胸膜肺炎放线杆菌血清4型pcr检测用引物及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及胸膜肺炎放线杆菌血清4型检测用引物及其检测试剂盒，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎 放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给 世界养猪业造成了严重的经济损失。该病于1957年由Pattison等首次报道，此后逐渐扩 散，目前已遍布世界各地。我国于1987年首次报道本病的临床病例，近年来发病率日益增 尚。
[0003] 根据荚膜多糖和菌体脂多糖的不同，APP至少可以分成15个血清型（1 一 15)，血 清5型又分为S5a和S5b 2个亚型。不同国家流行的血清型不同。在我国，流行的APP血 清型较多，已分离到1、2、3、4、5、7、8、9和10型。各血清型之间毒力不同，相互之间交叉保 护性也很低。对血清型的准确鉴定，可更针对性地预防和控制猪传染性胸膜肺炎。
[0004] 目前对APP的分型的常用方法有凝集试验和PCR方法。凝集试验需要各个血清型 的特异抗血清，且有的血清型之间有交叉反应，影响结果的准确性，这些都限制了这个方法 在一般实验室的应用。而PCR方法因具有更高的可操作性、敏感性和特异性，应用更广泛。
[0005] 目前已经有针对APP血清1、2、3、5、7、8、10型的PCR检测方法的报道，但国内外尚 无检测APP血清4型的PCR方法。建立能够快速而特异的检测APP血清4型的PCR检测方 法势在必行。
[0006] 因此，基于以上的研究和当前的需求，申请人根据胸膜肺炎放线杆菌血清4型荚 膜多糖合成基因，设计并合成了 1对检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的引物，采用PCR方法 扩增APP CPS4C基因，通过扩增片段的数量和分子量大小，来判定是否含有胸膜肺炎放线杆 菌血清4型，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型。该技 术不仅可从细菌培养物，也能直接从病料中检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型，可用于分子 流行病学调查、疫病诊断及疫苗菌株的筛选。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的目的在于提供胸膜肺炎放线杆菌血清4型检测用引物及其试剂盒。
[0009] 技术方案
[0010] 胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测用引物，包括
[0011] APP-CPS4CF(SEQ ID NO. 1) :5, -GCTAGAAATGGCAAATGAAA-3,；
[0012] APP-CPS4CR(SEQ ID NO. 2) :5' -CTGGACGAGTAATAAATGAA-3' ；
[0013] 该引物能从胸膜肺炎放线杆菌血清4型菌株提取的基因组DNA中扩增出653bp DNA片段。该引物能在制备胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测试剂盒中得到应用。
[0014] 本发明还提供了一种用于检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的试剂盒，该试剂盒含 有上述引物 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。
[0015] 具体的，该试剂盒包括：
[0016] (I)PCR 反应液：
[0017] 2\PCR Mix i2.5liL ?〇μΜ SEQ ID ΝΟ.? 1,0μL_. ΙΟμΜ SEQ ID ΝΟ.2 Ι.ΟμL 无菌超纯水 8.5μΙ_.
[0018] 混匀后置-20 °C保存。
[0019] ⑵阴性对照：无菌超纯水，置_20°C保存。
[0020] (3)阳性对照：胸膜肺炎放线杆菌血清4型参考菌株M62基因组DNA，置-20°C保 存。
[0021] 试剂盒用于检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的方法包括：
[0022] (1)样品处理
[0023] 待检细菌样品处理：取ImL待检细菌培养液于I. 5mLEP管中，12000rpm，离 心5min，弃上清，沉淀用IOOyL裂解缓冲液重悬，其中裂解缓冲液为：0.0005 %吐 温-20, 0· 50g/L 蛋白酶 K 和 0· lmol/L Tris，ρΗ8· 5 ;
[0024] 或者肺组织样品处理：取Ig疑似感染猪肺脏组织，加入1ml PBS制成悬液； 2000rpm，离心2min，取500 μ L上清液于I. 5mLEP管中，12000rpm,离心5min，弃上清，沉淀 用IOOuL上述裂解缓冲液重悬；
[0025] (2)基因组DNA的提取：将上述用100 μ L裂解缓冲液重悬的液体置57°C水浴Ih 后，100°C作用5min，再12000rpm离心10min，上清即为基因组DNA，-20°C冻存备用；
[0026] (3)PCR 扩增：在 25 yL 反应体系中加入 2XPCR MIX 12. 5 yL，SEQ ID NO. 1 I. 0 μ L，SEQ ID NO. 2 I. 0 μ L，DNA 2· 0 μ L，无菌超纯水 8· 5 μ L ;
[0027] ?0?反应条件：951€51^11预变性后，941€3〇8,54.8 1€3〇8,721€458,30个循环后， 72°C延伸 IOmin ;
[0028] (4)判定胸膜肺炎放线杆菌血清4型的方法：
[0029] 被检样品电泳出现一条与阳性对照大小相同的扩增片段653bp，则判定为胸膜肺 炎放线杆菌血清4型阳性；
[0030] 被检样品电泳不出现扩增片段653bp，则判定为胸膜肺炎放线杆菌血清4型阴性。
[0031] 有益效果
[0032] 本发明根据GenBank上公布的胸膜肺炎放线杆菌4型参考菌株M62的全基因组序 列中找到与血清分型相关的7个荚膜多糖生物合成相关基因和10个菌体脂多糖0抗原生 物合成基因簇基因，在NCBI网站上进行大量序列比对，找到了 1个与其它基因型菌株序列 完全不相同的基因，即APP CPS4C基因。
[0033] 以APP CPS4C基因序列为靶标，在其保守区设计引物，经过大量筛选设计了本发明 的引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,通过多次优化PCR反应 条件，建立了胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测方法。该对引物从胸膜肺炎放线杆菌血 清4型细菌培养液和感染胸膜肺炎放线杆菌血清4型的病料提取的基因组DNA中都可扩增 出653bp DNA片段。
[0034] 本发明的检测引物和试剂盒具有特异性高的特征，检测其他15种APP参考菌株、 对猪致病的主要细菌（副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、猪葡萄球 菌、猪沙门氏菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体）和病毒（猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病 毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流感病毒）以及健康猪肺组织的基因组DNA或cDNA都 为阴性。
[0035] 本发明的检测引物和试剂盒具有灵敏度高的特征，对APP血清4型的检测灵敏度 可达到 100CFU/mL。
[0036] 本发明的检测引物和试剂盒为APP分子流行病学调查、疫病诊断及疫苗菌株的筛 选提供有效的工具。
【附图说明】
[0037] 图1是50°C~65°C梯度PCR产物电泳结果，其中M :DL2000 DNA Marker ;退火温度 I. 50°C ；2. 50. 7°C ；3. 51. 5°C ；4. 53〇C ；5. 54. 8°C ；6. 56. 6°C ；7. 58. 4°C ；8. 60. 2°C ； 9. 62〇C ；10. 63. 5°C；11. 64. 2°C ；12. 65〇C
[0038] 图2是退火温度为51. 5 °C PCR产物电泳结果，其中M :DL2000 DNA Marker ; 1. SI ；2. S2 ；3. S3 ；4. S4 ；5. S5a ；6. S5b ；7. S6 ；8. S7 ；9. S8 ；10. S9 ；11. SlO ；12. Sll ；13. S12 ； 14. S13 ；15. S14 ；16. S15 ；17. dH20
[0039] 图3是退火温度为53°C PCR产物电泳结果，其中M :DL2000 DNA Marker ;I. SI ; 2. S2 ；3. S3 ；4. S4 ；5. S5a ；6. S5b -J. S6 ；8. S7 ；9. S8 ；10. S9 ；11. SlO ；12. Sll ；13. S12 ； 14. S13 ；15. S14 ；16. S15 ；17. dH20
[0040] 图4是退火温度为54. 8 °C PCR产物电泳结果，其中M :DL2000 DNA Marker ; I. SI ；2. S2 ；3. S3 ；4. S4 ；5. S5a ；6. S5b ；7. S6 ；8. S7 ；9. S8 ；10. S9 ；11. SlO ；12. Sll ；13. S12 ； 14. S13 ；15. S14 ；16. S15 ；17. dH20
[0041] 图5是特异性试验结果，其中M :DL2000DNA Marker ;1. APP S4 ;2.副猪嗜血杆菌； 3. 猪链球菌；4.猪肺疫巴氏杆菌；5.猪丹毒杆菌；6.猪葡萄球菌；7.猪沙门氏菌；8.猪大 肠杆菌；9.猪肺炎支原体；10.猪瘟病毒；11.猪繁殖与呼吸系统综合征病毒；12.猪圆环病 毒；13.猪伪狂犬病毒；14.猪流感病毒；15.健康猪肺组织
[0042] 图 6 是敏感性试验结果，其中 M :DL2000 DNA Marker ;L IO6CFlVmL ;2· IO5CFlVmL ; 3. IO4CFlVmL ;4· IO3CFlVmL ;5· IO2CFlVmL ;6· IO1CFlVmL ;7· 10°CFU/mL
【具体实施方式】
[0043] 下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
[0044] 实施例1
[0045] 1、目的基因的选择
[0046] 根据GenBank上公布的胸膜肺炎放线杆菌4型参考菌株M62的全基因组序列（NZ_ AD0F01000000)，从2271179bp、2, 197个gene中找到与血清分型相关的荚膜多糖生物合成 相关基因（共7个，包括CPS4C、CPS4B、CPS4A、cpxD、cpxC、cpxB、cpxA)和菌体脂多糖O抗 原生物合成基因簇基因（共 10 个，包括 erpA、wzz、rmlB、rmlA、rmlD、rmlC、wzx、wzy、wbap、 rpsU)，在NCBI网站上进行大量序列比对，找到了 1个与其它基因型菌株序列完全不相同 的基因，即CPS4C基因，此基因全长1044bp。
[0047] 2、引物的设计和合成
[0048] 根据胸膜肺炎放线杆菌血清4型CPS4C基因的核苷酸序列，采用Primer 5. 0软件 设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列：
[0049] CPS4C基因正向引物（APP-CPS4CF)的序列为SEQ ID NO. 1，CPS4C基因反向引物 (APP-CPS4CR)的序列为SEQ ID NO. 2,具体序列的组成如下：
[0050] SEQ ID NO. 1 :5' -GCTAGAAATGGCAAATGAAA-3'
[0051] SEQ ID NO. 2 :5' -CTGGACGAGTAATAAATGAA-3'
[0052] 根据上述核苷酸序列信息合成CPS4C基因正向引物（APP-CPS4CF)和反向引物 (APP-CPS4CR)。将上述引物各配置成浓度为10 μ M的溶液，备用。
[0053] 3、PCR反应条件的确定
[0054] PCR 反应体系为 25 μ L :2 XPCR Mix 12. 5 μ L，10 μ M SEQ ID NO. I I. 0 μ L，10 μ M SEQ ID NO. 2 L 0 μ L，DNA 模板 2· 0 μ L，灭菌超纯水 8· 5 μ L。
[0055] 在PCR仪上进行梯度PCR，以确定最佳退火温度。
[0056] 梯度PCR的反应程序为95°C预变性5min ;94°C变性30S，12个反应管分别以50°C、 50. 7Γ、51· 5Γ、53Γ、54· 8Γ、56· 6Γ、58· 4Γ、60· 2Γ、62Γ、63· 5Γ、64· 2Γ、65Γ为退火 温度，退火时间30S，72