专利名称:多系祖细胞分化为软骨细胞的制作方法
技术领域：
本文涉及软骨细胞，更具体而言，本文涉及将来自人脐带血的多系祖细胞(MLPC) 分化为软骨细胞，并从MLPC克隆系(clonal MLPC line)制备软骨细胞克隆群。
背景
已在多个来源中鉴别到骨髓清除性治疗后能造血重建的祖细胞，这些来源包括骨 髓、脐带血和胎盘血，以及用干细胞动员剂量的粒细胞集落刺激因子治疗的对象的外周血。 这些细胞通常称为造血干细胞(HSC)，它们是通过细胞表面糖蛋白如⑶34和⑶133的存在 而被鉴定的。作为“骨髓移植”的一部分，HSC仅占总细胞群中非常小的比例，并被认为是该 治疗中负责恢复接受清髓剂量的化疗或放疗的患者的造血功能的救命的治疗部分。经由骨 髓移植的干细胞治疗已成为大量难治疗的白血病和遗传性血液疾病的标准治疗。
最近的研究提示，骨髓中存在能自我更新和分化成除血细胞以外的多种不 同组织类型的更原始的细胞群。发现这些多能细胞在成人骨髓的⑶34-塑性-黏附 细胞群中为微量组分，并被不同地称为间充质干细胞(MSC) (Pittenger等，Science 284 143-147(1999))、或多能成人祖细胞(MAPC) (Furcht, L. T.等，美国专利公开号 20040107453 Al)。MSC细胞不具有单一的特定鉴定标记，但已显示对多个标记呈阳性，包括 ⑶29、⑶90、⑶105和⑶73，并对其它标记呈阴性，包括⑶14、⑶3和⑶34。各个研究组已报 道，可将MSC细胞分化成肌细胞、神经元、胰腺β细胞、肝细胞、骨细胞和结缔组织。其它研 究组(Wernet等，美国专利公开号20020164794Α1)已揭示了来自脐带血内CD457CD34—群 的具有多能性的未受限制的体干细胞(USSC)。
发明内容
本文基于以下发现可通过诱导人胎血的多系祖细胞(MLPC)的分化而获得软骨 细胞。如本文所述，基于其免疫表型特征、基因表达特征、形态学和不同的生长模式，区分胎 血MLPC与来自骨髓的MSC、HSC和USSC。本文提供由个体细胞发育单型克隆细胞系的方法， 以及由这些克隆细胞系产生的软骨细胞克隆群。本文还提供低温保存MLPC(如，用于脐带 血库)和软骨细胞的方法。
一方面，本文描述了一种组合物，该组合物含有纯化的人胎血多系祖细胞(MLPC) 群或克隆的人胎血MLPC系和有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培 养基，其中，所述MLPC为⑶9阳性，⑶45阴性，⑶34阴性，SSEA-4阴性。所述MLPC还可以呈 CD13、CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105 阳性，且还可呈 CD10、CD41、Stro-I 和 SSEA-3 阴性。 在一些实施方式中，所述 MLPC 还呈 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、 CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白 _A、干细胞因子和 HLA-DR 阴性。所述分化培养基可含有抗坏血酸、地塞米松、和转化生长因子β 3(TGF-i3 3)。所述组合物还可含有生长基底。该生长基底可以包涂有胶原。例如，生长基底可以是胶原包涂的培 养设备或胶原包涂的三维支架(scaffold)。该三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形成。
本文还描述了一种制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法。该方法包括提供胶原 包涂的二维或三维生长基底，该基底容纳纯化的MLPC群或克隆的MLPC系；和用能有效诱导 所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基培育所述纯化的MLPC群或克隆的 MLPC系，其中，所述MLPC呈⑶9阳性、⑶45阴性、⑶34阴性和SSEA-4阴性。所述分化培养 基可含有抗坏血酸、地塞米松和TGF-β 3。该生长基底可以包涂有胶原。例如，生长基底可 以是胶原包涂的培养设备或胶原包涂的三维支架。该三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形 成。所述方法还可包括测试所述具有软骨细胞表型的细胞的胞内S0X9、胞内II型胶原、胞 内聚集蛋白聚糖(aggrecan)和TGF-β受体的细胞表面表达。
另一方面，本文描述了一种由人胎血制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法。该 方法包括使人胎血样品与含有葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD15抗体和抗CD9抗体的 组合物接触；使所述样品分隔成黏附相和上清相；从上清相中回收细胞；通过与固体基底 黏附而从回收的细胞中纯化MLPC，其中，所述MLPC呈⑶9阳性和⑶45阳性；培育所述MLPC， 使其获得成纤维细胞的形态学；将具有成纤维细胞形态学的MLPC或其后代加载到二维或 三维的胶原包涂的生长基底上，形成加载的生长基底；和用能有效诱导所述MLPC分化成具 有软骨细胞表型的细胞的分化培养基培养所述加载的生长基底。该方法还可包括，在加载 所述生长基底前，由具有成纤维细胞形态学的所述MLPC制备克隆的MLPC系。
又一方面，本文描述了克隆的软骨细胞群和含有这些克隆的群的组合物。在一个 实施例中，组合物含有克隆的成骨细胞群和培养基。克隆的成骨细胞群还可容纳于三维支 架(如包涂胶原的三维支架)内。所述三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形成。这些组合 物还可含有低温保存剂(如二甲亚砜(DMSO)，例如1-10%的DMS0)。低温保存剂可以是胎 牛血清、人血清、或者人血清白蛋白与一种或多种以下成分的组合DMS0、海藻糖和葡聚糖。 例如，低温保存剂可以是人血清、DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMS0。
本文还描述了一种制品，该制品含有克隆的软骨细胞群。该克隆群可容纳于容器 (如小瓶或袋)内。该容器还可含有低温保存剂。该克隆群可以单层生长，并以悬浮方式低 温保存，或者可容纳于三维支架内。该三维支架可容纳于多孔板的孔内。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域：
的普通技术人员常规理解的含义相同。虽然可采用与本文所述的方法和材料类似或等价的 方法和材料实施本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申 请、专利和其它参考文献的全文都以引用的方式纳入本文。出现冲突时，以本说明书(包括 定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。
依据下文详细的描述以及权利要求
书，本发明的其它特征和优点将更显而易见。
图1是从胎血纯化MLPC的细胞分离程序的示意图。
图2A-2D是描述发育的MLPC的形态学的显微照片。图2A显示从脐带血分离的 MLPC的早期培养物，证明了所述细胞处于白细胞形态学期。图2B显示开始由白细胞形态
权利要求
软骨细胞的克隆群。
2.一种组合物，该组合物含有权利要求
1所述的软骨细胞克隆群和培养基。
3.如权利要求
2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有低温保存剂。
4.如权利要求
3所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是二甲亚砜(DMS0)。
5.如权利要求
4所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是1-10%DMS0。
6.如权利要求
3所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是胎牛血清，人血清，或 人血清白蛋白与DMS0、海藻糖和葡聚糖中的一种或多种的组合。
7.如权利要求
3所述的组合物，其特征在于，所述低温保存剂是人血清、DMS0和海藻 糖；或者是胎牛血清和DMS0。
8.如权利要求
3所述的组合物，其特征在于，所述软骨细胞的克隆群容纳于胶原包涂 的培养设备内。
9.一种制品，其含有权利要求
1所述的克隆群。
10.如权利要求
9所述的制品，其特征在于，所述克隆群容纳于容器内。
11.如权利要求
10所述的制品，其特征在于，所述容器是小瓶或袋。
12.如权利要求
10所述的制品，其特征在于，所述容器还含有低温保存剂。
13.如权利要求
9所述的制品，其特征在于，所述克隆群容纳于胶原包涂的培养设备内。
14.一种组合物，其含有人胎血多系祖细胞(MLPC)的纯化群或人胎血MLPC克隆系和有 效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基，其中所述MLPC呈CD9阳 性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性。
15.如权利要求
14所述的组合物，其特征在于，所述分化培养基含有抗坏血酸、地塞米 松和 TGF-3 3。
16.如权利要求
14所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有生长基底。
17.如权利要求
16所述的组合物，其特征在于，所述生长基底包涂有胶原。
18.如权利要求
17所述的组合物，其特征在于，所述生长基底是胶原包涂的培养设备。
19.如权利要求
14所述的组合物，其特征在于，所述MLPC还呈⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、 CD90 和 CD105 阳性，和呈 CD10、CD41、Stro_l 和 SSEA-3 阴性。
20.如权利要求
19所述的组合物，其特征在于，所述MLPC还呈⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、 CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋 白-A、干细胞因子和HLA-DR阴性。
21.一种制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法，所述方法包括a)提供胶原包涂的 二维生长基底，该基底容纳纯化的MLPC群或MLPC克隆系；和用能有效诱导所述MLPC分化 成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基培育所述纯化的MLPC群或MLPC克隆系，其中，所 述MLPC呈CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性。
22.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述分化培养基含有抗坏血酸、地塞米松 禾口 TGF-3 3。
23.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述生长基底是胶原包涂的培养设备。
24.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测试所述具有软骨细胞 表型的细胞的胞内聚集蛋白聚糖、胞内II型胶原、胞内S0X9或细胞表面的TGF-0受体。
25.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述MLPC还呈⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、 CD90 和 CD105 阳性，和呈 CD10、CD41、Stro_l 和 SSEA-3 阴性。
26.如权利要求
25所述的方法，其特征在于，所述MLPC还呈⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、 CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋 白-A、干细胞因子和HLA-DR阴性。
27.一种从人胎血制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法，该方法包括a)使人胎血样品与一组合物接触，所述组合物含有i)葡聚糖；ii)抗血型糖蛋白A抗体；iii)抗CD15抗体；和iv)抗CD9抗体；b)使所述样品分配成凝集相和上清相；c)从所述上清相中回收细胞；d)通过粘附到固相基底上而从回收的细胞中纯化MLPC，其中，所述MLPC呈⑶9阳性和 CD45阳性；e)培养所述MLPC细胞，使其获得成纤维细胞表型；f)将所述具有成纤维细胞表型的MLPC或其后代加载到二维胶原包涂的生长基底上， 形成加载的生长基底；和g)用能有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的分化培养基培养所述加载的生长基底。
28.如权利要求
27所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在加载所述生长基底 前，从所述具有成纤维细胞形态的MLPC中制备MLPC的克隆系。
专利摘要
本发明描述了具有广谱跨分化能力的胎血多系祖细胞，以及将这些祖细胞分化成软骨细胞的方法。
文档编号C12N5/077GKCN101835479SQ200880100283
公开日2010年9月15日 申请日期2008年7月25日
发明者D·P·柯林斯 申请人:佰欧益有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan