专利名称：获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种获得源于同一动物祖细胞分裂的同步化干细胞的技术，特别是涉及一种在体(ex vivo)获得源于同一人类祖细胞分裂的同步化干细胞的技术。
研究成果表明，可以利用各种来源的干细胞，来治疗衰老、外伤、遗传性及代谢性疾病，具有良好的临床应用前景。干细胞通过体外克隆培养和定向诱导，可以成为①合适的细胞移植材料，用于修复受损器官；②干细胞作为转基因载体，用于转基因治疗；③利用干细胞移植治疗人类顽症如骨髓干细胞或脐带血干细胞移植治疗白血病等。干细胞系的建立必需满足二个基本条件在细胞周期内复制可获得大量子代细胞，即具有永生化特性(immortality)；细胞系必需保持原始细胞的世系遗传显型特征。目前研究首先要解决的问题是如何获得可用于临床应用的干细胞系，并能够在体外扩增。
目前，有关干细胞的研究状况如下1.人类胚胎干细胞研究进展从1996年Dolly羊的诞生到人类首次克隆灵长类动物恒河猴Tetra的出世，克隆人体器官不再是幻想。研究的中心围绕胚胎干细胞的获得技术。Dolly采用的是体细胞核移植无核卵细胞的技术，恒河猴Tetra个体是用形成8个细胞的胚胎分离成4个各有2个细胞的胚，植入“代理母亲”子宫而诞生的。国外著名的Wisconsin大学James A.Thomson领导的实验室1998年首次在人类早期胚泡(blastocyst stage)分离出14个细胞的内细胞群(inner cell masses)，并培养出5个胚胎干细胞系，其中H1，H13，和H14为正常XY染色体组型(normal XY karyotype)，H7和H9为正常XX染色体组型(见1998年11月6日的《科学》杂志，1145页)。Hopkins大学John D.Gearhart领导的实验室从人类胚胎的卵巢和睾丸碎片中培养分离出胚胎干细胞。随着胚胎干细胞的研究进展，促使胚胎干细胞按人们的需要，诱导分化为各类组织细胞，如有节律跳动的心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞、皮肤成纤维细胞、软骨细胞及内皮细胞等。胚胎干细胞具有分化各种细胞的潜能，但最困扰的问题仍是如何操纵分化。华盛顿大学医学院的Gortlieb用维生素A的衍生物视黄酸处理小鼠胚胎干细胞，通过激活神经元基因，抑制其它分化路径的细胞中基因的表达，成功地诱导胚胎干细胞衍生为神经细胞。随着克隆技术的发展，利用人胚胎干细胞，克隆人各类干细胞系或人体器官将可能实现，但仍存在伦理的重大社会问题。
2.成人干细胞的研究如上所述人胚胎干细胞的研究面临尖锐的伦理道德和法律方面的问题，研究开发成人干细胞便成为目前研究的热点。研究发现成年动物体内的许多组织含有干细胞，据最新文献报道成年哺乳动物视网膜中有神经干细胞存在，它可以分化为视杆细胞、双极细胞和胶质细胞，使成年哺乳动物视网膜具有一定的再生修复能力(见2000年3月17日的《科学》杂志，2032页)。而且，近期研究发现有些成人干细胞有着惊人的可塑性，可以被诱导回到它们未分化的状态，并可重新分化为各种完全不同的细胞或组织类型，比如，大脑中的神经干细胞可产生出血液细胞(见1999年1月22日的《科学》杂志，534页)。人们对成年个体的组织器官中发现干细胞并对这些干细胞进行诱导、分化、应用、抱有很大的希望。尽管如此，由于人类成人干细胞的数量极少，终末分化的功能细胞是主体，因此，获成人干细胞并建立干细胞系更有难以想象的或不可克服的困难。
3、干细胞的研究技术国外已有多种技术路线建立干细胞系①来自神经管和神经嵴派生的祖先细胞建立细胞系。②从自然发生肿瘤细胞中分离细胞系，如由Augusti-Tocco和Sato，Schubert等(1969)建立的小鼠神经母细胞瘤(mouse neuroblastomaC1300)，人类大脑皮质瘤也建立了具有神经元特性的细胞系(Ronnett et.al，1990).。③利用X-rays或化学诱导剂诱导肿瘤细胞，建立分离神经细胞系，如被广泛应用的PC12细胞系是由X-rays诱导建立(Greene and Tischler，1976)。④用逆转病毒载体或腺病毒载体携带原癌基因特异转染神经前体细胞(neuralprecusor)建立细胞克隆。⑤建立携带含神经元特异启动子的原癌基因构件的转基因小鼠。⑥利用原代神经元与神经肿瘤细胞系杂交，建立永生化神经细胞系(Greene et.al，1975Choi et.al，1991)。⑦采用原代中枢神经无血清培养，表皮生长因子(EGF)刺激，获永生化细胞克隆(Reynolds and Weiss，1992；Ray et.al，1993)。⑧利用胚胎干细胞定向诱导建立神经干细胞系，如Gottlieb(in Washington University)用retinoic acid诱导神经元样细胞。⑨目前最新研究动态关注，与调控细胞寿命有关的染色体末端DNA重复序列，即端粒(telomere)。少数细胞每一次分裂增殖后，由端粒酶(telomerase)重建端粒，保持细胞永生化。上述技术尽管可获得干细胞，但有些技术涉及胚胎干细胞的有伦理问题、有些细胞系与癌变细胞不易划分、利用病毒载体转染目的基因获得的干细胞有临床使用安全性问题等，人们期望一项技术可获得临床能应用的干细胞系。
4、目前国内研究状况在我国干细胞领域的研究逐渐受到多个学科的重视。在本年度国家自然科学基金项目中，细胞生物学学科和发育生物学学科将胚胎干细胞系的建立及定向诱导研究作为重点资助项目；神经科学学科将神经干细胞的分化调节研究作为鼓励研究领域。国内研究已涉及皮肤、软骨及神经系统损伤的人体组织工程的研究。造血干细胞的移植已拯救许多患白血病患者的生命。
目前国内研究的状况为以上海市转基因研究所和上海第二医科大学的成国祥博士、盛惠珍教授和曹谊林教授为代表的利用人胚胎干细胞的技术路线，分化人类特定的组织器官，如皮肤、软骨心脏、肝脏等，但该方法存在伦理问题。北京中科院系统以陈大元教授为代表的克隆国宝大熊猫为国家重大课题。昆明中科院系统以灵长类克隆为主要特色。西北农业科技大学农业部开放实验室以畜牧业为主要研究方向。目前全国许多有实力的或地方特色(如昆明有多种灵长类动物)的实验室，都在积极开展该项研究。
本发明的目的是提供一种获得源于同一动物祖细胞的各类同步化干细胞群的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，该方法是将动物的祖细胞注入呈全身免疫缺陷状态的哺乳纲啮齿目鼠科动物的体内，所述祖细胞在鼠科动物的脾内分裂增殖，然后经在鼠科动物体内的同步化处理，得到由同一祖细胞分裂的干细胞群。
本方案的祖细胞可以取自于人体，并以3-6个月的胎儿为优，也可以取自动物体组织细胞。
所述祖细胞注入鼠科动物的血液内，并以自鼠科动物的尾静脉注入为佳。
所述同步化处理为尾静脉或腹腔注射细胞分裂抑制剂。同步化处理后处死鼠科动物，取鼠科动物的脾，分离出由同一祖细胞分裂的干细胞群。
本发明利用造成全身免疫缺陷的小鼠，将小鼠脾脏做为受体(干细胞生物孵化器)，获得源于同一人类祖细胞分裂的干细胞，如人类神经细胞、心肌细胞、心房细胞、皮肤细胞、肾上腺细胞等，而且人类的祖细胞可以取自妊娠3个月以上的胎儿以及出生后的人体组织细胞，避开了由于伦理问题引起的矛盾，同时还可以获得源于其它动物的同一祖细胞分裂的干细胞。祖细胞的来源也可以是多样化的。可为科研和临床应用提供所需的干细胞系。
利用本发明的技术可获得大量源于同一人祖细胞(如神经元、皮肤上皮细胞、心肌细胞)分裂的处于同步化(细胞处于分裂中期)的一群细胞。一般情况体外培养细胞群中的每个细胞各自处于细胞周期的不同阶段。其中只有少数细胞在进行着有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S、和G2各时期。因此，人们需要将这些细胞共同进入细胞周期，即细胞同步化(synchronization of cells)，使细胞的形态和功能处于相似状态，便于利用。采用本发明技术可获得源于同一动物，特别是人祖细胞分裂的同步化干细胞群，利用这些细胞可更容易建立人的各类干细胞系，更易作为携带各类目的基因的工程细胞用于人类细胞的各种研究和临床治疗，如作为转基因治疗载体和损伤修复的材料等，有着重要的临床应用及科学研究价值。进一步的研究将是确定转基因成功后，利用脾集落细胞结节制备的悬浮细胞，可生产用于研究或临床的带有目的基因的各种人的干细胞系。利用本发明技术获得的同一祖细胞分裂的细胞群，在转基因条件下，体外筛选、纯化、细胞克隆，建立携带目的基因的干细胞系。利用本发明技术获得的同一祖细胞分裂的细胞群，在不转基因条件下，体外培养获细胞克隆，建立干细胞系。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为接种人大脑皮质细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节图2为分离培养第一天的人大脑皮质细胞脾集落细胞图3为接种人大脑皮质细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗人神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性标记细胞图4为接种渗入BrdU人大脑皮质细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体免疫组织化学阳性标记细胞核图5为接种人大脑皮质细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节HE染色图6为接种人脑海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节图7为分离培养第一天的人大脑海马细胞脾集落细胞图8为分离培养第一天的人大脑海马细胞脾集落细胞图9为接种人海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗人神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性标记细胞
图10为接种渗入BrdU人海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体免疫组织化学阳性标记细胞核
图11为接种人海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节HE染色
图12为接种人心室肌细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节
图13为接种人心室肌细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节
图14为分离培养第一天的人心室肌细胞脾集落细胞
图15为接种人心室肌细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗人结蛋白单克隆抗体免疫组织化学阳性标记细胞
图16为接种渗入BrdU人心室肌细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体免疫组织化学阳性标记细胞核
图17为接种人心室肌细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节HE染色
图18为接种人皮肤上皮细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节
图19为接种人心房肌细胞后形成的大鼠脾集落细胞结节图20为接种人肾上腺细胞后形成的大鼠脾集落细胞结节图21为接种Westar大鼠脑细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节实施例1由人大脑皮质祖细胞分裂获得同步化干细胞1、受体动物的全身免疫抑制状态受体同系LACA小鼠，成年，体重26g±，全身亚致死剂量照射(Co60，2.5G)和免疫抑制剂(环孢素10mg/Kg/day)联合使用，造成全身免疫抑制状态后，以接种分离培养祖细胞。
2、祖细胞分离培养引产胎儿4个月，分离培养大脑皮质细胞，DMEM培养基＋10％胎牛血清，渗入5-溴尿嘧啶(BrdU，终浓度10ng/ml)，CO2，37℃培养过夜。
3、祖细胞接种1000rpm 5min收集渗入BrdU的培养的大脑皮质细胞，制备细胞悬液。自全身免疫缺陷的LACA小鼠尾静脉注射入所制细胞悬液0.5ml(1×108以上细胞数)，接种免疫抑制状态受体同系LACA小鼠。
4、在体(exvivo)细胞同步化饲养接种人大脑皮质细胞的免疫抑制状态受体同系LACA小鼠9-11天，尾静脉注射秋水仙胺0.1μg/ml营养液，0.1ml，2小时。
5、分离培养源于同一祖细胞分裂的干细胞群同步化后，LACA受体小鼠颈椎脱臼处死，取脾，如
图1所示，可见脾呈现凹凸不平结节样脾集落细胞结节1。①取材解剖镜下剥离出脾集落细胞结节入D-Hanks液＋氨苄青霉素液。
其中D-Hanks液的配方为NaCl8gNaHCO33.5gKCl 0.4gKH2PO40.06gNa2HPO4.12H2O 0.12gH2O 1000ml②消化锐利刀剪切碎脾集落结节，用0.125％胰酶消化，37℃，10min。③离心加DMEM缓冲液，1000rpm离心5min，去上清液，制备细胞悬液(1～9×106)。④培养DMEM＋10％胎牛血清CO2，37℃培养，如图2所示，可见正在分裂的细胞2。(采用流式细胞分选计，根据细胞的物理特性，使大小细胞分开，去除人脾集落细胞结节制备的悬浮细胞中的小鼠脾细胞。《组织培养和分子细胞学技术》鄂征主编，北京出版社)6、转染目的基因构建工程干细胞系利用分离的人脾集落细胞结节中的大脑皮质细胞干细胞群有大量分裂细胞的特性，进行①E6E7重组逆转病毒转导人脾集落细胞结节制备的悬浮细胞；②采用FuGene 6TM转染试剂盒转染SV40 Large T抗原质粒DNA转染人脾集落细胞结节制备的悬浮细胞。用RT-PCR方法测定基因的转导和转染。
7、细胞鉴定脾集落细胞的鉴定方法取材固定解剖镜下取带脾集落细胞结节的受体LACA小鼠脾入4％多聚甲醛(磷酸盐缓冲液配制，pH7.4)固定，4℃过夜，入10％-30％蔗糖4℃保存。
脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片梯度酒精(50％、70％、80％、90％、95％、100％)脱水入二甲苯，浸蜡(56-58℃)后石蜡包埋，石蜡切片，厚6μm切片裱在玻璃载片上，烤干，4℃保存待用。
脱蜡、免疫组织化学染色鉴定二甲苯脱蜡，梯度酒精(100％、95％、80％、70％、50％)入磷酸盐缓冲液(pH7.4)，进行免疫组织化学染色。如图3所示，为鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体鉴定人皮质细胞脾集落细胞结节3。
如图4所示为接种人大脑皮质细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗人神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性标记细胞4。
上述抗体购于北京中山生物技术有限公司代理美国Santa Cruz公司单克隆抗体，免疫反应按购买抗体携带程序进行，呈色为ABC法。
8、苏本精-伊红(HE)染色常规HE染色观察脾集落细胞结节的形态特征。
如图5所示为接种人大脑皮质细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节5HE染色，示脾集落细胞结节5。
实施例2由人海马祖细胞分裂获得同步化干细胞1、受体动物的全身免疫抑制状态受体纯系小鼠c57，成年，体重26g±，全身亚致死剂量照射(Co60，2.5G)和免疫抑制剂(环孢素10mg/Kg/day)、抗淋巴细胞抗体联合使用，造成全身免疫抑制状态后，以接种分离培养细胞。
2、祖细胞分离培养引产胎儿6个月，分离培养海马细胞，培养条件同实施例1。
3、祖细胞接种条件与实施例1相同4、在体(ex vivo)细胞同步化饲养接种人大脑皮质细胞的免疫抑制状态受体纯系小鼠c579-11天，腹腔注射秋水仙素0.5-1μg/ml营养液，0.2ml，2小时。
5、分离培养源于同一祖细胞分裂的干细胞群同步化后，纯系小鼠c57受体小鼠颈椎脱臼处死，取脾，如图6所示，可见脾呈现凹凸不平结节样脾集落细胞结节6。操作的具体过程同实施例1，在用DMEM＋10％胎牛血清CO2，37℃培养时，如图7、图8所示，可见正在分裂的细胞7、8。
6、细胞鉴定方法同实施例1，如图9所示，为鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体鉴定人海马细胞脾集落细胞结节9。
如
图10所示为接种人海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗人神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性标记细胞10。
7、苏本精-伊红(HE)染色
常规HE染色观察脾集落细胞结节的形态特征。
如
图11所示为接种人海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节5HE染色，示脾集落细胞结节11。
实施例3由人心室肌细胞分裂获得同步化干细胞1、受体动物的全身免疫抑制状态受体纯系小鼠BALB/C小鼠，成年，体重26g±，全身亚致死剂量照射(Co60，2.5G)和免疫抑制剂(环孢素10mg/Kg/day)、抗淋巴细胞抗体联合使用，造成全身免疫抑制状态后，以接种分离培养细胞。
2、祖细胞分离培养引产胎儿5个月，分离培养心室肌细胞，培养条件同实施例1。
3、祖细胞接种条件与实施例1相同4、在体(ex vivo)细胞同步化饲养接种人心室肌细胞的免疫抑制状态受体纯系小鼠BALB/C9-11天，腹腔注射胸腺嘧啶-2mmol/L，0.2ml，18-20小时。
5、分离培养源于同一祖细胞分裂的干细胞群同步化后，受体纯系BALB/C小鼠颈椎脱臼处死，取脾，如
图12、13所示，可见脾呈现凹凸不平结节样脾集落细胞结节12、13。操作的具体过程同实施例1，在用DMEM＋10％胎牛血清CO2，37℃培养时，如
图14所示，可见正在分裂的细胞14。
6、细胞鉴定方法同实施例1，如
图15所示，为鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体鉴定人心室肌细胞脾集落细胞结节15。
如
图16所示为接种人海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节鼠抗人神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性标记细胞16。
7、苏本精-伊红(HE)染色常规HE染色观察脾集落细胞结节的形态特征。
如
图17所示为接种人海马细胞后形成的小鼠脾集落细胞结节5HE染色，示脾集落细胞结节17。
实施例4由成人皮肤上皮细胞分裂获得同步化干细胞实验的过程与实施例1相同，只是祖细胞取自成人的正常皮肤。如
图18所示，可见实验同系小鼠LACA脾呈现凹凸不平结节样脾集落细胞结节18。
实施例5由人心房肌细胞分裂获得同步化干细胞实验的过程与实施例1相同，只是祖细胞取自6个月胎儿的心房肌细胞，受体鼠为纯系大鼠LEW(造成全身免疫缺陷状态及细胞同步化的剂量要相应增大)。如
图19所示，可见实验纯系大鼠脾呈现凹凸不平结节样脾集落细胞结节19。
实施例6由人肾上腺细胞分裂获得同步化干细胞实验的过程与实施例1相同，只是祖细胞取自6个月胎儿的肾上腺细胞，受体鼠为纯系大鼠LEW，(造成全身免疫缺陷状态及细胞同步化的剂量要相应增大)。如图20所示，可见实验纯系大鼠脾呈现凹凸不平结节样脾集落细胞结节20。
实施例7由Westar大鼠脑细胞分裂获得同步化干细胞实验的过程与实施例1相同，只是祖细胞取自Westar大鼠13天胚胎的脑细胞。如图21所示，可见LACA受体小鼠脾呈现凹凸不平结节样脾集落细胞结节21。
权利要求
1.一种获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于该方法是将动物的祖细胞注入呈全身免疫缺陷状态的哺乳纲啮齿目鼠科动物的体内，所述祖细胞在鼠科动物的脾内分裂增殖，然后经在鼠科动物体内的同步化处理，得到由同一祖细胞分裂的干细胞群。
2.根据权利要求1所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述祖细胞取自人体组织细胞。
3.根据权利要求2所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述祖细胞取自3-6个月的引产胎儿。
4.根据权利要求2所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述祖细胞为成人的皮肤细胞。
5.根据权利要求1所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述祖细胞取自动物体组织细胞。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述祖细胞注入鼠科动物的血液内。
7.根据权利要求6所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述祖细胞自鼠科动物的尾静脉注入。
8.根据权利要求1-5中任何一项所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述同步化处理为尾静脉或腹腔注射细胞分裂抑制剂。
9.根据权利要求1所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述细胞分裂抑制剂为秋水仙胺。
10.根据权利要求1所述的获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术，其特征在于所述同步化处理后处死鼠科动物，取鼠科动物的脾，分离出由同一祖细胞分裂的干细胞群。
全文摘要
本发明公开了一种获得源于同一动物祖细胞的同步化干细胞的技术,该方法是将动物的祖细胞注入呈全身免疫缺陷状态的哺乳纲啮齿目鼠科动物的体内,所述祖细胞在鼠科动物的脾内分裂增殖,然后经在鼠科动物体内的同步化处理,得到由同一祖细胞分裂的干细胞群,祖细胞可以来自于人体,也可以来自于其它的动物体;利用本发明的技术可获得大量源于同一人祖细胞分裂的处于同步化(细胞处于分裂中期)的一群干细胞,有着重要的临床应用及科学研究价值。
文档编号C12N5/06GK1334339SQ0012100
公开日2002年2月6日 申请日期2000年7月14日 优先权日2000年7月14日
发明者沈丽, 南燕, 王淑玲, 王珂 申请人:北京大学