°C延伸45S，进行30个循环；最后72°C延伸10min。PCR扩增结束后， 取15 μ L扩增产物于1. 2%琼脂糖凝胶，120V电泳30min，用凝胶成像系统观察并成像分 析。电泳结果显示：以前5个温度为退火温度，目的条带较亮，且无非特异条带，见图1。
[0057] 为检测引物是否特异，以APP其它15种血清型参考株的基因组DNA为模板进 行PCR(邱索平，何孔旺，刘中勇，林志雄，陈文.猪胸膜肺炎放线杆菌PCR快速分型 系统的建立及应用.2011,28(8):41-45 ;Stine G. Jessing, 0ystein. Angen, and Tomas J. Inzana. Evaluation of a multiplex PCR test for simultaneous identification and serotyping of Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes 2, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41 (9) :4095 - 4100)。具体血清型和参考菌株名称见表 1。
[0058] 表1 APP血清型及参考菌株名称
[0059]
[0060] 首先选择51. 5°C为退火温度进行PCR。电泳结果显示：除APP血清10型外都有 非特异条带，见图2。
[0061] 为提高引物的特异性，将退火温度提高到53°C进行PCR。电泳结果显示：提高了退 火温度，情况有所好转，APP血清3、10、12型无非特异条带，别的型的非特异条带亮度也有 所下降，见图3。
[0062] 进一步将退火温度提高到54. 8°C进行PCR。电泳结果显示：除血清4型外，别的血 清型都没出现任何条带，见图4。
[0063] 根据以上结果，最终确定PCR的反应条件为：95°C预变性5min ;94°C变性30S， 54. 8°C退火30S，72°C延伸45S，进行30个循环；然后，72°C延伸lOmin。
[0064] 4、一种胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测试剂盒，50次/盒，按下表组装：
[0065] 表2试剂盒组成
[0067] (1)阴性对照样品的制备
[0068] 取灭菌超纯水，置-20 °C冰箱保存。
[0069] (2)阳性对照样品的制备
[0070] 将猪胸膜肺炎放线杆菌血清4型参考菌株M62在含NAD的TSB培养液（购于美国 OXIDE公司）中37°C培养12~16小时，取ImL培养液于I. 5mLEP管中，12000rpm，离心 5min，弃上清，沉淀用IOOyL裂解缓冲液（0.0005%吐温-20,0.5g/L蛋白酶K和0. lmol/L Tris，pH8. 5)重悬，57°C作用lh，最后100°C水浴5min，再12000rpm离心10min，取上清作 为阳性对照样品。
[0071] (3) PCR反应液的制备
[0072] 按下列配方制备PCR反应液
[0073] 2xPCR Mix 12·5μ1_ 10ΜΜ SEQ ID NO.1 1.0PL 1〇μΜ SEQ ID N0.2 1 OmL 无菌DEPC水 8 5μL_
[0074] 混匀后_20°C保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。
[0075] 5、检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的方法，包括：
[0076] (1)样品处理
[0077] 待检细菌样品处理：取ImL待检细菌培养液于I. 5mLEP管中，12000rpm，离 心5min，弃上清，沉淀用IOOyL裂解缓冲液重悬，其中裂解缓冲液为：0.0005 %吐 温-20, 0· 50g/L 蛋白酶 K 和 0· lmol/L Tris，ρΗ8· 5 ;
[0078] 或者肺组织样品处理：取Ig疑似感染猪肺脏组织，加入1ml PBS制成悬液； 2000rpm，离心2min，取500 μ L上清液于I. 5mLEP管中，12000rpm,离心5min，弃上清，沉淀 用IOOuL上述裂解缓冲液重悬；
[0079] (2)基因组DNA的提取：将上述用100 μ L裂解缓冲液重悬的液体置57°C水浴Ih 后，100°C作用5min，再12000rpm离心10min，上清即为基因组DNA，-20°C冻存备用；
[0080] (3)PCR 扩增：在 25 yL 反应体系中加入 2XPCR MIX 12. 5 yL，SEQ ID NO. 1 I. 0 μ L，SEQ ID NO. 2 I. 0 μ L，DNA 2· 0 μ L，无菌超纯水 8· 5 μ L ;
[0081] ?0?反应条件：951€51^11预变性后，941€3〇8,54.8 1€3〇8,721€458,30个循环后， 72°C延伸 IOmin ;
[0082] (4)判定胸膜肺炎放线杆菌血清4型的方法：
[0083] 被检样品电泳出现一条与阳性对照大小相同的扩增片段653bp，则判定为胸膜肺 炎放线杆菌血清4型阳性；
[0084] 被检样品电泳不出现扩增片段653bp，则判定为胸膜肺炎放线杆菌血清4型阴性。
[0085] 6、特异性试验
[0086] 用本发明胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测试剂盒检测其他15种胸膜肺炎放 线杆菌参考菌株（具体血清型和参考菌株名称见表1)的基因组DNA，结果均为阴性，见图 4〇
[0087] 用本发明胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测试剂盒检测对猪致病的主要细菌 (副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、猪葡萄球菌、猪沙门氏菌、猪大肠 杆菌、猪肺炎支原体）和病毒（猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬 病毒、猪流感病毒）以及健康猪肺组织的基因组DNA或cDNA，结果均为阴性，见图5。各主 要细菌和病毒的参考文献如下：
[0088] 副猪嗜血杆菌：王占伟，刘茂军，王丽，邵国青.副猪嗜血杆菌对豚鼠和小鼠的 致病力研究·中国兽医杂志，2015, 5:80-82
[0089] 猪链球菌、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌：倪艳秀，何孔旺，王继春， 何家惠，还红华，吕立新，陆承平，姚火春.猪链球菌2型的PCR快速检测.中国兽医学 报，2002, 22(5) :474-476
[0090] 猪沙门氏菌：殷月兰，潘志明，孟书霞，黄金林，焦新安.单抗竞争ELISA检测 猪沙门氏菌感染方法的建立与应用.中国预防兽医学报，2003, 25(1) : 65-68, 76
[0091] 猪大肠杆菌：吕立新，何孔旺，还红华，邵国青，倪艳秀，王继春，刘冬霞.优 化致仔猪水肿病大肠杆菌培养物方法的研究.江苏农业科学，2003, 1:53-55
[0092] 猪肺炎支原体：贾广乐，刘茂军，张映，邵国青，聂向庭.猪肺炎支原体168株 黏附因子基因的克隆与表达.中国人兽共患病杂志，2004, 20(11) :938-942
[0093] 猪瘟病毒：毛立，李文良，李彬，江杰元.猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检 测方法的建立和临床应用.江苏农业学报，2012, 28(4) :783-786
[0094] 猪繁殖与呼吸综合征病毒：李彬，毛立，何孔旺，刘彦玲，温立斌，俞正 玉，茅爱华，王小敏，张雪寒，郭容利，周俊明，倪艳秀，吕立新.猪繁殖与呼吸综 合征病毒（PRRSV)江苏分离株NJGC 0RF5基因的克隆及遗传变异分析.江苏农业学 报，2011，27(4) :775-781
[0095] 猪圆环病毒：王小敏，何孔旺，汪伟，周忠涛，杨光远，茅爱华，俞正 玉，倪艳秀.猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析.农业科学与技 术，2014, 15 (11) : 1860-1864, 1887
[0096] 猪伪狂犬病毒：张雪寒，何孔旺，缪文凯，茅爱华，俞正玉.Taqman探针实时定 量PCR检测猪伪狂犬病毒.江苏农业学报，2008, 24 (4) : 440-443
[0097] 猪流感病毒：白昀，冯志新，甘源，刘占军，张旭，韦艳娜，马庆红，邵 国青.一株HlNl亚型猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析.中国预防兽医学 报，2013, 35(7) :521-525
[0098] 结果表明本发明胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测试剂盒具有良好的特异性， 可准确判定样品中是否存在胸膜肺炎放线杆菌4型。
[0099] 7、敏感性试验
[0100] 将血清4型参考菌株M62液体培养物计数后，调整细菌浓度为106CFU/mL，然后进 行10倍比稀释，分别提取细菌基因组DNA，进行敏感性试验。具体地，按照本发明的方法， PCR反应体系中加入2 μ L的DNA，利用SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2进行扩增，结果最小检 测量为l〇〇CFU/mL，灵敏度高，见图6。
【主权项】
1. 胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测用引物，包括 APP-CPS4CF(SEQIDNO. 1) :5' -GCTAGAAATGGCAAATGAAA-3' ； APP-CPS4CR(SEQIDNO. 2) :5' -CTGGACGAGTAATAAATGAA-3' ； 该引物能从胸膜肺炎放线杆菌血清4型菌株提取的基因组DM中扩增出653bpDM片 段。2. 权利要求1所述的引物在制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的试剂盒中的应 用。3. -种用于检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1所述 的引物。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括： (1) 阴性对照：无菌超纯水，置-20°C保存； (2) 阳性对照：胸膜肺炎放线杆菌血清4型参考菌株M62基因组DNA，置-20°C保存； (3)PCR反应液： 2、PC民Mix 12.5.uL ΙΟμΜSEQIDNO.l 1,0,uL !0μΜ化Q1DN0.2 l.OyL 无菌超纯水 8.5μΙ_ 混匀后置-2〇υ保存。5. 如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒用于检测胸膜肺炎放线杆菌血 清4型的方法包括： (1) 样品处理 待检细菌样品处理：取1血待检细菌培养液于1. 5mLEP管中，12000巧m，离屯、5min，弃 上清，沉淀用100μL裂解缓冲液重悬，其中裂解缓冲液为：0. 0005%吐溫-20, 0. 50g/L蛋 白酶K和 0.Imol/LTris，P册.5 ; 或者肺组织样品处理：取Ig疑似感染猪肺脏组织，加入1mlPBS制成悬液；2000巧m，离 屯、2min，取500μL上清液于1. 5mLEP管中，12000巧m，离屯、5min，弃上清，沉淀用lOOuL上 述裂解缓冲液重悬； (2) 基因组DNA的提取：将上述用100μL裂解缓冲液重悬的液体置57°C水浴比后， 100°C作用5min，再12000巧m离屯、lOmin，上清即为基因组DNA，-20°C冻存备用； 做PCR扩增：在 25μΙ反应体系中加入 2XPCRMIX12. 5yL，沈QIDNO. 11.0yL，WQ IDNO. 21. 0μLDM2. 0μL无菌超纯水8. 5μL; PCR反应条件：95°C5min预变性后，94°C30s，54.8°C30s，72°C453,30个循环后，721： 延伸lOmin; (4) 判定胸膜肺炎放线杆菌血清4型的方法： 被检样品电泳出现一条与阳性对照大小相同的扩增片段653bp，则判定为胸膜肺炎放 线杆菌血清4型阳性； 被检样品电泳不出现扩增片段653bp，则判定为胸膜肺炎放线杆菌血清4型阴性。
【专利摘要】本发明提供了胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测用引物及其试剂盒，属于生物技术领域。以基因组DNA为模板，利用所提供引物进行PCR扩增，反应结束后根据扩增片段的数量和分子量大小判定结果。本发明的引物特异性好，检测方法快速简单，灵敏度高，不仅可从细菌培养液，也能直接从病料中检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型，可用于胸膜肺炎放线杆菌血清4型的分子流行病学调查、疫病诊断及疫苗菌株的筛选。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105400881
【申请号】CN201510925222
【发明人】倪艳秀, 何孔旺, 周俊明, 祝昊丹, 孙学飞, 吕立新, 俞正玉, 茅爱华, 张雪寒, 温立斌, 李彬, 郭容利, 王小敏, 汪伟, 胡屹屹
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月14日