子代F1为母本、与京464回交，得到雄性不育BC1代群体；
[0042]c)以所述雄性不育BC1代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性 不育系；
[0043] 在步骤b)和c)之间，还具体包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR核心引 物umc2105k3、bnlg240kl、umcl231k4对所述雄性不育BC1代群体单株进行PCR扩增，选取扩 增图谱与用同样引物对所述京464进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC1代单株；
[0044] 所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序 列10所示的单链DNA分子组成的引物对；
[0045] 所述核心引物bnlg240kl是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中 序列30所示的单链DNA分子组成的引物对；
[0046] 所述核心引物umcl231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中 序列76所示的单链DNA分子组成的引物对；
[0047] 在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还具体包括表型鉴定的步骤，所述表型鉴定为 选取所述雄性不育BC1代群体中表型与京464 -致的BC1代单株。
[0048] 上述玉米不育系S京464在杂交制种中的应用也是本发明保护的范围。
[0049] 本发明的实验证明，本发明具体有如下优势：
[0050] 1、由于昌7-2等黄改材料是S型细胞质雄性不育系的强恢复系，NK718父本京 2416为黄改种质，因此选择京2416具有强恢复性的S型不育系作为母本京464不育系转育 的供体，节省了选育父本恢复系的繁琐工作；
[0051] 2、选用已获得的与母本京464亲缘关系较近的不育系S京724为供体，结合分子 标记辅助选择技术实现快速转育，仅回交两代即可获得玉米不育系S京464,具有配合力 高、抗倒性好、耐密植等优点；
[0052] 3、选用的S型不育系MD32不育性稳定、花粉败育彻底，在已报道的玉米杂交种雄 性不育化制种研究中未见使用；
[0053] 总之，本发明利用育成的不育系S京464、保持系京464和恢复系京2416进行 NK718三系配套杂交种制种，配制的不育化杂交种NK718种子在产量、抗性及其他农艺性状 上与常规制种方法生产的NK718种子基本相同，且节省了常规制种中母本人工去雄的时间 和成本，消除了由于去雄不及时、影响种子质量的潜在风险。
【具体实施方式】
[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0056] 实施例1、雄性不育系S京724的选育
[0057] -、不育系供体MD32细胞质雄性不育类型的确定
[0058] 1、玉米不育系MD32
[0059] 玉米不育系MD32选育过程：利用构建的X系群体（以Xl132为基础）进行"高大 严"选系，从中选择优良S5高代系与外引杂交种构建新的选系基础群体。在自交后代中发 现不育株，雄穗花药不外露，选择同穗行表型相近的姊妹株对其进行成对授粉。杂交后代全 部表现彻底不育，植株表型也趋向基本一致。遂将该材料命名为玉米雄性不育系MD32。
[0060] 玉米不育系MD32不育性彻底：花药不外露；
[0061] 玉米不育系MD32不育性稳定：在多种遗传背景下，不育性表现彻底；
[0062] 玉米不育系MD32综合性状优良：种子芽势旺盛，出苗力强，幼苗叶鞘色紫色，叶片 宽大，叶色浓绿，株型半紧凑，果穗筒型，粒型半硬粒型，综合抗性好。
[0063] 玉米不育系MD32于2013年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.8657,该植株分类命名为玉米（Zeamays)。
[0064] 2、不育系MD32细胞质雄性不育类型的确定
[0065] 提取玉米不育系MD32幼苗的DNA作为模板，用如下表1的引物进行PCR扩增，得 到扩增产物在Agarose凝胶上，90V电泳1小时30分钟。根据扩增片段图谱鉴别玉米MD32胞质不育类型。
[0066]结果，利用C、T型引物对MD32的DNA进行PCR扩增时，均未检测到扩增产物；利 用S型引物对其进行检测时，PCR产物片段大小为885bp。因此确定MD32为S型细胞质雄 性不育系。
[0067]表1为鉴定胞质类型的引物
[0068]
【权利要求】
1. 一种杂交制种的方法，包括如下步骤：以玉米不育系s京464为不育系，玉米自交系 京464为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种NK718。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述不育系S京464为按照包括如下步骤的方法转育： a) 玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代Fi ; b) 以所述雄性不育杂交子代匕为母本、与京464回交，得到雄性不育代群体； c) 以所述雄性不育代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性不育 系。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于： 在步骤b)和c)之间，还包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR核心引物 umc2105k3、bnlg240kl、umcl231k4对所述雄性不育BQ代群体单株进行PCR扩增，选取扩 增图谱与用同样引物对所述京464进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育代单株； 所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10 所示的单链DNA分子组成的引物对； 所述核心引物bnlg240kl是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列 30所示的单链DNA分子组成的引物对； 所述核心引物umcl231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列 76所示的单链DNA分子组成的引物对。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于： 在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还包括表型鉴定的步骤，所述表型鉴定为选取所述 雄性不育代群体中表型与京464 -致的代单株。
5. 根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于： 所述不育系S京724为按照包括如下步骤的方法选育：以玉米S型细胞质雄性不育系 MD32CGMCC No. 8657为供体、玉米自交系京724为受体，进行回交转育，得到京724的雄性不 育系S京724。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述回交次数为3次； 所述回交转育具体包括如下步骤： 1) 以玉米雄性不育系MD32CGMCC No. 8657为供体、玉米自交系京724为受体，杂交，得 到雄性不育杂交子代匕； 2) 以雄性不育杂交子代匕为母本、与京724回交，得到雄性不育代群体； 3) 以雄性不育代单株为母本、与京724继续回交，得到雄性不育BC2代群体； 4) 以雄性不育BC2代单株为母本、与京724继续回交，得到京724的雄性不育系S京 724。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在步骤2)和步骤3)之间，还包括如 下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在 92. 5-95 %的雄性不育代单株。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在所述分子鉴定前还包括如下步骤：从所 述雄性不育代群体中选取表型与所述玉米京724 -致的雄性不育代单株； 在步骤3)和步骤4)之间，还具体包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育BC2代群 体中选取与所述玉米京724遗传相似度在98. 75% -100%的雄性不育BC2代单株； 在所述分子鉴定前还具体包括如下步骤：从所述雄性不育BC2代群体中选取表型与所 述玉米京724 -致的雄性不育BC2代单株。
9. 一种培育不育系S京464的方法，包括如下步骤： a) 玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代匕； b) 以所述雄性不育杂交子代匕为母本、与京464回交，得到雄性不育代群体； c) 以所述雄性不育代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性不育 系； 在步骤b)和c)之间，还具体包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR核心引物 umc2105k3、bnlg240kl、umcl231k4对所述雄性不育BC；代群体单株进行PCR扩增，选取扩 增图谱与用同样引物对所述京464进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育代单株； 所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10 所示的单链DNA分子组成的引物对； 所述核心引物bnlg240kl是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列 30所示的单链DNA分子组成的引物对； 所述核心引物umcl231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列 76所示的单链DNA分子组成的引物对； 在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还具体包括表型鉴定的步骤，所述表型鉴定为选取 所述雄性不育代群体中表型与京464 -致的代单株。
10. 权利要求1-9所述方法中的所述玉米不育系S京464在杂交制种中的应用。
【文档编号】A01H1/02GK104351037SQ201410493914
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】赵久然, 宋伟, 邢锦丰, 王元东, 段民孝, 刘春阁, 冯培煜, 张如养, 王凤格, 毛振武, 李瑞媛, 王乃顺, 王文广, 张莎莎 申请人:北京市农林科学院