肝祖细胞及其应用的制作方法

专利名称：肝祖细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肝祖细胞的技术，尤指一种肝祖细胞的制备方法及其应用。
背景技术：
慢性肝病是一种世界性的严重健康问题。B型肝炎、C型肝炎、酒精及某些化学药物能够导致肝脏纤维化及肝硬化，并最终导致肝衰竭，目前肝脏移植仍然是肝衰竭患者的惟一选择，然而肝脏移植常受阻于缺乏捐赠者，同时，肝脏移植并不适合某些疾病，例如某些感染及某些类型的癌症，所以需要一些替代性的方法来治疗肝病及其相关的问题。

发明内容
本发明是基于一个意料之外的发现，即多功能肝祖细胞能够用以治疗肝病及其相关问题。本发明包含一种取得肝祖细胞的方法。其方法包括取得培养的多功能动物细胞， 将此多功能动物细胞与肝脏组织在培养液中培养一段时间，并收集此共培养的多功能动物细胞及其后代以取得肝祖细胞。其中，此多功能动物细胞对由⑶29、⑶44、⑶49b、⑶49d、 ⑶73、⑶90、⑶105、⑶13和HLA-DR所组成的群组中的一种或多种标记呈阳性反应，并对由 ⑶14、⑶34和⑶45所组成的群组中的一种或多种标记呈阴性反应。此多功能动物细胞可以是取自第一种实验对象的脐带的华顿氏胶(Wharton’ s jelly)，此第一种实验对象可以是人类或是一种非人类的哺乳类动物，比如猫、狗、猪或马等，此共培养的肝脏组织可以是一种受损伤的肝脏组织，此受损伤的肝脏组织是取自第二种实验对象，第二种实验对象可以是一种人类或非人类的哺乳类动物，将取自第二种实验对象的肝脏组织置于一种具有肝毒性的反应物中，造成此肝脏组织的损伤，第一种实验对象及第二种实验对象可以是相同或不同的动物，具肝脏毒性的反应物可以是一种机械的外力或一种生理的事件，比如局部缺血、发炎反应或是一种化学药剂，比如硫乙酰胺、四氯甲烷或是酒精，肝脏组织亦可以取自暴露于肝毒性因素的活体组织切片，肝祖细胞可以表达一种或多种选自CK18、白蛋白、色氨酸2，3双加氧酶(ΤΟ)、α-胎儿蛋白(AFP)、CYP7A1、 nan0g、0ct4、ckit、肝脏生长因子(HGF)和金属蛋白酶(MMP)群组中的基因表达，在一实施例中，多功能动物细胞对肝脏生长因子或金属蛋白酶呈阳性反应。本发明的另一目的在于制备肝祖细胞，制备的方法如上所述。本发明的另一目的包含制备被培养的多功能动物细胞及肝脏细胞的组合物，该多功能动物细胞是对选自由 CD29、CD44、CD49b、CD49b、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 的群组中的一种或多种标记呈阳性反应，并对选自由⑶14、⑶34和⑶45群组中的一种或多种标记呈阴性反应，肝脏组织可以是在体外培养的组织，在一实施例中肝脏组织是一种受肝毒性试剂损伤的肝脏组织，在一实施例中，多功能动物细胞是取自于第一种实验对象，比如人类脐带的华顿氏胶。本发明包含一种治疗肝脏疾病，例如纤维化或肝硬化的方法，此治疗方法包含鉴定出具有肝脏疾病或有肝脏疾病风险的实验对象，并对此实验对象使用第一制备物或第二制备物，该第一制备物含有上述的被培养的多功能动物细胞，该第二制备物含有上述的肝祖细胞，该多功能动物细胞或该肝祖细胞能够分化成表达白蛋白的细胞，肝祖细胞的制备方法如上所述。本发明并包含一种提高在实验对象肝脏中白蛋白、金属蛋白酶或肝脏生长因子浓度的方法，本方法包含在实验对象中使用有效剂量的(一)第一制备物或(二)第二制备物，该第一制备物含有上述被培养的多功能动物细胞，该第二制备物含有上述的肝祖细胞， 肝祖细胞的制备方法已如上述。在本发明中，肝祖细胞具有下列第一特征及第二特征，第一特征是能够表达一种或多种肝脏特异性(专一性)的基因，该基因由CK18、白蛋白、色氨酸2，3双加氧酶、α-胎儿蛋白和CYP7A1所组成，第二种特征是具有发展成为干细胞的潜力，相较于取自于脐带的华顿氏胶的多功能动物细胞以及华顿氏胶干细胞，肝祖细胞具有较低的nanog、oct4、和 ckit的干细胞基因表达量。以下，本发明的实施例将结合附图详细描述，从本发明的描述、附图及权利要求书，本发明的技术内容、特征及优点将显而易见。


图 1-1 至图 1-13 是针对 CD13 (IA)、CD14(1B)、CD29(1C)、CD 34 (ID)、CD44(1E)、 CD45(1F)、CD49b(lG)、CD49d(lH)、CD73(1I)、CD90(1J)、CD105(1K)、HLA-DR(IL)禾口 IgGh-FITC (1M，作为阳性对照)以抗体进行免疫组织化学染色的结果；图1-14是华顿氏胶干细胞的代表性形态照片，左为低密度培养，右为高密度培养，比例线(Bar) = 500 μ m。图2-1及图2-2分别为照片显示以RT-PCR及凝胶电泳测量肝脏特异性(特异性) 基因表达(图2-1)及表格显示半定量RT-PCR试验结果(图2- ，其以肝脏特异性基因表达作为华顿氏胶干细胞在与硫乙酰胺损伤的肝脏组织共同培养0、2、4天后的肝细胞分化程度的测量尺度。图3-1至图3-4为以苏木色素及曙红染料染色的肝脏切片的照片；图3-1是正常老鼠肝脏切片；图3-2是纤维化肝脏切片取自于注射硫乙酰胺200mg/kg的老鼠，每3天注射一次，共60天；图3-3是华顿氏胶干细胞群组肝脏切片，在华顿氏胶干细胞移殖后21天取得；图3-3是伪治疗群组肝脏切片，在注射食盐水后21天取得；比例线(Bar)= 50 μ m0图4-1至图4-8为以麻省三色(Masson，s trichrome)染色的肝脏切片的照片；图4-1是正常老鼠肝脏切片；图4-2是肝脏纤维化老鼠肝脏切片；图4-3是华顿氏胶干细胞群组肝脏切片，在华顿氏胶干细胞移殖后7天取得；图4-4是伪治疗群组肝脏切片，在7天后取得；图4-5是华顿氏胶干细胞群组肝脏切片，在华顿氏胶干细胞移殖后7天取得；
图4-6是伪治疗群组肝脏切片，在14天后取得；图4-7是华顿氏胶干细胞群组肝脏切片，在华顿氏胶干细胞移殖后21天取得；图4-8是伪治疗群组肝脏切片，在21天后取得；比例线(Bar) = 200 μ m。图5-1至图5-4为以免疫染色法染色的肝脏切片的照片；图5-1及图5_2是华顿氏胶干细胞群组肝脏切片；图5-1及图5-2是伪治疗群组肝脏切片；均在21天后取得；比例线(Bar)= 50 μ m(图 5-1 禾口图 5-3)，比例线(Bar) = 20 μ m(图 5-2 和图 5-4)。 图6-1至图6-4为以免疫染色法针对人类金属蛋白酶及人类线粒体染色在移殖21 天后取得的华顿氏胶干细胞群组及伪治疗群组的肝脏切片的照片；图6-1免疫染色法针对金属蛋白酶染色的华顿氏胶干细胞群组老鼠肝脏切片；图6-2免疫染色法针对金属蛋白酶染色的伪治疗群组老鼠肝脏切片；图6-3免疫染色法针对人类线粒体染色的华顿氏胶干细胞群组老鼠肝脏切片；图6-4免疫染色法针对人类线粒体染色的伪治疗群组老鼠肝脏切片；黑箭号及白箭号为金属蛋白酶及人类线粒体阳性反应细胞，箭头为金属蛋白酶阳性反应的胆管细胞； 比例线(Bar) = 10 μ m。图7-1及图7-2为以免疫染色法针对HGF染色在移殖21天后取得的华顿氏胶干细胞群组(图7-1)及伪治疗群组(图7-2)的肝脏切片的照片；比例线(Bar) = 20 μ m。
具体实施例方式本发明是关于多功能细胞及使用多功能细胞以治疗肝脏疾病的方法。由于具有修复的特质及分化的潜能，干细胞被用来治疗肝脏疾病已见诸于医学文献之中，然而由于伦理面与逻辑面的考虑，阻碍了胚胎干细胞的使用，自骨髓及脐带取得的干细胞具有成为各种细胞及肝祖细胞的潜能，同时，活体研究亦证实移植的干细胞能分化成肝祖细胞，同时表达白蛋白、色氨酸2，3双加氧酶和细胞角质蛋白18(CK18)特定的标记， 而研究亦证实移植的老鼠干细胞能够使动物加速肝脏受到损伤后的复原。本发明使用华顿氏胶干细胞(Wharton's jelly stem cells)取得肝祖细胞，并用肝祖细胞治疗肝脏疾病。胚胎干细胞或华顿氏胶干细胞s具有发展成各种细胞的潜能，包括肝祖细胞，因此它们能够使用于再生肝细胞以治疗肝脏疾病，如下面例子所显示，华顿氏胶干细胞能够用一般的技术手段在试管内隔离、维持及发展，将华顿氏胶干细胞s植入老鼠之后并没有发现有丝分裂活化细胞、畸胎瘤、恶性增生的发生，因此这些细胞可以植入体内治疗肝脏疾病而没有上述的顾虑，由于这些优点，华顿氏胶干细胞代表另一种取得多功能细胞的方法，在一个较佳的实施例中，本发明使用华顿氏胶干细胞。在一个较佳的实施例中，本发明使用人类的华顿氏胶干细胞。华顿氏胶是一种取自于脐带的凝胶状结缔组织，华顿氏胶是由肌纤维母细胞状的基质细胞、胶质纤维及蛋白多醣(Kobayashi et al.，1998，Early Hum Dev 51,223-33)所组成，华顿氏胶干细胞容易在体外被隔离(提取)及培养，华顿氏胶干细胞具有发展的潜能，并且在适当的条件下，能够分化成类神经元细胞、类软骨细胞、脂肪细胞、心脏细胞或是骨细胞。取自于猪脐带的华顿氏胶的细胞，能够培养至一百倍的数量，而仍然能够旺盛活泼的成长(Weiss, et al. 2003, Exp Neurol 182，288-99)，免疫组织化学及超微结构的研究发现取自于华顿氏胶的细胞具有基质细胞的特质，并且表现出对各种细胞之下及细胞间基质蛋白的不同的分布形态(Nanaev et al. 1997，Placenta 18,53-64) 下列实施例1所描述的方法可用于制备华顿氏胶干细胞(Wharton's jelly Stem Cells)，为了确认所制备的细胞的确是华顿氏胶干细胞，流式细胞仪分析或标准的免疫化学分析用于检查培养至第四代至第八代的如前所述的细胞，上面所描述的抗体或描述于图 1-1至1-14的抗体可用来检查抗原，这些抗体可以跟适当的标记结合，比如荧光异硫氰酸盐(FITC)、藻红素(PE)或量子点。使用流式细胞仪，将对⑶14、⑶34和⑶45呈阴性并且对 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 呈阳性的华顿氏胶干细胞加以浓缩及纯化。这些被浓缩的华顿氏干细胞可以用标准的技术来检验其分化潜力。第五代至第十代的细胞可以被用来诱发生成肝祖细胞、神经胶质细胞、骨细胞及脂肪细胞是本领域常用的技术。下面实施例所描述的方法可以用来培养华顿氏胶质干细胞，以取得肝祖细胞，在另一实施例中，为确认华顿氏胶质干细胞分化成骨细胞或脂肪细胞的潜力，华顿氏胶质干细胞被培养之后再转移至骨质培养液或脂肪质培养液，并培养一段适当的时间，例如三周。 分化成骨质细胞的潜力，可用钙质累积的程度来加以检测，钙质累积的程度可用von Kossa 染色法以进行目视观察。为检测分化成脂肪细胞的潜力，细胞内的脂肪微粒可用Oil Red 0加以染色，并且在显微镜之下观察。华顿氏胶质干细胞培养在神经培养液一段适当时间， 例如七天，进行血清消耗处理及β-巯基乙醇培养，在分化后，华顿氏胶质干细胞呈现折射细胞体(refractile cell body)形态，具有延伸的轴凸状构造并组成网络。族系特异性 (特异性)标记的免疫细胞化学染色，可以进一步用来确认神经的分化潜力。这些标记包括 III β-微管蛋白(tubulin) (Tuj-I)、神经中间丝蛋白(neurofilament)和GFAP神经元特异性标记。上述的华顿氏胶质干细胞或肝祖细胞可以在非分化性的培养液中培养很多倍，而不产生自发的分化、老化、形态的改变、繁殖力的增加或分化成肝细胞的能力上的改变。如下面内容所述，这些被确认后的华顿氏胶质干细胞或肝祖细胞可以用标准的方法加以储存或使用于需要的实验对象。本发明可以使用各种可以分化成肝祖细胞的多功能干细胞或多功能干细胞实施，换言之，除了华顿氏胶质干细胞之外，本发明的干细胞或前驱细胞可以来自于各种来源，在本发明的一个实施例中，干细胞或前驱细胞是取自于以下群组，该群组包含造血细胞、脐带血细胞、G-CSF活动外围血细胞、骨髓细胞、肝脏细胞、胰脏细胞、神经细胞、寡树突细胞、皮肤细胞、胚胎干细胞、肌肉细胞、骨细胞、间质细胞、软骨细胞、基质细胞，本发明自各种来源取出干细胞的方法是本领域的常规方法，通常是选择能够表达一种或多种肝细胞标记的细胞，例如CD34、CD133等，或取自于缺乏某些已分化细胞标记的细胞，干细胞的筛选通常是用FACS或免疫磁性分离法，但是也可以使用核酸法，例如聚合酶链式反应(PCR)法，胚胎干细胞取得的方法是本领域的常规技术(Smith，Annu Rev Cell Dev Biol (2001) 17 435)，成人干细胞，亦即取自于成人组织的干细胞亦是本领域的常规技术， 分离及浓缩成人干细胞的方法已见诸于文献中(Miraglia et al. (1997)Blood 90:5013， Uchida et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :14720, Simmons, P. J. et al. (1991)Blood 78:55，Prockop Cytotherapy(2001)3 393, ；Bohmer Fetal Diagn Ther (2002) 17 83 ；and Rowley et al. BoneMarrow Transplant (1998)21 1253), Stem Cell Biology Daniel R. Marshak(Editor)Richard L. Gardner(Editor),Publisher :Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)and Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Anthony D.Ho (Editor)Richard Champlin(Editor), Publisher :Marcel Dekker(2000))。“干细胞”是指能够分化成各种细胞的细胞，干细胞可以是全功能干细胞或多功能干细胞，全功能干细胞可以分化成任何一种细胞，全功能干细胞可以是胚胎干细胞或非胚胎干细胞，多功能干细胞通常可以分化成好几种不同的细胞，单功能干细胞只可以产生一种细胞的形式，但是单功能干细胞不同于非干细胞是因为其具有自我更新修复的功能，干细胞可以取自于各种组织及器官，这些组织及器官包括但不限于血液、神经、肌肉、皮肤、肠道、乳头、肾脏、肝脏、胰脏与胸腺等，在本发明中，这些干细胞是可以是取自于成人或新生儿的组织或器官在本发明中，这些细胞通常是指有相当纯度的细胞，在此，相当的纯度是指这些细胞占有一个相当的比例，或大部分的比例，例如超过20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80^^90%或95，一般来说一个有相当纯度的细胞占有70%，通常是80%，有的时候是至少 90%，换言之，一种或多种组成的细胞族群都可以在本发明中使用。“增殖”及“扩展”在本发明中被交互使用，并且同样是指相同形态的细胞经由细胞分裂而增加数目，在此分化是指一个发展的过程，通过此过程细胞特化成具有一种特定功能的细胞，例如细胞取得一种或多种形态上的特征或是具有不同于最初细胞的功能，此名词“分化”包含谱系提交及最终的分化过程，分化过程可以用检测谱系标记是否存在而加以检测，分化过程可以用本领域熟知的技术，例如免疫组织化学法，来检测谱系标记是否存在以评估分化的程度，衍生自前驱细胞的后代细胞可以是，但未必是属于干细胞来源组织的同一胚层或同一组织，例如神经前驱细胞及肌肉前驱细胞可以分化成造血细胞家族。在本发明中，“谱系提交”及“特化”可以被交互使用，是指干细胞进行的过程，在此过程中，干细胞产生一种前驱细胞，用以形成一种特定范围的已分化细胞形态，被谱系提交或指定的前驱细胞通常具有自我修复及细胞分裂的功能，在此，“最终分化”是指一种最后分化的过程， 在此过程中，细胞变成一个成熟完全分化的细胞，例如造血前驱细胞及肌肉前驱细胞可以分化成神经或神经胶质细胞谱系，然后，其最终的分化过程导致形成成熟的神经元细胞或神经胶质细胞，通常最终分化过程伴随着自细胞分裂周期的退出及细胞增殖的停止，在此， “前驱细胞”是指被指定或提交于一特定细胞谱系的细胞，这些细胞最终会经由一系列的细胞分裂而生成此谱系细胞。本发明并提供数种药物组合物(药物组成)，该药物组合物包含上述细胞、活性成分或化合物，该药物组合物的制备是经由混合治疗上有效剂量的细胞、活性成分、化合物以及药物学上可接受的载体，且该药物成分可以选择性的加入其它的活性物质，此载体具有不同的形式，其形式依使用的途径来确定。上述的药物组合物可以使用习知的药物赋形剂及药物制备方法，该药物赋形剂可以与各种药剂、溶剂、造粒剂、湿润剂及连结剂(粘结剂)混合。在此所指的“有效剂量” 或“治疗上的有效量”，是指可以造成一特定病症的症状或参数有可测量的改善的药剂量， 上述细胞的治疗有效量，是可用本领域中习知的方法来确定，本领域的技术人员可使用以经验为依据的方法来确定治疗一种疾病的有效量。使用于患者的精确药剂量，应当视疾病严重的程度及其患者的身体状况来确定，一个可以造成症状或参数可测量的改变的量，可由本领域技术人员确定或由病人向医生的报告而确定，在此应当了解的是，任何临床上或统计学上的有意义的改变或改善均属于本发明的范围之内，所谓临床上有意义的改变或改善，是指病人或医生可以察觉到的改变或改善。此词组“药物学上可接受的”是指，它的分子本身及它的成分是生理学上可以忍受而且不会对病人产生不想要的反应，更为理想的是，“药物学上可接受”是指中央或地方政府的药物管理当局所批准，或在美国药典或其它公认的药典被认为是可以使用于哺乳类， 尤其是人类的药物，药物学上可接受的盐类、酯类、胺类及前驱(前体)药物，是指这些有良好医学评价并且与病人的组织接触史，不会造成毒性发炎或过敏反应的盐类、酯类、胺基化合物及前驱药物，这些盐类、酯类、胺基及前驱药物等等，并须符合一个合理的利益/风险比例，并对使用的目的有效。上面所述使用于药物组合物的载体，是指一种稀释剂、赋形剂或载体，这些药物载体可以是无菌的液体，如水或油。水或水溶液、食盐溶液、葡萄糖水溶液及甘油溶液是较理想的载体，尤其是对注射用的溶液而言，适合使用的药物载体记载于下述文献 (“Remington' s Pharmaceutical Sciences^by Ε.W. Martin,18th Edition)。上述的细胞可通过注射或注入的方式施加于患者，例如静脉注射、脑脊椎膜注射、肌肉注射、管腔注入、气管注入、腹膜注入或皮下注射，口服或贴皮吸收，或其它本领域中所习用的方式，药物的施用可以是两周一次、一周一次或更高的频率使用，但是在疾病的稳定期通常使用的频率会减少。异体移植细胞与自体移植细胞都可以被使用。在前一种情形，应该要进行人类白血球抗原配对(HLA-matching)，以避免或减低被移植者的反应，在后面的一种情形中，自体细胞被浓缩和纯化并且储存以待后续使用，这些细胞可以在体外以被移植者的T细胞共培养然后再被导入被移植者的体内，这样做可以让被移植者的身体认为这些细胞是他自己的，而进而降低T细胞的反应。药物使用的剂量及使用的频率将视临床征兆而定，例如病人在缓解期或急性期， 在缓解期中，至少一种急性期的临床征兆将会消失或减少，并且药物的剂量与使用的频率也将视这种用药物或用药物来治疗的疾病的病人征兆及临床或非临床的征候是否有减少， 药物剂量及使用的频率也将视病人或是被治疗的哺乳类实验对象的年纪、性别、健康状况而定，并且也参考药物的作用及副作用以及医生的判断，在所有上述的方法中，细胞可以每次以一万到十万个数量使用于试验对象。本发明并包含一种治疗肝脏疾病或缓解肝脏疾病症状的方法，此方法包含诊断 “需要”治疗的试验对象，以及使用或移植上述的细胞，需要诊断的对象例如患有肝脏疾病或具有肝脏疾病风险。施用或移植可通过直接注入目标器官、注入血液或注入腹膜内的方式施行，适当的施用或移植的方法将由以下的方式确定，例如监测被植入的细胞到目标器官的迁移路径，所想要的器官特异性基因或标记的表达，以及试验对象的器官的功能，例如白蛋白或肝脏生长因子。在此，应当被认知的是在活体外被培养的干细胞或前驱细胞被植入肝脏，以提供细胞一个有利生长的环境，然后分化成能够表现出对肝脏细胞特异性的特征，然后这些
9分化完成的细胞可以再被移出、分离、再度的植入肝脏的其它部分或其它的试验对象。这些试验对象可以是人类或是非人类的哺乳类动物，诸如猫、狗、猪、马，肝脏疾病包括肝硬化及肝纤维化，在第21段中提及的“需要”是指试验对象处于一种状态，这种状态为肝功能需要被加强，此状态包括但不限于这些施用对象患有下列原发性肝脏疾病，例如原发性胆汁郁积性肝硬化、肝癌、原发性硬化性胆管炎、自体免疫慢性肝炎、酒精性肝炎以及感染性疾病，例如C型肝炎，此状态亦包含一些次要的状态，比如寄生虫引起的感染， 例如蛔虫，或是药物及化学药品中毒。在本发明的此部分，干细胞或前驱细胞的捐赠者及接受者可以是同一个体或是不同个体，比如同种异体或异种异体，当进行同种异体的移植， 降低移植排斥的照护需要被进行，此类的照护常常施行于人类的治疗，相关的治疗如以下文献所述(Slavin et al. , e. g. , J Clin Immunol (2002) 22 :64, and J. Hematother Stem Cell Res(2002) 11 :265),Gur et al. (Blood(2002)99 :4174)，and Martelli et al,(Semin Hematol(2002) 39 :48))。标准的技术可用来诊断一个需要被治疗的试验对象是否具有相关的状况或症状， 例如过度的胶原沉积是由慢性病毒、肝炎、酒精滥用以及药物中毒所引起的肝脏纤维化的主要特征。此治疗方法须对需要治疗的试验对象使用有效剂量的上述细胞，而且治疗效果可用标准的方法加以评估，例如以下实施例所描述的方法。本发明并包含一种增加在受测试对象肝脏中白蛋白、肝脏生长因子或金属蛋白酶的方法，此方法包括在需要治疗的试验对象中，使用含有培养多功能动物细胞的第一制备品，或含有肝祖细胞的第二制备品，该多功能动物细胞是对选自于以下群组中的一种或多种标记呈阳性反应，该群组由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所组成，该多功能动物细胞并对取自以下群组的一种或多种标记产生阴性反应，该群组由 CD14、CD34和CD45所组成，该金属蛋白酶在消化肝硬化胶原中扮演重要的角色，某些研究显示增加金属蛋白酶的表达有助于降低肝硬化中的胶原。我们可以通过测量白蛋白、肝脏生长因子或金属蛋白酶在样本中的表达量，以确认治疗的功效，这些样本是在本发明的药品使用前及使用后取自于试验对象，这些表达量是由mRNA水平或蛋白质水平所确定，在测量组织样本或体液样本中的mRNA水平的方法，是本领域中的习知技术，为测量mRNA的水平，细胞被溶解，而在溶解产物中mRNA的水平可由如下方法所确定，例如杂交试验法或定量或半定量的RT-PCR，无论该溶解产物是否有纯化，其中，该杂交试验法是使用具有基因特异性的DNA或RNA探针，而RT-PCR是使用适当的基因特异性引物，另外，定量或半定量的原位杂交试验，可用来检查组织切片或未溶解的细胞悬浮液，该定量或半定量的原位杂交试验是使用以荧光剂或酶所标记的DNA或RNA探针， 此外，mRNA定量法包含有RNA保护试验法(RPA)、基因表达序列分析法(SAGE)及数组技术。在组织样本或体液中，测量蛋白质水平的方法在本领域中是习知的方法，某些测量蛋白质水平的方法，使用可以特异性的结合于目标蛋白质的抗体，例如单株抗体或多株抗体，在这些方法中，抗体本身或结合于该抗体的次级抗体可以被检测到。或者抗体结合生物素。而抗生物素又用来标记生物素(抗生物素是一种可与生物素结合的多胜肽)，抗生物素是可以被检测，检测抗生物素的含量就可以确定生物素的含量，上述多种手段的结合，包括“多层三明治检测法(multi-layer sandwich assay) ”可以用来加强检测蛋白质的敏感度，某些蛋白质测量法，例如酵素连结免疫吸附法(ELISA)或免疫印迹法(Western blot) 可以使用于体液或细胞的溶解物的蛋白质检测，而一些其它的蛋白质检测法，比如免疫组织学法或荧光流式细胞仪，则可使用于组织切片或未溶解细胞悬浮液的蛋白质检测，可以使用的标记包括放射性核种(同位素)，例如125I、mI、35S、3H或32P酶碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光酵素(荧光酶)或半乳糖苷酶、荧光发光剂例如荧光、藻红蛋白、GFP、BFP和由 Quantum Dot Corporation供应的Qdot ，其它可使用的方法包括定量免疫沉淀反应法及互补结合反应法。上述试验方法的结果可用以确定药物使用的剂量范围及药物施用的途径，药物的剂量确定于药物施用的途径、药物的配方、患者的疾病，以及患者本身的体重、表面积、年纪或性别，以及是否有其它的药物也在同时施用以及医生的判断，由于不同的药物适用途径有不同的药物效率，因此药物剂量的变化是必须的，习知的根据经验的标准方法可用于调整药物剂量以达到最佳的效果。一般而言，细胞的施用量是在IxlO4到IxlO7之间，比如 IxlO5到切106而较理想的是切105到hio5，依据治疗的特质，药物可以同时施用于多个不同部位，如上所述，自体移植或异体移植的华顿氏胶干细胞或肝祖细胞都可以被使用，在异体移植的情形，人类白血球抗原配对要被进行以避免或减低被移植者的反应，在自体移植的情形，自体细胞将被浓缩及纯化并且被储存备用。“治疗”是指对试验对象施用药物组合物，例如细胞组成，而该试验对象是患有肝脏疾病或有肝脏疾病的风险，治疗的目的是改善肝脏的疾病并且减轻肝脏疾病的症状或是减少发生肝脏疾病的风险，肝脏疾病包括原发性的肝脏疾病，例如原发性胆汁肝硬化、肝癌、原发性硬化性胆管炎、自体免疫性肝炎、酒精性肝炎以及感染性肝炎，例如A型、B型或C 型肝炎、肝脏疾病包括一些次级(继发)的状况，例如寄生虫或蛔虫感染、药物及化学药品中毒等，由于肝脏在新陈代谢及体内平衡中扮演关键性角色，例如白蛋白的合成及血管的形成，因此受损的肝功能会造成神经系统、骨骼系统、消化系统、内分泌系统及循环系统的严重结果。在此，所谓的有效剂量是指药物组合物的量足以在受治疗的对象中产生医学上所想要的效果，治疗可以单独使用或与其它的药物或治疗并用。在本发明的一个实施例中，上述的细胞及方法可用于有效率的促进干细胞或前驱细胞(前体细胞)的体外培养，这些干细胞或前驱细胞是取自于携带型骨髓、外围血液及内皮层器官并且适合于移植进入肝脏，同时这些体外培养的细胞能够用于治疗肝脏疾病即恢复肝脏功能，本发明的这些方法并能用于移植器官的细胞基因治疗。本发明的上述方法并可包括在这些植入细胞之前、同时或之后，对受试验者进行抑制免疫反应的照护(护理)，这些免疫照护的方法包括使用免疫抑制的药物，提高对植入细胞的容忍度(耐受性)以及使用的免疫抑制的放射线照射，这些免疫治疗照护的方法是本领域中习知的技术并见诸于下列文献。(例如Kirkpatrick et al. , 1992. JAMA. 268, 2952 ；Higgins et al.，1996. Lancet 348,1208 ；Suthanthiran et al.,1996. New Engl. J.Med. 331,365；Midthun et al. ,1997. Mayo Clin Proc. 72,175 ；Morrison et al., 1994. Am J. Med. 97,14 ；Hanto 1995. Annu Rev Med. 46,381 ；Senderowicz et al. , 1997. Ann Intern Med. 126,882 ；Vincenti et al.,1998. New Engl. J. Med. 338,161；Dantal et al.1998.Lancet 351,623)。
适用的免疫抑制药物包括CTLA4_Ig、抗-⑶40抗体、抗-⑶40配体抗体(anti-⑶40 ligand antibodies)、抗-B7抗体、抗-CD3抗体(例如，抗-人CD3抗体0KT3)、甲氨喋呤 (methotrexate, MTX)、5S的丰公(prednisone) >(methyl prednisolone) > 1 ^ (azathioprene) ^ (cyclosporin)A(CsA) >^3 ^ (tacrolimus) > 环磷酰胺(cyclophosphamide)和氟达拉宾(f ludarabin)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、达利珠单抗(daclizumab)(人源化(IgGlFc)抗-IL2R α 链(CD25)抗体)、连接至毒素的抗-T-淋巴细胞抗体(例如，霍乱(Cholera)A链、或假单胞菌(I^eudomonas)毒素)、以及能够抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian-target-of-rapamycimmTOR)活性的试剂。在此需要特别说明的是以下实施例仅用于说明本发明而并非用于限制本发明的范围，根据本发明所叙述的内容任何熟悉此项技术人员当然能据以充分实施本发明，而任何依据本发明所做的任何变化与修改亦将包含于本发明的范围之内。下述为本发明的实施步骤。华顿氏胶干细胞的培养根据先前的报告，本试验使用的华顿氏胶质干细胞是在捐赠者同意之下取自于捐赠的脐带，这些华顿氏胶干细胞的取得是在佛教慈济医院审核委员会的同意之下进行， 这些取得的细胞是在含有5%二氧化碳的培养箱中，在摄氏37°C进行培养，这些取得的细胞是在IMDM(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium)的培养液中进行培养及增值， 此培养液含10%的胎瘤血清(HYCL0NE，Logan, UT, USA)及lOng/mL的碱性纤维组织母细胞增长因子(R&D，Minneapolis,丽，USA)、2mM的麸胺酰胺和100U/L的盘尼西林链霉素 (INVITR0GEN, Carlsbad, CA, USA)。在本发明的实验中是使用繁殖10到20倍的细胞。华顿氏胶干细胞的特征在使用各种抗体对华顿氏胶干细胞的表面标志进行标记之后，华顿氏胶干细胞的表面标志用流式细胞仪加以分析(FC500 ；BECKMANCOULTER, Brea, CA, USA)，这些抗体是针对各种人类的抗原 CD105 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, Santa Cruz, CA, USA) ；CD13、CD14、 CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-DR 和 IgG2a(DAK0, Carpinteria, CA, USA)以及 CD49b、CD49d、 CD73 和 CD90 (BECT0N DICKINSON, Franklin Lakes, NJ, USA)，次级抗体(二抗)则与异硫氰酸酯荧光素(CHEMIC0N，Temecula，CA，USA)结合以便进行检测。试管内肝细胞分化在本发明中，试管内肝细胞分化实验是依据一个改良的细胞培养方案进行，该方案记载于下列文献(2004, Nat. Cell Biol. 6(6) :532-539, by Jang et al.), Wyss (3 X IO4) 与50毫克的肝脏组织共同培养于一个6孔培养皿(BECT0N DCKINS0N)，该培养皿具有孔径大小为0.4微米的薄膜分开细胞及组织，这些肝脏组织是取自于一种雄性的老鼠，而这些雄性的老鼠在培养之前其父母以350毫克/公斤的剂量暴露于一种肝毒性的试剂，例如硫乙酰胺中M小时，在培养期间的第二天及第四天，从华顿氏胶干细胞萃取出所有的RNA，同时cDNA则被制备成样本以进行肝脏特异基因的聚合酶链式反应分析(PCR)。该聚合酶链式反应是在下列条件下进行35个周期，每一周期包含在95°C进行变性反应30秒，再进行退火30秒，依据所使用的引物对(primer set)在56_60°C进行，在 72°C延伸60秒，最后在72°C进行10分钟的培养，使用这些引物对扩增的DNA则使用凝胶电泳进行分析。白蛋白(F)5' -TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG-3‘ (SEQ ID NO :1)禾口(R) 5' -AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3‘ (SEQ ID NO :2)。色氨酸2，3双加氧酶(F)5' -TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3‘ (SEQ ID NO :3)和(R)5' -CTCTGGATTGACTGTGGAAGT-3‘ (SEQ ID NO :4)。a-胎儿蛋白(F) 5' -ATACAGAGACTTCAGGAGC-3 ‘ (SEQ ID NO :5)禾口(R)5' -GTGAAGAGGGAAGACATAACTG-3‘ (SEQ ID NO :6。肝脏生长因子(F) 5' -CAGATCATCCATTGCATTCG-3 ‘ (SEQ ID NO :7)禾口(R)5' -ACTCCAGAGGCATTTCCATG-3‘ (SEQ ID NO :8)。金属蛋白酶(F) 5，-TgAATgCCCTTgATgTCATCCT-3，(SEQ ID NO :9)和(R)5，-ACACCTACACCAAgAACTTC-3，(SEQ ID NO :10)。CYP7A1 (F) 5，-GAGAAGGCAAACGGGTGAAC-3，(SEQ ID NO :11)禾口(R)5，-ATCGGGTCAATGCTTCTGTG-3，(SEQ ID NO :12)。Nanog (F) 5，-TGCCTCACACGGAGACTGTC-3，(SEQ ID NO :13)禾口(R)5，-TGCTATTCTTCGGCCAGTTG-3，(SEQ ID NO :14)。OCT 4 (F) 5，-CTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA-3，(SEQ ID NO :15)禾口(R)5，-CTGCAGTGTGGGTTTCGGGCA-3，(SEQ ID NO :16)。ckit (F) 5，-ATGAGAGGCGCTCGCGGCGC-3，(SEQ ID NO :17)禾口(R)5，-AGCTTGGCAGGATCTCTAAC-3，(SEQ ID NO :18)。甘油酸-3-磷酸脱氧酶(F)5' -GGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3‘ (SEQ ID NO 19)禾口(R)5' -GCAGGTTTTTCTAGACGG-3‘ (SEQ ID NO :20)。建立老鼠肝脏纤维化的模型及确定其肝脏纤维化的程度Wistar Kyoto (WKY)老鼠自LASCO公司(台北、台湾)取得，所有的试验程序皆遵 循道德规范并由东华大学动物照护使用委员会所批准。20只成年的雄性WKY老鼠重量320士20克被使用来建立慢性肝脏纤维化的模型， 其中的20只在父母内被注射200毫升/公斤的硫乙酰胺(SIGMA-ALDRICH)，锋三天一次总 共60天，亦即总共注射20次以作为纤维化模型組，其中的八只则被注射食盐水做为对照 組，在第64天，亦即在最后一次注射之后的四天，这些老鼠被处死并且取其心脏血液样本 及肝脏样本。
这些血液样本使用生化分析仪(INTEGRA 800 ；ROCHE, Holliston, MA, USA)分析，以测量肝功能指数，这些肝功能指数包含GOT (谷草转氨酶，glutamate oxaloacetate transaminase)与 GPT (谷丙转氨酶，glutamate pyruvate transaminase)。这些肝脏组织的样本使用胶质纤维染色法(麻省三色染色，Masson’ s trichrome staining)检查组织，并以是否有过度胶原蛋白的累积造成的纤维化切片，这些肝脏组织样本以3. 7%的甲醛固定，然后包埋于石蜡中，然后一系列的三微米厚的切片是被包埋的组织中取出，并以苏木色素、曙红染料与麻省三色染色。就胶质纤维染色法而言，被切片的样本放置于56 °C的布安氏液(Bouin’ s solution ；SIGMA-ALDRICH)中一个小时，然后依照顺序在下列溶液中培养，苏木紫溶液 (Mayer' s hematoxylin solution) 5 分I中、酸溶液(Biebrich scarlet-acid fuchsin solution) 15 分钟、磷销酸-磷鹤酸溶液(phosphomolybdic acid-phosphotungstic acid) 15分钟、苯胺蓝溶液(aniline blue)5分钟。每一个实验组的肝脏纤维化程度由以下文献记载的方法加以定量(Bruck et al.，2007，J. Gastroenterol. Hepatol. 22(12) :2189-2194)，这些由胶质纤维染色的肝脏组织切片被拍照，然后由三位独立的病理学家从0-3作半定量的评分，每一块载玻片选取十个不同位置加以评分，然后平均这些分数以确定肝脏纤维化的程度，分数越高表示肝脏纤维化的程度越高。细胞移植步骤如前所述华顿氏胶干细胞QX IO7个)已经与硫乙酰氨中毒的肝脏组织在75平方公分的培养皿中培养，然后华顿氏胶干细胞以胰蛋白酶消化的方法分离并用离心的方法加以收集，这些收集的细胞再以2X IO6个细胞/毫升的浓度悬浮于一般的食盐水中。细胞移植是依照一个改良的实验方案进行，该实验方案记载于以下文献(Abdel Aziz et al. , 2007, Clin. Biochem. 40 (12) :893-899 and Zhao et al. ,2005, World J. Gastroenterol. 11(22) :3431-3440)，在上述建立肝脏纤维化模型中所提到的，用硫乙酰胺引起纤维化肝脏的30只老鼠在第64天，即在最后一次注射硫乙酰胺后的4天，被用于细胞移植实验，这些老鼠被随意分成两组，一组是华顿氏胶干细胞组，一组伪治疗组，15只在华顿氏胶干细胞组的老鼠用乙醚加以麻醉后，再经由门静脉注入含有100万个华顿氏胶干细胞的食盐水，而治疗组的老鼠则被注射0. 5毫升的一般生理食盐水。自细胞移植之后，每周从两组各取出5只老鼠加以处死，连续三周，然后进行生化肝功能组织检查及肝脏病理组织学检查。被移植的华顿氏胶干细胞s的特征被移植的华顿氏胶干细胞的表达对人类白蛋白、人类线粒体、人类金属蛋白酶以及人类肝脏生长因子有特异性的单株抗体被用来确定被移植的华顿氏胶干细胞是否有表达出如前面所述的肝脏标记。使用抗人类白蛋白，抗金属蛋白酶以及抗人类肝脏生长因子的试剂，对包埋于石蜡并经过切片的肝脏样本进行免疫组织化学分析，然后一个免疫组织化学分析的套组(INN0GENEX，San Ramon, CA, USA)用来将存在的抗原予以可视化，为使用于荧光显微镜检测抗原，这些被切片的肝脏样本先在抗人类线粒体培育一个晚上，再与二级抗体(罗丹明连接的抗小鼠二抗)一起培育。统计分析
所有取得的数据与具有标准差的平均值呈现，使用学生氏t实验(student’ s t test)来比较治疗组与对照组的数据差异，考虑到治疗组及对照组的统计差异ρ值小于 0. 05。实验结果华顿氏胶干细胞的形态及其表面标记分别用显微镜及流式细胞仪加以确定，华顿氏胶干细胞的表面标记类似于前面所述(Tang et al.，2006，World J. Gastroenterol. 12(25) :4014-4019)，在此一研究中所取得的华顿氏胶干细胞并不具有造血细胞的标记，例如⑶14、⑶34或⑶45但是具有间叶干细胞的标记(例如⑶四、⑶44、 ⑶49b、⑶49d、⑶73、⑶90和⑶10 及骨髓细胞的标记⑶13，及主要组织兼容性复合体标记HLA-DR，如图第IA到图IM所示，同时华顿氏胶干细胞具有类似人类纤维母细胞的形态， 如图IN所示。为了测试华顿氏胶干细胞与受硫乙酰胺所伤害的老鼠肝脏组织共同培养时是否能够进行肝脏细胞分化，前面所述方法去测试肝脏细胞标志，RT-PCR显示，在分化条件下所培养的华顿氏胶干细胞能够取得肝脏特异性基因的表达，包括色氨酸2，3双加氧酶、白蛋白、α -胎儿蛋白和CYP7A1，同时肝脏生长因子和金属蛋白酶的基因表达亦有所增加，而干细胞的基因表达，包括nan0g、0ct4和ckit则减少，这些结果显示华顿氏胶干细胞具有在试管中分化成类肝脏细胞的潜力。肝脏纤维化模型的特征及华顿氏胶干细胞细胞治疗的效果评估如表1所示，相较于正常的老鼠群组，肝脏纤维化老鼠群组的GOT及GPT有显著的增加(GOT 从 110 士 16U/L 至 1034士 361U/L，以及 GPT 从 77 士 10U/L 至 185 士 50U/L)，这样的结果显示肝脏有受到伤害。表1正常老鼠及肝纤维化老鼠的血浆生化值
权利要求
1.一种取得肝祖细胞的方法，包括取得含有被培养的多功能动物细胞的制备物，所述制备物对一种或多种选自以下群组的标记呈阳性反应，所述群组由⑶29、⑶44、⑶49b、 ⑶49d、⑶73、⑶90、⑶105、⑶13和HLA-DR所组成，并对一种或多种取自以下群组的标记呈阴性反应，所述群组由⑶14、⑶34和⑶45所组成，将所述多功能动物细胞与肝脏组织培养于培养液中一段时间，然后收集所述共培养的多功能动物细胞的后代以取得肝祖细胞，其中，所述多功能动物细胞是取自于第一实验对象的脐带的华顿氏胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一实验对象是人类。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述共培养肝脏组织是一种受伤的肝脏组织。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述受伤的肝脏组织是通过以下过程取得，所述过程包含使取自于第二试验对象的肝脏组织经受肝脏毒性试剂的作用。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述肝脏毒性试剂是一种化学试剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述化学试剂是硫乙酰胺或四氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝祖细胞表达一种或多种选自于以下群组的基因，所述群组由CK18、白蛋白、色氨酸2，3双加氧酶、α-胎儿蛋白、CYP7A1、nanog、 oct4、ckit、肝脏生长因子和金属蛋白酶所组成。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多功能动物细胞对肝脏生长因子或金属蛋白酶呈阳性反应。
9.一种制备物，包含肝祖细胞，其中，所述细胞表达一种或多种选自以下群组的基因， 所述群组由0(18、白蛋白、色氨酸2，3双加氧酶、0-胎儿蛋白丄丫 7六1、皿11(^、0(^4、01^仏肝脏生长因子和金属蛋白酶所组成。
10.根据权利要求9所述的制备物，其中，所述细胞由权利要求1所述的方法制备。
11.一种组合物，包含制备品，所述制备品含有培养的多功能动物细胞和肝脏组织， 其中，所述多功能动物细胞对一种或多种取自于以下群组的标记呈阳性反应，所述群组由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所组成，并对一种或多种取自于以下群组的标记呈阴性反应，所述群组由⑶14、⑶34和⑶45所组成。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述肝脏组织是一种分离的肝脏组织。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述肝脏组织是经受肝脏毒性试剂作用而受伤的肝脏组织。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述多功能动物细胞是取自于第一实验对象的脐带的华顿氏胶。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述第一实验对象是人类。
16.一种治疗肝纤维化或肝硬化的方法，包括鉴定出患有肝硬化或肝纤维化或具有肝硬化或肝纤维化风险的对象，以及施用于所述对象有效剂量的(一)第一制备物或(二) 第二制备物，其中，所述第一制备物包含培养的多功能动物细胞，所述第二制备物含有肝祖细胞，其中，所述多功能动物细胞对一种或多种选自以下群组的标记呈阳性反应，所述群组由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所组成，并对一种或多种选自以下群组的标记呈阴性反应，所述群组由⑶14、⑶34和⑶45所组成。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述多功能动物细胞或所述肝祖细胞施用于所述对象并分化成表达白蛋白的细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述肝祖细胞依据权利要求1所述的方法制备。
19.一种增加肝脏中白蛋白、肝脏生长因子或金属蛋白酶含量的方法，包括施用于需要对象有效量的(一)第一制备品或(二)第二制备品，其中，所述第一制备品含有培养的多功能动物细胞，所述第二制备品含有肝祖细胞，其中，所述多功能动物细胞对一种或多种选自以下群组的标记呈阳性反应，所述群组由⑶四、⑶44、⑶49b、⑶49d、⑶73、⑶90、 ⑶105、⑶13和HLA-DR所组成，并对一种或多种选自以下群组的标记呈阴性反应，所述群组由⑶14、CD34和CD45所组成。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述肝祖细胞依据权利要求1所述的方法制备。
全文摘要
本发明提供一种肝祖细胞的制备方法及其应用。本发明的取得肝祖细胞的方法包括取得含有被培养的多功能动物细胞的制备物，该制备物对一种或多种选自由CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13和HLA-DR所组成的群组的标记呈阳性反应，并对一种或多种取自由CD14、CD34和CD45所组成的群组的标记呈阴性反应，将多功能动物细胞与肝脏组织培养于培养液中一段时间，然后收集共培养的多功能动物细胞的后代以取得肝祖细胞，其中，多功能动物细胞是取自于第一实验对象的脐带的华顿氏胶。通过本发明获得的多功能肝祖细胞能够用以治疗肝病及其相关问题。
文档编号A61P1/16GK102234626SQ20111011742
公开日2011年11月9日 申请日期2011年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者林欣荣, 韩鸿志 申请人:国玺干细胞应用技术股份有限公司