一种锌指蛋白zbtb20在软骨细胞中特异性基因剔除小鼠模型及用途的制作方法

专利名称：一种锌指蛋白zbtb20在软骨细胞中特异性基因剔除小鼠模型及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，更具体地，本发明涉及一种锌指蛋白的功能及用途。
背景技术：
骨骼系统是脊椎动物机体的重要组成部分，主要以膜内成骨和软骨内成骨方式完 成其发育过程。软骨内成骨是骨骼发育的主要方式之一，它构成了骨骼系统的大部分骨骼， 包括脊椎骨、四肢骨、颅底骨和一部分锁骨。软骨发生是软骨内成骨的第一步，最终形成在 脊椎动物发育过程中起到结构、运动和保护作用的骨骼组织。软骨发育过程是一连串多层 次而严格的调控事件，它包括间充质软骨祖细胞(间质祖细胞)的凝缩，分化成软骨细胞， 以及软骨化组织形成骨骼组织的模式建成。软骨内成骨在次序上可分为软骨发生时期和生长板发育时期。在这一过程的起始 阶段，间充质细胞不是分化为成骨细胞，而是分化为软骨细胞，形成软骨原基。软骨原基是 未来骨骼的雏形，原基内的软骨细胞有序分化和排列，形成生长板结构，由进入软骨内的骨 组织不断替代生长中的软骨组织，最后形成骨骼。软骨生长板结构一般分成四个区，即静息 区(R)、增殖区(P)、前肥大区(PH)和肥大区(H)。静息区是一些处在分裂间期的细胞，细 胞小而呈圆形，排列紧密，即将进入增殖区。增殖区是由一群分裂能力旺盛的扁平柱状细 胞组成，排列比较整齐，细胞体积较大。前肥大区相当于一个过渡区，供软骨细胞由增殖状 态向肥大分化做准备，这一区域的细胞较P区细胞变大，细胞由扁平柱状变圆，细胞排列松 散。肥大区是高度成熟的区域，是软骨细胞成熟的标志，这一时期的细胞体积大、排列松散 无规则，这一时期细胞最终进入终末分化后成为终端肥大软骨细胞，伴随着终端肥大软骨 细胞的凋亡，成骨细胞逐渐取代软骨细胞，而它分泌的骨基质取代了软骨基质，最终实现了 骨化。软骨内成骨实际上是一个复杂的细胞增殖、分化过程。在这一过程中，软骨细胞分 泌不同的胞外基质，表达不同的标志分子。软骨内成骨是一个受到严密调控的过程，局部产 生的细胞因子如BMP、VEGF、FGF、Ihh、PTHrP、维生素D等，通过内分泌和旁分泌途径如生长 激素(GH)、甲状腺激素(thyroxin)、甲状旁腺素(PTH)、胰岛素生长样因子(IGF)，以及作用 于软骨的理化因素如氧浓度、离子强度、机械压力等都可以作用于软骨细胞和周围其它类 型的细胞。这些信号通过各种途径激活各种转录因子，如对软骨细胞发育至关重要的Sox9、 Rimx2，调节软骨细胞低氧反应的低氧诱导因子1-α (HIF-Ia)等等，从而启动一系列基因 的表达，最终使软骨内成骨协调有序地进行。软骨发育障碍及发育不良是受激素、多种遗传、环境因素等的综合调节作用的结 果。基因敲除小鼠的研究，充分证实了许多转录因子、生长因子及其受体包括FGF及其受 体、IGF及其受体等，导致软骨发育出现各种不同程度的失调，并与软骨疾病发生密切相关。尽管如此，目前本领域对软骨细胞增殖、发育以及软骨发育相关疾病的发病机理 的了解仍然不清楚，存在许多空白。

发明内容
本发明的目的在于提供一种锌指蛋白ZBTB20(以下简称ZBTB20)的功能及其用途。本发明的另一目的在于提供基于上述所述ZBTB20为靶点，筛选对于促进哺乳动 物软骨细胞增殖以及促进骨骼形成的有效物质的方法。在本发明的第一方面，提供一种ZBTB20或其抑制剂的用途，可用于制备促进软骨 细胞增殖的组合物质。在另一优选例中，所述的组合物或其抑制剂对提高哺乳动物对IGF-I的产生及分 泌能力，从而促进软骨细胞的增殖。在另一优选例中，所述的组合物还用于防治哺乳动物软骨发育受阻。在另一优选例中，所述的ZBTB20选自(i)SEQ ID 1所示的氨基酸序列；或(ii)将SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列经过一系列的取代、缺失或添加而形成 的，且能够促进哺乳动物软骨细胞增殖的由(i)衍生的蛋白。在本发明的第二方面提供一种筛选ZBTB20的用途，用于筛选促进哺乳动物软骨 细胞增殖的物质。在本发明的第三方面，提供一种筛选一种促进哺乳动物软骨细胞增殖的潜在物质 的方法，所述方法包括(a)将候选物质与含有ZBTB20的体系接触；(b)观察候选物质对于ZBTB20的表达活性的影响；其中，若所述的物质能够抑制ZBTB20的表达或者活性，则表明该候选物质是促进 软骨细胞增殖的潜在物质。在另一优选例中，步骤(a)包括在测试组中，将候选物质加入到含有锌指蛋白的 体系中；和/或步骤(b)包括检测测试组的体系中ZBTB20的表达或者活性，并与对照组相比较， 其中所述的对照组为不添加所述候选物质的含有ZBTB20的体系；如果测试组中ZBTB20的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20% ； 优选的低40% ；更优选的低60%或更低)对照组，就表明该物质是促进软骨细胞增殖的潜 在物质。在另一优选例中，还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以选出对促进软骨细 胞增殖的物质。在本发明的第四方面，提供一种用ZBTB20基因敲除啮齿动物的应用，用于作为研 究软骨和/或骨骼发育的模型。在另一优选例中，所述的啮齿动物选自大鼠或小鼠。在另一优选例中，所述的ZBTB20基因敲除小鼠为纯合缺失ZBTB20基因的小鼠。在另一优选例中，所述的ZBTB20基因敲除小鼠作为软骨发育和骨发育研究的动 物模型，用于软骨发育相关疾病的治疗药物的筛选。
在本发明的第五方面，提供一种ZBTB20或其编码基因的用途，用于制备诊断软骨 发育相关疾病的试剂或试剂盒。在本发明的第六方面，提供一种体外或体内(非治疗性地)调节软骨细胞增殖的 方法，所述方法包括降低软骨细胞中ZBTB20的表达或活性。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对于本领域的技术人员而言是显而易见 的。


图1. ZBTB20在正常小鼠软骨细胞中特异表达的免疫组织化学染色分析。该图是 采用抗ZBTB20的单克隆抗体的荧光染色结果。图2.ZBTB20条件基因打靶路线示意图。图3. ZBTB20软骨细胞特异性敲除小鼠模型的鉴定。图3A是提取小鼠尾巴基因组DNA，用ZBTB20等位基因的Pl和P2引物、以及Cre 基因的引物进行PCR扩增后的电泳结果。其中，+/+/Cre代表Cre转基因，F/F代表ZBTB20 的flox等位基因纯合子，F/F/Cre代表ZBTB20的flox等位基因纯合子和Cre转基因，F/+ 代表ZBTB20的flox等位基因杂合子。图3B是利用免疫荧光组织化学对敲除小鼠和同窝对照小鼠后肢关节部位的染 色。图4ZBTB20软骨特异性敲除小鼠CZB20K0的体重和尾长分析图4A是雄性CZB20K0小鼠(右)在所监测时间(1 5月龄)点的体重变化情况， 以同窝雄性野生小鼠(左)作为对照。各时间点P > 0. 1。图4B是雄性CZB20K0小鼠(右)在所监测时间(1 5月龄)点的尾巴长度变化 情况，以同窝雄性野生小鼠(左)作为对照(Con)。各时间点P < 0. 001)。图5.软骨特异性敲除小鼠CZB20K0体内IGF-1表达变化图5是CZB20K0小鼠(右)及其同窝对照(左)的原代软骨细胞培养物IGF-ImRNA 水平变化情况，P < 0. 05。图6.软骨特异性敲除小鼠CZB20K0骨骼形态变化及软骨细胞增殖变化图6A是胚胎17. 5天(E17. 5) CZB20K0小鼠(右)的膝关节阿尔辛兰染色，对照 (左)为野生型小鼠，蓝色区域为软骨细胞染色部位。图6B是出生后第五天(P5)CZB20K0小鼠(右)的膝关节阿尔辛兰染色，对照(左) 为野生型小鼠，蓝色区域为软骨细胞染色部位。图6C是3月龄CZB20K0小鼠(D，E，F)的膝关节阿尔辛兰染色，对照(A，B, C)为 野生型小鼠，蓝色区域为软骨细胞染色部位。图6D是12月龄CZB20K0小鼠(左)和同窝对照小鼠(右)的X光活体成像图。图6E是出生后第四天(P4)CZB20K0小鼠(右)和同窝对照小鼠(左)单个肋软 骨分离物的细胞计数分析(P < 0. 005)。
具体实施例方式本发明人经过长期的研究，首次提示ZBTB20对软骨细胞分泌IGF-I的调节作用，
5所述锌指蛋白ZBTB20可以通过影响IGF-I的表达分泌从而调节软骨细胞增殖。因而， ZBTB20可作为筛选药物的靶点，用于筛选通过调节ZBTB20表达或者活性而调节软骨细胞 增殖的物质。在此基础上完成了本发明。ZBTB20及其用途ZBTB20，又称为 DPZF (Dendritic Cell-Derived POZ Zinc Finger)，ZNF288，是一 个由741个氨基酸组成的新型转录因子，其N端含有POZ结构域，C端含有5个C2H2锌指结 构域，属于BTB锌指蛋白亚家族，其生物学功能尚不明确。ZBTB20广泛表达于哺乳动物中， 其在各种哺乳动物中是高度保守的，具有很高的蛋白同源性。本发明人分析发现，ZBTB20在软骨细胞中特异性高表达，运用基于Cre-IoxP的条 件基因打靶技术成功建立了 ZBTB20在软骨细胞中特异性剔除的小鼠模型，发现该小鼠模 型存在生长板结构，脊椎发育方面存在异常，主要表现为膝关节生长板增粗，生长板肥大区 增宽，且3月龄时发现骨骺生长板结构紊乱，排列不规则或者不连续。分析发现其生长板软 骨细胞过度增殖，而凋亡没有显著性差异。同时分析发现3月龄小鼠的颈椎增粗并且伴有 颈椎处弯曲角度弯小，颈椎变长。胸椎突起，外形上并呈现出突起。这些与软骨细胞增生的 一些病理状态改变有一些相似。本发明人首次发现了 ZBTB20对软骨细胞分泌IGF-I的体 内外调节作用，提出ZBTB20在软骨细胞中的功能缺失可能引起软骨增生及软骨相关疾病 的发生过程。在本发明中，所用的ZBTB20可以是天然存在的，比如其可被分离纯化自哺乳动 物。此外，所述的ZBTB20可以也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程技术来 产生重组的ZBTB20。任何合适的ZBTB20均可适用于本发明。所述的ZBTB20包括全长的ZBTB20或其 生物活性片段。优选的，所述的ZBTB20的氨基酸序列可以与SEQ ID NO :1所示的序列基本 相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的ZBTB20的氨基酸序列 也包括在本发明中。ZBTB20或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述氨 基酸替代的序列并不影响其活性或保留了其部分活性。适当替换氨基酸是本领域内的公知 技术，所述技术可以、很容易地被实施并且确保不改变已知分子的生物活性。这些技术使本 领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必需氨基酸区域改变单个氨基酸并不会改变 生物活性。任何一种ZBTB20的生物活性片段均可以应用到本发明中。在这里，ZBTB20的生 物活性片段的含义是指一种多肽，其仍然能保持全长的ZBTB20的全部或部分功能。通常情 况下，所述的生物活性片段至少保持50%、60%至99%或者100%的全长ZBTB20的活性。本发明也可以采用经修饰或改良的全部或部分氨基酸的ZBTB20，比如，可以为了 促进半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的ZBTB20。所述经过修饰 或改良的锌指蛋白可以是一种ZBTB20的共轭物，或其可被取代的或人工的氨基酸。所述经 过修饰或改良的ZBTB20可以是基因或可以与天然产物共存的ZBTB20或基因有一定的不同 点，但也能够调节软骨细胞增殖，且不会带来其它不良反应或毒性。也就是说，任何不影响 ZBTB20的生物活性或者说是基因的生物学功能的变化形式都可用于本发明中。任何与所述的ZBTB20同源性高(比如与ZBTB20的同源性为60%或者更高，优选的，同源性为80%或更高，更优选的，同源性为90%或者更高)的、且具有ZBTB20相同功能 的蛋白质也包括在本发明内。基于本发明人的新发现，本发明提供了 ZBTB20的用途，用于促进哺乳动物软骨细 胞提高增殖能力。所述的ZBTB20可直接作为药物调节哺乳动物软骨细胞的增殖。或者，可 基于所述ZBTB20来筛选促进哺乳动物软骨细胞增殖的物质。锌指蛋白的抑制剂及其用途所述的ZBTB20的抑制剂是指任何可以抑制ZBTB20的活性、破坏ZBTB20的稳定 性、降低ZBTB20有效作用时间、或起到阻碍ZBTB20的转录和翻译的物质，这些物质可以用 于本发明中，作为通过抑制ZBTB20的表达或活性而促进软骨细胞增殖的物质。所述抑制剂 包括(但不限于)拮抗剂，阻断剂等。任何调节ZBTB20的各种活性机制的物质也可以用于本发明，作为对哺乳动物软 骨细胞增殖的有效物质。筛选促进软骨细胞增殖的物质在得知了所述的ZBTB20对于哺乳动物软骨细胞的影响作用后，可以采用本领域 熟知的多种方法来筛选促进哺乳动物软骨细胞增殖的潜在物质。进而可从所述的潜在物质 中找到对于促进软骨细胞增殖的物质。因此，本发明提供一种筛选促进哺乳动物软骨细胞增殖的潜在物质的方法，包括 以下步骤将候选物质与含有ZBTB20的体系接触；观察候选物质对于ZBTB20的表达活性的 影响；其中，若所述的物质能够抑制ZBTB20的表达或者活性，则表明该候选物质是促进软 骨细胞增殖的潜在物质。在本发明中，所述的体系选自(但不限于)溶液体系、细胞体系、亚细胞体系、组 织体系、器官体系、或动物体系。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于筛选观察到ZBTB20的改变， 还可以设置对照组，所述的对照组为可以是不添加所述候选物质的含有ZBTB20的体系。这些初步筛选出来的物质可以成为一个ZBTB20的筛选库，可对这些物质进一步 进行细胞实验和或动物实验。以便于最终可以从中筛选出能够对于促进哺乳动物软骨细胞 增殖真正有用的药物。因此，本发明还包括一类通过本发明的筛选方法获得的促进哺乳动物软骨细胞增 殖的物质。本发明还提供了一种体内或体外促进哺乳动物软骨细胞增殖的方法(特别是非 治疗性的方法)，包括降低软骨细胞内ZBTB20的表达或活性。应理解，当用于调节软骨细胞增殖时，所用的ZBTB20或其抑制剂的有效剂量可随 待治疗对象的严重程度而变化，具体情况根据受试的个体情况来决定，这些因素均可在熟 练的医师或者营养师可以判断的范围内。在得知了所述ZBTB20或其抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来 将所述的勻ZBTB20或其抑制剂进行，或者它们的编码基因、或它们的药物组合物给药于哺 乳动物。优选的，可以采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将ZBTB20或其抑制剂通过 诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带ZBTB20或其抑制剂的表达单位(比如表达载体或者病毒等)递送到靶点上。并使之表达活性的ZBTB20藏器待时其 抑制剂，具体情况还需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。优选的，可将编码ZBTB20其抑制剂的基因、或携带所述基因的载体通过常规的方 法引入到靶细胞组织中实现ZBTB20或其抑制剂的表达。所述的靶组织包括但不局限于软 骨组织或者软骨细胞。动物模型本发明还提供一种可作为软骨发育或骨发育的ZBTB20基因敲除啮齿类动物。所 述的动物模型利用基于Cre-IoxP条件基因打靶技术建立，软骨细胞(组织)中特异性剔除 了 ZBTB20基因，该动物模型软骨发育存在明显异常，主要表现为关节增粗，关节生长板肥 大区变宽，软骨细胞增殖能力过强，生长板结构排列不规则；脊椎突起使得呈现出背凸，颈 椎变长并呈现出弯曲度变小。这与一些骨发育相关疾病的病理特征改变相似。该动物模型 可以用于骨发育相关疾病治疗药物的筛选。制备该软骨发育及骨发育异常的动物模型的动物基因敲除技术也可以采用本领 域人员所熟悉的技术进行。本发明的优点在于首次揭示ZBTB20对软骨细胞增殖能力的调节作用，所述的ZBTB20可以抑制软骨 细胞的增殖能力和抑制IGF-I的释放。因此，ZBTB20可以直接作为药物以调节软骨细胞的 过度增殖和IGF-I的释放能力；或者可作为筛选药物的靶点，用于筛选通过调节锌指蛋白 的表达或活性而调节软骨细胞的增殖能力或调节软骨细胞生成IGF-I的物质。下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅适用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和分数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述 的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法1.基因剔除小鼠的制备选择ZBTB20的第6外显子作为基因打靶的靶点，构建第6外显子两侧翼内含子含 有IoxP位点的打靶载体，转染小鼠胚胎干细胞(ES)，筛选同源重组克隆，将重组的阳性克 隆ES细胞注射至小鼠囊胚内，然后移植至伺假孕小鼠子宫内，发育为嵌合鼠，经过交配得 到携带IoxP位点的ZBTB20等位基因小鼠，将此小鼠与精蛋白(Protamine)启动子Cre转 基因小鼠交配，筛选通过同源重组去除新霉素抗性基因Neo但仍保留完整的ZBTB20第六外 显子及其侧翼IoxP位点的IoxP小鼠；将这种小鼠与携带小鼠II型胶原启动子Cre转基因 小鼠交配，在表达II型胶原的软骨细胞中通过Cre介导的同源重组特异性剔除ZBTB20基 因的引6外显子。2.基因型鉴定提取小鼠尾巴基因组DNA，用ZBTB20等位基因的Pl和P2引物(图2所示，分别是5，-GGCACCCTTT AAATCCAATC AT-3，(SEQ ID NO 2)和 5，-CTCTCCCCTCCTCCCTCTG-3，(SEQ ID 3)、以及 Cre 基因的引物(分别是 5，-GGCGGATCCGAAAAGAAAAA-3，(SEQ ID :4)，禾口 5，-C AGATGGCGCGGCAACAACAACC-3，(SEQ ID 5)进行 PCR 扩增，得到 700bp 条带代表 ZBTB20 野生 型等位基因条带，800bp条带表示含IoxP位点的ZBTB20等位基因，400bp条带表示Cre基 因，从而对小鼠的基因型进行综合判断。提取F/F/Cre小鼠不同组织的基因组DNA，进行PCR 扩增，分析在软骨细胞中ZBTB20基因剔除的特异性及其效率。3.免疫组织化学分析取小鼠后肢膝关节常规石蜡切片，经煮沸法抗原修复后，用鼠抗ZBTB20单克隆抗 体标记孵育，然后用相应的荧光素标记的二抗(Alexa 594或Alexa 488)标记的小鼠单抗， 购自Vector公司)孵育，漂洗后封片，在荧光显微镜下观察染色结果。4.阿辛兰-快红染色取小鼠后肢骨骼标本，经固定后常规石蜡包埋、切片处理，先用阿辛兰染色，水洗 后用快红染色后按常规的方法脱水、透明和封片。5. HE 染色取小鼠后肢骨骼，经固定、脱钙后按常规石蜡包埋、切片后进行常规的摊片，捞 片、烤片后进入常规的脱蜡复水后，接着，用苏木素染色5min，自来水洗。然后用氨水处理 lmin，自来水洗后放于伊红染液中染色2min。常规方法脱水、透明、封片。镜检。6.软骨细胞的分离和体外实验利用胶原酶消化方法，从新生小鼠(P2-P5)的关节软骨和肋软骨中分离培养原代 的软骨细胞。II.具体实施例实施例1ZBTB20在软骨细胞中特异性表达正常小鼠软骨组织石蜡切片经抗ZBTB20的单克隆抗体的染色结果，显示了 ZBTB20在软骨细胞中表达，见图1。实施例2在软骨细胞中特异性剔除ZBTB20基因在软骨细胞中特异性剔除ZBTB20基因的流程见图2。选择ZBTB20的第6外显子 作为基因打靶的靶点，构建第6外显子两侧翼内含子含有IoxP位点的打靶载体，转染小鼠 胚胎干细胞(ES)，筛选同源重组克隆，将重组的阳性克隆ES细胞注射至小鼠囊胚内，然后 移植至伺假孕小鼠子宫内，发育为嵌合鼠，经过交配得到携带IoxP位点的ZBTB20等位基因 小鼠，将此小鼠与精蛋白(Protamine)启动子Cre转基因小鼠交配，筛选通过同源重组去除 新霉素抗性基因Neo但仍保留完整的ZBTB20第六外显子及其侧翼IoxP位点的IoxP小鼠； 将这种小鼠与携带小鼠II型胶原启动子Cre转基因小鼠交配，在表达II型胶原的软骨细 胞中通过Cre介导的同源重组特异性剔除ZBTB20基因的引6外显子。ZBTB20软骨细胞特异性敲除小鼠的基因型鉴定结果见图3。图3A提取小鼠尾巴基因组DNA，用ZBTB20等位基因的Pl和P2引物、以及Cre基 因的引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳，电泳结果得到的700bp条带代表ZBTB20野 生型等位基因条带，800bp条带表示含IoxP位点的ZBTB20等位基因，400bp条带表示Cre 基因，从而对小鼠的基因型进行综合判断。图3B为取小鼠后肢膝关节常规石蜡切片，经煮沸法抗原修复后，用鼠抗ZBTB20单克隆抗体标记孵育，然后用相应的荧光素标记的二抗孵育，漂洗后封片，在荧光显微镜下观 察染色结果。结果显示，CZBO敲除小鼠的软骨区域未见明显阳性信号，图示红色为ZBTB20 强阳性信号。结果说明该动物模型的建立是成功的。实施例3ZBTB20基因敲除小鼠的生化指标的变化测定ZBTB20软骨特异性剔除小鼠的体重和尾长，身长等生理指标分析结果，并与 对照(野生型小鼠)相比。测定的小鼠视情况分性别进行统计分析。结果如图4所示，与对照组相比，基因敲除小鼠的体重无明显改变、尾巴较短(P < 0. 01)。实施例4ZBTB20敲除小鼠的IGF-I分泌水平的变化qPCR分析原代软骨细胞内IGF-lmRNA变化，P < 0. 05，见图5。实施例5ZBTB20敲除小鼠软骨形态结构特征变化和细胞数目变化分析对ZBTB20敲除小鼠(CZB20K0)和野生型小鼠(对照)的膝关节软骨组织进行HE 染色和阿尔辛兰染色检查。见图6A、图6B、6C和图6D。结果显示，ZBTB20软骨细胞特异性敲小鼠CZB20K0的 软骨细胞形态和结构无显著性改变，但是整体上软骨生长板显著性增粗、肥大区增宽，3月 龄小鼠生长板结构排列不规则。这表明ZBTB20软骨细胞敲除小鼠在软骨发育方面存在异
堂
巾οBrdU掺入法监测小鼠软骨细胞增殖情况差异。结果见图6E，结果显示ZBTB20软 骨细胞特异性敲小鼠CZB20K0的软骨细胞增殖能力较同窝对照小鼠显著性增强。这表明 CZB20K0小鼠软骨细胞增殖能力变强。利用胶原酶消化法，分离CZB20K0和对照小鼠的肋软骨的软骨细胞，进行细胞计 数并作配对t-test统计学处理，结果见图6F。结果显示，与对照小鼠相比，CZB20K0小鼠的软骨细胞数量显著性增多(P < 0. 001)。这间接表明软骨细胞的增殖能力强。实施例6筛选方法以分离的原代软骨细胞为受试对象，检测候选物质刺激前后的细胞中内源性 ZBTB20的表达情况，利用定量PCR和抗ZBTB20抗体的免疫印迹检测，分析处理后细胞 ZBTB20，利用ELISA方法检测细胞培养上清中IGF-I等生长因子分泌水平的变化。测试组添加候选物质的软骨细胞培养物；对照组不添加候选物质的软骨细胞培养物。如果与对照组相比，测试组中的软骨细胞中ZBTB20的表达减弱，则说明该候选物 质是可以降低ZBTB20表达，从而促进哺乳动物软骨细胞增殖的物质。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各 种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
一种锌指蛋白ZBTB20或其抑制剂的用途，其特征在于，用于制备促进哺乳动物软骨细胞增殖的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还可用于防治哺乳动物软骨 细胞的过度增殖。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的锌指蛋白ZBTB20选自(i)SEQID 1所示的氨基酸序列；或(ii)将SEQID NO :1所示的氨基酸序列经过一系列的取代、缺失或添加而形成的，且 能够促进哺乳动物软骨细胞的增殖的由(i)衍生的蛋白。
4.一种锌指蛋白ZBTB20的用途，其特征在于，用于筛选促进哺乳动物软骨细胞增殖的 物质。
5.一种筛选促进哺乳动物软骨细胞增殖的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法 包括(a)将候选物质与含有锌指蛋白ZBTB20的体系接触；(b)观察候选物质对于ZBTB20表达活性的影响；其中，若所述的物质能够抑制锌指蛋白ZBTB20的表达或者活性，则表明该候选物质是 促进软骨细胞增殖的潜在物质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括在测试组中，将候选物质加 入到含有锌指蛋白的体系中；和/或步骤(b)包括检测测试组的体系中ZBTB20的表达或者活性，并与对照组相比较，其中 所述的对照组为不添加所述候选物质的含有锌指蛋白ZBTB20的体系；如果测试组中锌指蛋白ZBTB20的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该物质 是促进软骨细胞增殖的潜在物质。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步 的细胞实验和/或动物实验，以选出对促进软骨细胞增殖的物质。
8.一种锌指蛋白ZBTB20基因敲除啮齿类动物的用途，其特征在于，用于作为研究骨骼 发育的模型。
9.一种锌指蛋白ZBTB20或其编码基因的用途，其特征在于，用于制备诊断骨骼发育不 良的试剂或试剂盒。
10.一种体外或者体内调节软骨细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括抑制软 骨细胞中锌指蛋白ZBTB20的表达或活性。
全文摘要
本发明为一种ZBTB20在软骨细胞中特异性基因剔除小鼠模型及用途，属于基因技术领域，更具体地，本发明涉及一种锌指蛋白的功能及用途。本发明公开了一种锌指蛋白ZBTB20的用途，用来制备促进或者抑制哺乳动物软骨细胞增殖的组合物。本发明还公开了基于所述锌指蛋白ZBTB20为靶点，筛选用于促进或者抑制哺乳动物软骨细胞增殖的方法。本发明首次提示锌指蛋白ZBTB20在调节软骨细胞增殖方面具有重要的作用，从而为软骨发育相关疾病的研究提供了有效的靶点。
文档编号C12Q1/68GK101940780SQ20101022287
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者卢银忠, 周光迪, 张海, 章卫平, 谢志芳, 麻献华 申请人:中国人民解放军第二军医大学