专利名称：识别、定位干/祖细胞及研究其再生动力学的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及成体干/祖细胞领域，具体而言，它涉及一种对正常组织和组织受 到损伤后从中激活的干/祖细胞进行有效识别、定位并研究其或子代的再生动力学的方 法，更具体地，它涉及采用可掺入细胞DNA的标记以长期识别和定位所有组织中的干/ 祖细胞或其子代并研究它们在体内的动力学行为特征，本发明也特别涉及一种清除所有 组织内原先存在的增殖性细胞，进而激活其中干/祖细胞并对激活的干/祖细胞进行识 别、定位的方法，更具体地，采用具有清除所有组织内原先存在的增殖性细胞作用的试 剂，然后加入可掺入细胞DNA的标记以识别从受损组织中激活的干/祖细胞或其子代， 从而进一步对所述细胞进行定位，其中包括研究其或子代细胞再生受损组织的动力学的 方法，其中，它也涉及以已知或未知的分子标志物进一步筛选所述干/祖细胞群及其子 代，尤其，涉及进一步长期追踪和定位所述激活的干/祖细胞或其子代的方法和它们在 例如研究、治疗、诊断方面的潜在应用。
背景技术：
干细胞是未特化的细胞，被称为生命的“种子细胞”。近年来，干细胞生物学 在基础和应用研究方面得到了飞速发展，已吸引多国科学家对干细胞基础研究及其用于 临床治疗展开广泛深入的研究，期间取得了可喜的进展。干细胞具有下述特性相对来说，它们是未分化的，具有强大的增殖潜能并负 责组织的长期稳态维持(maintenance)及组织损伤后再生；它们一般是慢周期的，很可能 保护其自身增殖潜能并在复制时把DNA错误降至最低；它们在受到损伤刺激或特定的生 长刺激后会进入增殖状态；它们常常与一群迅速增殖细胞，也即短暂增殖细胞，紧密定 位在一起，形成干细胞，短暂增殖细胞和终末分化细胞的解剖结构；最后，它们通常处 于特定的位置，即干细胞小生境(niche)，也有人称之为区室或微环境内，在那里受到很 好的保护。基于它们的潜能，干细胞可被细分和分类为下面三个类型第一种是，可生长 为任意类型的全能性干细胞，他们由卵细胞和精细胞融合产生；第二种是，可以分化为 除全能性干细胞以外所有类型的细胞，它们被称为多能性干细胞；而第三种是仅可以产 生一种细胞类型的细胞，这些细胞被称为祖细胞，它们仍具有自我更新的特性，这个特 性使得他们可与非干细胞区分开(KrauseDS等，Cell, 2001.105 369-377 ； ReyaT等， Nature, 2001.414 105-111)。根据它们的来源，干细胞可被分类为胚胎或成年起源的，胚胎干细胞具有分化 为所有类型细胞，包括精细胞的潜能，且在白血病抑制因子(LIF)等因子和存在合适培 养基的条件下，表现出无限增殖的能力(Wagers AJ等，Cell，2004.116(5) 639-648)。 虽然研究长久且具有较大的应用前景，然而，由于胚胎干细胞研究一直是争议颇大的领 域，其获取和应用存在伦理局限问题，因此，从成体中直接获得干细胞具有重大的意 义。
一般认为，成体干/祖细胞存在于特定组织的分化细胞中，具有未分化的特 征。它们负责成体组织或器官的稳态维持及其损伤后再次动员从而使受损的组织恢复到 原先的稳态，即再生(Morre KA 等，Scinece, 2006.311(5769) 1880-1885)，大多数是 多能性的，能生成几种、但有限数目的细胞类型。有人也把它们称为组织干细胞或体干 细胞。它们的分裂、分化和/或增殖在组织中以受控的方式进行，这些细胞可以生成所 有特化的局限于所在组织的细胞类型(WagersAJ等，Cell，2004.116(5) 639-648)。成体干细胞由于其所具有的修复、替代和再生能力，也逐渐为临床医学提供了 一个发展新疗法的机会。它可作为临床细胞治疗、药物筛选、人工组织的“种子库”， 在肿瘤、创伤修复、组织或器官功能重建、各种退行性疾病的治疗等方面发挥重要的作 用。现如今，肿瘤的治疗在临床上仍是世界难题，常规使用的方法(包括放、化疗)虽 然已取得一定的进展，但总的疗效并不令人满意，给患者带来极大痛苦，且对恶性肿瘤 的疗效仍不理想。目前癌症研究领域的一个研究热点是癌干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)。早期由多伦多大学的分子生物学家John Dick研究者提出“癌干细胞”理论 (John Dick等，Nature，1994.17 645-648),这一新理论表明，癌症的发生及难于根治 的在于其内癌干细胞(CSCs)的存在，随后的多个癌症研究中的研究结果认可了此理论 (ReyaT等，Nature，2001.414 105-111)，源自其他组织的进一步研究证实了癌干细胞 是存在的，他们在例如血液、乳腺、脑组织、肺组织和肠组织(Ai-Hajj M等，PNAS， 2003.100 3938-3988) ； He 等，Nat Genet，2007.39 189-198; Kim CF 等，Cell， 2005121 823-835 ； Lapidot T 等，Nature，1994367 645-648; Ricci-Vitiani L 等， Nature, 2006 ； Singh SK 等，Nature，2004432 396-401 ； Yilmaz OH 等，Nature, 2006.441 475-482 ； Zhang J 等，Nature, 2006.441 518-522 ；)中存在。“癌干细 胞”的提出给肿瘤的治疗带来曙光，因而，如果能够识别癌干细胞及其所处的小生境(微 环境(定位))将具有及其重要的临床意义，例如通过靶向癌干细胞从而治愈肿瘤等，将 产生重大的应用价值和经济效益。然而，遗憾的是，现在尚没有很有效的方法从肿瘤组 织中识别、分离出癌干细胞，这也意味着在治疗中，不可能准确而彻底地清除掉癌干细 胞。这大大阻碍了针对肿瘤的有效治疗。另外一个具有前景的应用在于其可用于基因治疗(Nathalie Cartier等，Science，
2009.326(5954) 818-823)，干细胞作为基因治疗的载体、使用产生的自体经修饰后的 干细胞直接施用给患者，其中一个益处是减少移植时引起的免疫排斥。目前成体中研究的最为详尽的干细胞是_造血干细胞，在过去近40年里一直 是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为 所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复，相应的骨 髓移植治疗血液性疾病，例如白血病等也已开展多年，一定程度上解除了患者的痛苦。 另外两个目前研究较为深入、具有代表性的干细胞研究是表皮干细胞和小肠干细胞，虽 然通过小鼠遗传学标志谱系试验等实验，结合所发现的分子标志物，例如Musashi-1、 Lgr5 等提供 了鉴定干细胞的可能(BarkerN 等，Nature, 2007.449(7165) 1003-1007 ； HaegebarthA 等，AmJPathol，2009.174(3) 715-721)，然而它们的有效性还有待进一步 证实。再者，成体干细胞研究的基础和其在临床上应用先决条件和最关键条件之一在于对干/祖细胞的有效识别、定位。当前，虽然在少数几个快速更新的组织例如小肠、 表皮等组织中识别、定位了潜在的干细胞，然而现如今仍缺少普遍且有效的方法用于识 别和定位所有组织，尤其是缓慢更新的组织中的干细胞。因而从组织或混合的细胞群中 识别、定位真正的干细胞是筛选、分离，后续功能的深入研究及应用研究的重要前提， 因而获得真正的干/祖细胞有助于细胞移植治疗的效力。当前，虽然有多个研究小组采用分子标志物筛选候选的干细胞，例如 Thy-llow 或 FLK2TJneage、ca-rc-Kit+ 分选造血干细胞群(ChristemsenJL 等，PNAS， 2001.98 14541-14546 ； UchidaN 等，Experimental hematology，1996.24 649-659)， 用 a 6b"10G7dim(LiA 等，PNAS，1998.95 (7) 3902—3907; Tani H 等，PNAS， 2000.97(20) 10960-10965 ； LavkerRM 等，PNAS, 2000.97(25) 13473-13475)识别 人类、啮齿动物来源的上皮干细胞，但仍缺少特异性用于鉴定干细胞的免疫学和生物学 标志物，因此同质干细胞的鉴定、分离及纯化就具有一定的困难。又有其他研究者发展其他方法以用于识别、定位和研究成体干细胞。早期的 研究表明，单次给予标记DNA合成前体类似物(脉冲)后，如氚标记胸腺嘧啶核苷 (3H_TdR)或5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)，干细胞几乎不会吸收此标记，这个重要特性 表明它一般处于慢周期状态，很难通过一次的脉冲给予得到标记。然而，在适当的信 号刺激后，干细胞可被诱导至活化状态，它进行增殖和分化，从而形成或再生组织，此 时，当干细胞偶尔进行细胞分裂时，如果再次进行单次脉冲标记，干细胞所产生的大多 数的迅速增殖的短暂增殖性细胞将会融合此标记。最后，短暂增殖细胞在后续的分裂过 程会把此标记稀释到不可检测水平(Bickenbach JR, J Dent Res, 198160 (Spec No C) 1611-1620)。随后的研究进一步发现，干细胞的标记需要给予连续的脉冲标记物，一旦 其被标记，他们在后续的追踪时期将会在一定时间内长期保留标记，这些可长期保留标 记的细胞被称为标记保留细胞(label retaining cells, LRCs) (Bickenbach JR 等，J Invest Dermatol, 1984.82(6) 618-622)。虽然，此后又有多个研究者声称，在其他成体组织内发现有标记保留细胞的 存在，但是，各个实验室在标记的方法、时间选择以及剂量等方面互不相同，采用了 不同的标记方法研究组织中的标记保留细胞(DuvillieB等，Diabetes，2003.52(8) 2035-420 ； Oliver JA 等，J Clin Invest, 2004.114(6) 795-804 ； Smith GH 等， Development, 2005.132(4) 681-7; Shinin, V 等，Nat Cell Biol，2006.8 677-687; ChanRW 等，Stem cells，2006.24(6) 1529-1533; Urbanek K 等，PNAS，2006.103 9226-9231)。上述文献研究的不足之处是，这些方法不具有统一性，且没有确切的证据 支持他们所追踪的标记保留细胞可以长期保留标记，且其是否具有功能特性例如再生受 损组织的功能尚不明确。因此，人们需要新的方法来统一对所有成体组织中的真正干/ 祖细胞群进行有效的识别和定位。此外，有一些研究者采用机械或酶消化分离的方法，结合已知的一些分子标 志物，希望从成体组织中直接分离出干/祖细胞，从而进行鉴别和后续的功能研究 (AzumaH 等，Hepatology，2003.37(6) 1385-1389; WrightN 等，Biochem Biophys Res Commun, 2008.366(2) 367-372)。然而，不足之处是，这些分离的细胞群并不是同质 类型的，而是由许多不同分化状态或增殖能力的混合细胞群组成，非常不纯。
另外，有其他研究者采用对组织造成损伤的方法以研究干细胞，希望激活那些 处于静息或慢周期的干细胞。不幸的是，目前没有令人信服的证据表明文献中已报道的 方法能够激活真正的干细胞，要么损伤的方法所激活的类干细胞的时间太长，有些需要 长期加入药物，这样做的一个不利之处在于很可能导致癌症的发生，满足不了后续临床 的需要，而且，不同的研究人员采用的损伤方法各异，不具有统一性，尚没有一种可用 于从所有组织中激活干细胞并对其进行识别的方法出现。此外，有研究者基于干细胞的功能特征，例如耐受药物或其他试剂的处理，报 道了用于激活干细胞的方法，(GordonMY 等，Leukemia research，1985.9 1017-1021 ； BerardiAC 等，Science, 1995.267 104-108 ； Sharkis SJ 等，Stem cells, 199715 (Suppl 1) 41-44 ； JuopperiTA 等，Experimental hematology，2007.35 335-341)，且用一些分 子表面标记物分离这些细胞，然而，不足之处，一方面在于是他们所使用的分子标记仍 没有很强的特异性，且其中仍不清楚是否混杂有其它分期的祖细胞以及原先存在的增殖 细胞，很可能其中仍是一个异质细胞群(Berardi AC等，Science, 1995267 104-108)， 更重要的是，没有进一步采用可靠且普遍有效的方法用于识别这些激活的干细胞及其在 损伤后的定位和研究其体内再生动力学行为。据此，本领域需要克服现有技术中所存在的缺点，为了克服上述方法上的不足 及提供进一步相关的优点，本发明人建立了用于有效识别及定位所有正常组织和组织受 到损伤后从中激活的干/祖细胞的系统方法，并建立了损伤后进一步有效识别激活的干/ 祖细胞或其子代及研究它们再生受损组织的动力学的方法，该方法具有普遍适用性，进 一步，本发明识别的成体干细胞和/或组织干细胞在受损或患病组织的修复中是极其有 用的，进一步，本发明的方法也有益于同质干细胞群的分离、细胞治疗、药物筛选以及 组织工程等多个领域的研究和应用。
发明内容
1.发明概述在一个方面，本发明的一个目的在于，针对现有的识别和定位组织中干/祖细 胞方法技术的不足，提供一种可以有效识别、定位所有成体组织中干/祖细胞的方法及 进一步相关的优点，为干/祖细胞的存在和定位提供直接和确定的方法依据，识别的成 体干细胞和/或组织干细胞在受损或患病组织的修复中是极其有用的，其中也有益于分 别研究各个组织中在内的干/祖细胞的定位、功能、以及进一步有益于随后的筛选、分 离和应用。根据本发明的一个方面，采用可掺入到细胞DNA的标记以识别、定位所有正常 组织中的干/祖细胞群或其子代，并研究其动力学行为，其中，所述干/祖细胞群可以长 期保留标记，其中，所述识别、定位的干/祖细胞群或其子代细胞源自哺乳动物、啮齿 动物的心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、卵巢组织、睾丸组织、胃组织、小 肠组织、肌肉组织、皮肤组织、牙组织、肺组织、神经组织、骨髓组织、脑组织和其他 潜在包含干/祖细胞群的任选组织；进一步，所述哺乳动物也包括人类；其中，所述细胞群的子代细胞也可掺入标记，进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。进一步，采用单克隆抗体或多克隆抗体以特异性鉴定掺入的标记，所述抗体为 免疫球蛋白分子，能够结合靶目标，本发明中指标记，其结合方式是至少识别免疫球蛋 白的可变区的一个抗原位点，本发明所述抗体不仅包括全抗体分子，也包括它们的片 段，例如Fab、Fab’、Fv、单链(ScFv)等，或者它们的突变体，或者是包含抗体部分的 融合蛋白，完全化的或部分化的人源化抗体及任何其他的被修饰的免疫球蛋白分子，所 述免疫球蛋白分子包含一个抗原结合位点。本发明所述的干细胞对于研究的目的也是极其有益的，合适的研究目的的实现 是采用已知或未知的分子标志物进一步识别，筛选、分离所述细胞群或其子代，从而有 益于其在临床治疗、药物筛选、组织工程、器官构建、基因治疗等方面的研究及应用。所述的分子标志如下已知的表面分子，如蛋白质，配体，糖蛋白，CD分子及 其他，未知的可以分离出此细胞群或细胞系或者其后代的表面分子。已知的胞内标志， 如蛋白质，酶；未知的胞内标志，采用这些标志可以分离出此细胞群或细胞系或者其后 代；已知的以及未知的在核内能特异的与此细胞群或细胞系或者其后代染色体相结合的 标志，如蛋白质，DNAs，RNAs,抗体，配体，甲基化和化学试剂，其中，所述的抗体 可以是荧光标记或磁珠富集。在本发明的优选实施方式中，优选的可掺入到细胞DNA的标记是BrdU，标 记的物质也可选择为氚标记胸腺嘧啶核苷(3H_TdR)、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷 (EDU)和其它可以长期标记此述细胞群或细胞系或者其后代的分子。在本发明的优选实施方式中，其中实施方式优选的可掺入到细胞DNA的标记为 BrdU,细胞所保留的标记是BrdU分子，其中所述细胞群或其子代是并且持续是BrdU阳 性(BrdlT)。于新生动物皮下注射BrdU标记，优选的，本发明选用5天至6天大的新生 动物，具体而言，动物优选为小鼠，优选的实施方案和给予剂量是，于小鼠皮下注射标 记，每日两次，连续5天，每次每只给予标记的剂量为50-100mg/kg，此后，追踪标记小 鼠，选取的时间范围为从出生一直延续到衰老期，优选的选取时间点分别为距离第一次 注射标记为2周、2个月、4个月和23个月的时间，所述每个时间点至少入选3只小鼠。 其中，BrdU所标记的干/祖细胞数量为一个或多个干/祖细胞，进一步包括标记所述细 胞群的子代，所述干/祖细胞在追踪一定时间后其数量基本保持不变，不同组织中所述 细胞群达到数量基本保持不变的时间和其所占的比例不一样，其中采用已知的分子标志 物以进一步识别BrdlT标记的细胞群或其子代细胞，其中，包括进一步筛选所述细胞群 表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知或未知的分子或物质从所述哺乳动物、啮 齿动物组织中筛选分离所述细胞群或其子代对研究和应用是非常有益的，均属于本发明 的精神范畴及保护范围。在其中一个优选实施方案中，观察发现肝脏组织中存在长期保留BrdU标记的干 /祖细胞，所述细胞群是BrdlT的，所述被标记的干/祖细胞群在追踪2个月后其数量基 本保持不变，主要分布在大的管状结构周围，其中，包括门管区、中央静脉周围，随着 追踪时间的进一步延长，所述细胞群呈现上升性的分散分布趋势，其中所述细胞群或其 子代表达的分子标志物包括cyclind 3和cdk 6。在其中的另一优选实施方案中，观察发现心脏组织中存在长期保留BrdU标记的干/祖细胞，所述细胞群是BrdlT的，所述被标记的干/祖细胞群在追踪4个月后其数量 基本保持不变，主要分布在在心尖、室间隔和左心室心肌层和心脏血管内皮中，其中， 部分成簇状分布，随着追踪时间的进一步延长，所述细胞群呈现分散分布的上升趋势， 进一步，成体动物心脏组织中存在多种不同亚群的心脏干/祖细胞群，其中，所述被标 记的心脏干/祖细胞群或其子代表达的分子标志物包括，干细胞表面相关抗原Sca-1、 c-Kit。根据本发明的另一个方面，本发明的另一个目的是，提供一种清除原先存在的 增殖细胞，激活并进一步标记所有组织中激活的干/祖细胞的方法，其特征在于，提供 一种有效清除组织中原先存在的具有增殖性的细胞群，从而激活真正干/祖细胞，并进 一步对所述干/祖细胞群或其子代进行长期标记和定位以及研究其再生动力学的方法， 其中所述标记为可掺入到细胞DNA的标记，本发明人发明的这一方法为干细胞的定位和 功能研究以及随后的分离和应用提供了直接和可靠的方法依据。其中，识别的激活干细胞在受损或患病组织的修复中是极其有用的，进一步有 益于随后的筛选、分离和应用。进一步，所述使用的试剂具有清除增殖性细胞并激活干/祖细胞群的作用，其 中包括已知的用于肿瘤化疗的化疗试剂或药物的一种或多种组合，应当理解，本发明所 述的清除组织中原先存在的增殖性细胞的试剂不仅仅包含已知的用于肿瘤化疗的化疗试 剂或药物，任何其他潜在的具有清除组织中原先存在的增殖性细胞的试剂或物质均包含 在本发明中。进一步，所述使用的试剂或物质不能具有清除静息的或未经历分裂的细胞的作用。进一步，所述识别、定位的干/祖细胞群或其子代细胞源自哺乳动物、啮齿动 物的心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、卵巢组织、睾丸组织、胃组织、小肠 组织、肌肉组织、皮肤组织、牙组织、肺组织、神经组织、骨髓组织、脑组织和其他潜 在包含干/祖细胞群的任选组织。进一步，所述哺乳动物也包括人类；其中，采用已知的分子标志物以进一步识别所述细胞群及其子代细胞，其中， 包括进一步筛选分离所述细胞群表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知或未知的 分子或物质从所述哺乳动物、啮齿动物组织中筛选分离所述细胞群或其子代对研究和应 用是极其有益的，均属于本发明的精神范畴及保护范围。其中，所述细胞群的子代细胞也可掺入标记，进一步，所述子代由潜能受限的 祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。根据本发明的另一个方面，在本发明的一个优选实施方式中，优选的方案是， 本发明所使用的清除增殖细胞，并激活干/祖细胞的试剂为肿瘤化疗药物，优选的药物 为5-氟尿嘧啶(5-Fu)，5-Fu是一种化疗药物，临床上用于治疗肿瘤或癌症。该药物对 动物造成损伤的剂量为150mg/kg，动物注射5-Fu后，那些快速增殖细胞和已经高度定向 的祖细胞就会因失去了对细胞毒性药物的耐受性而被清除，干细胞则能避免被清除。进一步，本发明中所述激活的干/祖细胞采用可掺入到细胞DNA的标记进行识 别、追踪，其中，优选的实施方案所采用的标记是BrdU。本发明人惊喜的发现，5-Fu清除组织中原先存在的增殖性细胞后，可用于激活所有成体组织中的干/祖细胞，且所述 激活的干细胞可以被BrdU长期识别和追踪。其中根据本发明的另一个方面优选的实施例，优选的，本发明采用3周至4周 大的动物，优选的动物选择小鼠，其中，采取静脉单次注射150mg/Kg的5-氟尿嘧啶 (5-Fu),优选的，采取尾静脉注射，之后，再注射标记，优选BrdU标记，优选的注射 标记的剂量为50-100mg/Kg体重；注射BrdU标记的动物随后被随机分组，其中，优选 的，根据距离第一次注射药物的时间分别分组定为损伤后3天、4天、5天和7天组，其 中，药物注射后3天损伤组又进一步分为0小时、12小时、24小时、36小时和10周；其 中，药物注射后4天损伤组又进一步分为0小时、12小时、24小时和36小时，所述每个 时间点至少入选3只小鼠；其中，所述激活的干/祖细胞群或其子代能融合BrdU标记， 所述BrdU标记识别一个或多个激活的干/祖细胞或其子代，并进而对所述细胞及其子代 进行长期追踪和定位，所述长期保留标记的细胞群是并且持续是BrdU阳性(Brdl/)，所 述长期保留标记的细胞群定位在组织特定的微环境内，其中，所述细胞群的子代细胞也 保留标记，进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细 胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。进一步，所述的细胞群在损伤后3天和4天的再生动力学行为有不同且所述细胞 群的再生动力学因组织不同而不同；进一步，所述细胞群或其子代负责对受损组织进行 再生，其中所述细胞群在组织恢复至稳态后仍能长期保留标记。进一步，所述细胞群是 同质类型的细胞群，这为后续筛选分离这些功能性干细胞提供了确切方法依据，并进一 步有益于其在例如功能研究、药物筛选及临床治疗方面的应用。在其中一个优选实施方案中，根据本发明的方法，肝脏组织中，5-Fu加入对组 织造成损伤后，干/祖细胞群呈现从多个区域(微环境)中激活，主要包括门管区、中央 静脉周围或血管附近，进一步可长期识别、定位所述细胞群或其子代，其中，优选的本 实施方案，在损伤后10周的肝脏组织中，仍可识别到保留标记的所述细胞，主要分散分 布在大的管状结构周围。进一步，从所述细胞群或其子代再生受损肝脏组织的动力学特征看，在5-Fu处 理后的第三天、第四天，肝脏组织中所述激活的干/祖细胞群或其子代的动力学特征不 同，第四天，肝脏的受损程度最大，几乎未发现BrdU阳性细胞，第五天所述细胞群的数 量达到最大，随后所述细胞群逐渐回复至基准水平，进一步，所述细胞群在随后的定期 追踪观察中发现，所述细胞群大量增殖，主要从门管区、中央静脉周围开始增殖，进一 步表明，所述细胞群或其子代能够重建受损肝脏。在其中一个优选实施方案中，损伤后激活的所述细胞群或其子代可以长期保留 BrdU标记，表达的分子标志物包括cyclind3、cdk6分子。在其中另一个优选实施方案中，根据本发明的方法，心脏组织中，5-FU处理四 天后，所述细胞群被激活并开始增殖；其中，激活后产生的早期细胞群与正常成体中的 细胞群在组织中具有类似的分布；随后，这些成簇分布的细胞群分散分布，在成熟心肌 细胞间的标记细胞群开始大量出现；进一步，所述细胞群逐渐分化为成熟的心肌细胞并 与临近的心肌细胞形成心肌润盘。从所述细胞群再生受损心脏组织的动力学特征看，在 5-Fu处理后的第三天，几乎未发现BrdU阳性细胞，第四天，所述细胞群开始出现并大量增殖，第五天、第七天的心脏中，BrdU阳性细胞逐渐回复到基准水平，进一步表明，所 述细胞群或其子代能够重建受损心脏。在其中另一个优选实施方案中，损伤后激活的所述细胞群或其子代可以长期 保留BrdU标记，表达的分子标志物包括干细胞表面相关抗原Sca-1、c_Kit、黏附分子 N-cad分子。进一步，当心脏受到损伤时，除lin-c-kit+和Sca_l+心脏干/祖细胞能进行增殖 并对心脏进行修复外，还有其它一些亚群的心脏干/祖细胞也被激活来参与修复损伤的 心脏。其中，可采用已知或未知的分子标志物进一步识别，筛选、分离所述细胞群或 其子代，从而有益于其在临床治疗、药物筛选、组织工程、器官构建、基因治疗等方面 的研究及应用。所述的分子标志如下已知的表面分子，如蛋白质，配体，糖蛋白，CD分子及 其他，未知的可以分离出此细胞群或细胞系或者其后代的表面分子。已知的胞内标志， 如蛋白质，酶；未知的胞内标志，采用这些标志可以分离出此细胞群或细胞系或者其后 代；已知的以及未知的在核内能特异的与此细胞群或细胞系或者其后代染色体相结合的 标志，如蛋白质，DNAs，RNAs,抗体，配体，甲基化和化学试剂，其中，所述的抗体 可以是荧光标记或磁珠富集。应当理解，这些激活的干/祖细胞群也可采用其他标记进行标记，例如氚标记 胸腺嘧啶核苷(3H_TdR)、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其它可以长期标记此 述细胞群或细胞系或者其后代的分子。本发明有效的提供了清除原先存在的增殖细胞进而激活所有组织中干/祖细胞 并对其进行识别、定位和研究其再生受损组织的动力学的方法，本发明所获得细胞群或 细胞系或者其后代是非常有益的，可用于多种用途，例如治疗、诊断等用途。2.发明详述在一个方面，本发明的一个目的是，针对现有的识别和定位组织中干/祖细胞 方法技术的不足，提供一种有效识别、定位所有组织中的干/祖细胞，在体内追踪研究 其定位及动力学行为的方法。识别的成体干细胞和/或组织干细胞在受损或患病组织的 修复中是极其有用的，其中有益于分别研究各个组织在内的干/祖细胞的定位、功能、 以及进一步有益于随后的筛选、分离和应用。其中，采用已知的分子标记物对所述细胞 群及其子代细胞进行识别和定位，进一步，有益于以已知的或未知的分子标志物识别， 筛选、分离所述干/祖细胞群或其子代，进一步获得其所表达的特异性分子表面标志 物。根据本发明的一个方面，采用可掺入到细胞DNA的标记以识别、定位所有组 织中的干/祖细胞群或其子代，并研究其动力学行为，所述细胞群可以长期保留标记， 其中，所述识别、定位的干/祖细胞群或其子代细胞源自哺乳动物、啮齿动物的心脏组 织、肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、卵巢组织、睾丸组织、胃组织、小肠组织、肌肉 组织、皮肤组织、牙组织、肺组织、神经组织、骨髓组织、脑组织和其他潜在包含干/ 祖细胞群的任选组织；进一步，所述哺乳动物也包括人类；
其中，所述细胞群的子代细胞也可掺入标记，进一步，所述子代由潜能受限的 祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。本发明的干细胞对于研究的目的也是极其有益的，合适的研究目的的实现是采 用已知或未知的分子标志物进一步识别，筛选、分离所述细胞群或其子代，从而有益于 其在临床治疗、药物筛选、组织工程、器官构建、基因治疗等方面的研究及应用。所述的分子标志如下已知的表面分子，如蛋白质，配体，糖蛋白，CD分子及 其他，未知的可以分离出此细胞群或细胞系或者其后代的表面分子。已知的胞内标志， 如蛋白质，酶；未知的胞内标志，采用这些标志可以分离出此细胞群或细胞系或者其后 代；已知的以及未知的在核内能特异的与此细胞群或细胞系或者其后代染色体相结合的 标志，如蛋白质，DNAs，RNAs,抗体，配体，甲基化和化学试剂，其中，所述的抗体 可以是荧光标记或磁珠富集。在本发明的优选实施方式中，优选可掺入到细胞DNA的标记是BrdU，标记的 物质也可选择为氚标记胸腺嘧啶核苷(3H_TdR)、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU) 和其它可以长期标记此述细胞群或细胞系或者其后代的分子。在本发明的优选实施方式中，其中实施方式优选的标记为BrdU，细胞所保留的 标记是BrdU分子，其中所述细胞群或其子代是并且持续是BrdU阳性(BrdlT)。进一步，本发明的一个优选实施方案是通过以下技术方案实现的，具体步骤如 下第一步、标记动物制备于新生动物皮下注射标记，优选的，选用5天至6天大 的新生动物，优选的实施方案是选择小鼠，优选的标记是BrdU，皮下连续注射BrdU标 记，优选的时间方案和给予剂量是每日两次，连续注射5天，每次每只给予标记的剂量 为50-100mg/kg体重，即可获得含BrdU标记的小鼠；其中，组织准备包括乙醚麻醉小 鼠后，预冷PBS缓冲液经右心室原位灌注至动物全身血液流出，之后，用10%中性甲醛 固定全身组织，经PBS缓冲液清洗2至3次后固定过夜，随后保存至70%乙醇和30%蔗 糖溶液中备用；第二步、干/祖细胞或其子代的识别、定位及体内动态观察在不同时 间点取小鼠组织，时间范围为出生至衰老期，其中，对获取组织进行切片制备，保存于 70%乙醇的部分组织样品经酒精梯度(80%、90%, 95%和100%)脱水，每个梯度停留 3至5分钟，随后二甲苯透明3至5分钟，再浸蜡三次，每次停留30分钟至1小时，包 埋后切片，其中，切片厚度优选为5i!m，优选的，本发明所选用的时间点分别为距离第 一次注射标记后的2周、2个月、4个月和23个月，所述每个时间点至少入选3只小鼠。 进一步，原位追踪标记保留细胞的定位、分布及动力学行为。本发明人惊喜的发现，所有成体组织中的干/祖细胞都能被可掺入到细胞DNA 的标记所识别、定位，优选的实施方式中是被BrdU标记所识别，BrdU标记的干/祖细 胞或其子代细胞的数量为一个或多个，且所述细胞可长期保留此标记，其中，标记可被 所述细胞保留至衰老期，所述干/祖细胞群在追踪一定时期后其数量基本保持不变，不 同组织中此细胞群保持数量基本不变的时间和所占的比例因组织不同而不同，进一步， 这些被标记的干/祖细胞含有永生化或不朽的DNA链，所述长期保留标记的细胞群居住 于组织特定的微环境内。第三步、采用已知的分子标志物对BrdU+细胞及其子代细胞进 行识别。进一步，以已知的其他分子或未知分子识别或筛选所述的干/祖细胞群及其子代，进一步，筛选所述细胞群及其子代所表达的新的分子标志物。在其中一个优选实施方案中，观察发现肝脏组织中存在长期保留BrdU标记的干 /祖细胞，所述细胞群是BrdlT的，所述被标记的干/祖细胞群在追踪2个月后其数量基 本保持不变，主要分布在大的管状结构周围，包括门管区、中央静脉周围，其中部分呈 成簇状分布，随着追踪时间的进一步延长，分散分布的所述细胞群呈现上升趋势，其中 所述细胞群或其子代表达的分子标志包括cyclind 3和cdk 6。在其中的另一优选实施方案中，观察发现心脏组织中存在长期保留BrdU标记的 干/祖细胞，所述细胞群是BrdlT的，所述被标记的干/祖细胞群在追踪4个月后其数量 基本保持不变，主要分布在在心尖、室间隔和左心室心肌层和心脏血管内皮中，其中部 分呈成簇状分布，随着追踪时间的进一步延长，分散分布的所述细胞群呈现上升趋势， 进一步，成体动物心脏组织中存在多种不同亚群的心脏干/祖细胞群，其中，所述被标 记的心脏干/祖细胞群或其子代表达的分子标志物包括，干细胞表面相关抗原Sca-1、 c-Kit。在另一个方面，本发明的另一个目的是，提供一种有效激活并进一步采用可掺 入到细胞DNA的标记以识别、定位所有组织中激活的干/祖细胞的方法，其特征在于， 采用可用于有效清除组织中原先存在的具有增殖性的细胞群的试剂，从而激活真正干/ 祖细胞，并进一步对所述激活干/祖细胞群及其子代进行长期识别和定位以及研究其再 生动力学的方法，其中所述标记为可掺入到细胞DNA的标记，其中，所述细胞群的子代 细胞也可保留标记，由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/ 祖细胞的一种或多种组成。进一步，识别、定位组织在受到损伤后所激活的干/祖细胞 及其子代再生受损组织的动力学的方法和其应用。其中，识别的激活干细胞在受损或患病组织的修复中是极其有用的，进一步有 益于随后的筛选、分离和应用。进一步，所使用的清除原先存在的增殖性细胞并激活干/祖细胞群的试剂为已 知的用于肿瘤化疗的化疗试剂或药物的一种或多种组合。进一步，应当理解，本发明也包含其他任何潜在的可用于清除组织中原先存在 的具有增殖性的细胞群的试剂或物质。进一步，所述使用的试剂或物质不能具有清除静息的或未经历分裂的细胞的作用。进一步，所述识别、定位的于/祖细胞群或其子代细胞源自哺乳动物、啮齿动 物的心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、卵巢组织、睾丸组织、胃组织、小肠 组织、肌肉组织、皮肤组织、牙组织、肺组织、神经组织、骨髓组织、脑组织和其他潜 在包含干/祖细胞群的任选组织。进一步，所述哺乳动物也包括人类；其中，采用已知的分子标志物以进一步识别所述细胞群及其子代细胞，其中， 包括有益于进一步筛选、分离所述细胞群表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知 或未知的分子或物质从所述哺乳动物、啮齿动物组织中筛选分离所述细胞群或其子代对 研究和应用是极其有益的，均属于本发明的精神范畴及保护范围。在另一个方面，在本发明的优选实施方式中，其中，优选的可掺入到细胞DNA的标记是BrdU，标记的物质也可选择为氚标记胸腺嘧啶核苷(3H_TdR)、5-乙炔基-2’ 脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其它可以长期标记此述细胞群或细胞系或者其后代的分子。进一步，本发明的这个目的的实现是采用下述优选方案实现的，具体步骤如 下第一步，损伤后标记动物制备首先优选用3周至4周大的成体动物，动物优选 是小鼠，然后于静脉注射一定剂量的试剂，优选的试剂是肿瘤化疗药物，优选的药物是 5-氟尿嘧啶(5-Fu)，进一步，采取优选的尾静脉给药方案注射，此后，再注射标记，优 选的标记是BrdU，其中优选的注射剂量为50-100mg/Kg体重；第二步，不同时间点标记 的干/祖细胞体内的动力学行为观察其中，分别于不同时间点取组织，原位追踪所述 细胞群及其子代细胞的定位、分布及再生受损组织的动力学行为。随后，对所获取组织进行切片制备，其中，保存于70%乙醇的部分组织样品经 酒精梯度(80%、90%, 95%和100%)脱水，每个梯度停留3至5分钟，随后二甲苯透 明3至5分钟，再浸蜡三次，每次停留30分钟至1小时，包埋后切片，其中，切片厚度优 选为5i!m。注射BrdU标记的动物被随机分组，优选的随机分组是分为4组，优选的， 本发明选取的时间点分别为距离第一次药物注射后的3天、4天、5天和7天组，其中， 药物注射后3天又进一步分为0小时、12小时、24小时、36小时和10周；其中，药物 注射后4天又进一步分为0小时、12小时、24小时和36小时。其中，所述的每个时间 点至少入选3只小鼠。进一步，所述的激活后的干/祖细胞群能保留BrdU标记，进一 步，所述细胞群或其子代负责对受损组织进行再生，其中所述细胞群在组织恢复至稳态 后仍能能长期保留标记，其中，所述细胞群保留标记的时间可长达至10周，进一步观察 发现，BrdU所标记的干/祖细胞数量为一个或多个干/祖细胞，所述长期保留标记的细 胞群是并且持续是BrdU阳性(BrdlT)，其中，所述长期保留标记的细胞群居住于组织特 定的微环境内，进一步，所述的细胞群在损伤后3天和4天的再生动力学行为不同且不同 组织所述细胞群的再生动力学互不相同；第三步、采用已知的分子标志物对BrdlT细胞 或其子代细胞进行识别，其中，进一步有益于筛选被标记的干/祖细胞所表达的新的分 子标志物。在其中一个优选实施方案中，根据本发明的方法，观察发现肝脏组织中，5-Fu 加入对组织造成损伤后，干/祖细胞群呈现从多个区域(微环境)中激活，主要包括门管 区、中央静脉周围或血管附近，进一步可长期识别、定位所述细胞群或其子代，其中优 选的本实施方案，在损伤后10周的肝脏组织中，仍可识别到保留标记的所述细胞，主要 分散分布在大的管状结构周围。进一步，从所述细胞群再生受损心脏组织的动力学特征看，在5-Fu处理后的第 三天、第四天，肝脏组织中所述激活的干/祖细胞群的动力学特征不同，第四天，肝脏 的受损程度最大，几乎未发现BrdU阳性细胞，第五天所述细胞群的数量达到最大，随后 所述细胞群逐渐回复至基准水平，进一步，所述细胞群在随后的定期追踪观察中发现， 所述细胞群大量增殖，主要从门管区、中央静脉周围开始增殖，进一步表明，所述细胞 群或其子代能够重建受损肝脏。在其中一个优选实施方案中，损伤后激活的所述细胞群可以长期保留BrdU标 记，表达的分子标志物包括cyclind3、cdk6分子。
其中，包括进一步筛选分离所述细胞群或其子代表达的分子标志物，应当理 解，采用任何已知或未知的分子或物质对所述组织中的细胞群或其子代进行识别、定位 和从所述哺乳动物、啮齿动物组织中筛选分离所述细胞群或其子代均属于本发明的精神 范畴及保护范围。在其中另一个优选实施方案中，根据本发明的方法，心脏组织中，5-FU处理四 天后，所述细胞群被激活并开始增殖；其中，激活后产生的早期细胞群与正常成体中的 细胞群在组织中具有类似的分布；随后，这些成簇分布的细胞群分散分布，在成熟心肌 细胞间的标记细胞群开始大量出现；进一步，所述细胞群逐渐分化为成熟的心肌细胞并 与临近的心肌细胞形成心肌润盘。从所述细胞群再生受损心脏组织的动力学特征进一步 观察发现，在5-Fu处理后的第三天，几乎未发现BrdU阳性细胞，第四天，所述细胞群 开始出现并大量增殖，第五天、第七天的心脏中，BrdlT细胞逐渐回复到基准水平，进一 步表明，所述细胞群或其子代能够重建受损心脏。在其中另一个优选实施方案中，损伤后激活的所述细胞群可以长期保留BrdU标 记，表达的分子标志物包括干细胞表面相关抗原Sca-1、c-Kit、黏附分子N-cad分子。 其中，包括进一步筛选分离所述细胞群表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知或 未知的分子或物质对所述组织中的细胞群或其子代进行识别、定位和从所述哺乳动物、 啮齿动物组织中筛选分离所述细胞群或其子代均属于本发明的精神范畴及保护范围。进一步，当心脏受到损伤时，除lin-c-kit+和SCa-l+心脏干/祖细胞能进行增殖 并对心脏进行修复外，还有其它一些亚群的心脏干/祖细胞也被激活来参与修复损伤的 心脏。本发明优选实施方案的所述识别、定位的干/祖细胞群源自啮齿动物的所有组 织，例如，心脏组织、肝脏组织、肾组织、肺组织、胰腺组织、皮肤组织、肌肉组织、 小肠组织、神经组织、眼组织、卵巢组织、睾丸组织、乳腺组织、牙组织、脑组织、血 液组织和其它潜在包含干/祖细胞的任选组织。本发明所述的免疫组化染色优选石蜡组织切片的染色，具体步骤如下a)石蜡包埋的切片(5 u m)浸入二甲苯中脱蜡3次，每次3至5分钟，b)通过浓度依次降低的酒精梯度(100%、95%, 80%, 70%, 50%和30%)， 每个梯度停留3至5分钟；c)用0.01M的枸橼酸缓冲液(pH6.0)对组织切片进行抗原修复后(70°C，1至2 个小时)，于室温下冷却30分钟，组织切片再用0.2% TBS (0.2% Tween-20+PBS, pH7.4) 透膜10至20分钟；d)加入3%牛血清白蛋白(BSA)，室温孵育30分钟至1个小时以封闭非特异性 位点； e)滴加含有抗-BrdU的DNase-1于组织切片上进行酶消化；f)室温消化30分钟至1个小时后，加入稀释的抗BrdU单克隆抗体，4°C孵育过 夜；g)吸去一抗，用0.2%的TBS再次透膜10至20分钟后，加入对应的二抗， DAPI(1 1000稀释)加入二抗溶液中；h)室温避光孵育30分钟后，吸去二抗，再用PBS洗3次，每次3至5分钟，避光晾干后用荧光封片液封片，激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察；本发明所述的已知的或未知的分子从非干细胞群中识别、定位以及筛选、分离 所述干/祖细胞群及其子代的分子标志包括，已知的表面分子，如蛋白质，配体，糖蛋 白，CD分子及其他，未知的可以分离出此细胞群或细胞系或者其后代的表面分子。已 知的胞内标志，如蛋白质，酶；未知的胞内标志，采用这些标志可以分离出此细胞群或 细胞系或者其后代；已知的以及未知的在核内能特异的与此细胞群或细胞系或者其后代 染色体相结合的标志，如蛋白质，DNAs，RNAs,抗体，配体，甲基化和化学试剂，其 中，所述抗体可以是荧光标记或磁珠富集或其他方法标记。本发明所述的细胞群或细胞系或者其后代，其特征在于，为脏器疾病的细胞治 疗及组织工程提供理想的细胞来源，为相关的脏器疾病的治疗提供一种理想的细胞载 体。
图1成体小鼠肝组织中干/祖细胞的识别、定位及体内动力学分析。图1中，(a)图表示BrdU脉冲追踪说明图例，(b) _ (d)图表示追踪时间为2周 时，所述细胞在肝区不同位置的定位和分布特征，(e)-(g)表示追踪时间为23个月时， 所述细胞在肝区不同位置的定位和分布特征图，(h)图表示从幼年到衰老期小鼠肝组织中 干/祖细胞的动力学特征及统计分析结果。图25-Fu损伤后不同时间点激活的肝干/祖细胞组织定位及其再生动力学行为。图2中，(a)图表示对照组肝组织的染色结果，(b)图表示损伤后3天的染色结 果，(c)图表示损伤后4天的染色结果，(d)图表示损伤后5天的染色结果，(e)图表示 损伤后7天的染色结果，(f)图表示不同时间点双阳性细胞的统计分析结果。图3损伤后3天不同时间点激活的肝干/祖细胞的组织定位及再生动力学行为图3中，(a)图表示损伤后0小时的染色结果，(b)图表示追踪12小时的染色结 果，(c)图表示追踪24小时的染色结果，(d)图表示追踪36小时的染色结果，(e)图表 示追踪10周时BrdU的染色结果，(e’)图表示采用分子探针DPAI染色的结果，(f)图 表示每个时间点的双阳性细胞的统计分析结果。图4损伤后4天不同时间点肝干/祖细胞的组织定位及其再生动力学行为。图4中，(a)图表示对损伤后0小时的肝组织切片的免疫染色结果，(b)和(b’) 图表示追踪12小时的染色结果，(c)和(c’)图表示追踪24小时的染色结果，(d)图表 示追踪36小时的染色结果，(e)图表示每个时间点的双阳性细胞的统计结果及分析。图5成体小鼠心脏组织中干/祖细胞的识别、定位。图5中，(A)-(D)图表示追踪时间为2周时，所述细胞群在心脏组织不同位 置的定位和分布特征。其中，(A)图表示心脏瓣膜基部的所述标记细胞；(B)图表示 心尖处的所述标记细胞；(C)图表示左心室心肌层中的所述标记细胞，(D)图表示用 anti-BrdU(绿色)和anti-CD31 (红色)抗体对追踪2周的样品所进行的免疫染色结果，
(E)图表示用anti-BrdU抗体对追踪2个月的心脏组织切片样品进行免疫染色的结果，
(F)- (F，)图表示以BrdU (红，核)、c-Kit (绿色)、Sca_l (绿色)和DAPI (分子探针 公司)(蓝，核)对追踪4个月的心脏组织切片进行免疫染色的结果，(G)-(H)图表示以BrdU(红，核)、和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对追踪23个月的心脏组织切片进行 免疫染色的结果。图6小鼠心脏组织中心脏干/祖细胞群的动力学特征及统计分析结果。图75-Fu损伤后不同时间点激活的心脏干/祖细胞组织定位及其再生动力学行为图7中，(A)图表示对对照组心脏组织切片样品的染色结果，(B)图表示对损伤 后4天的心脏组织切片样品进行免疫染色的结果，(C)图表示对损伤后5天的心脏组织切 片样品进行免疫染色的结果，(D)图表示对损伤后7天的心脏组织切片样品进行免疫染色 的结果。图8损伤后激活的心脏干/祖细胞定量统计分析结果。图9损伤后4天不同时间点激活的心脏干/祖细胞的组织定位及再生动力学行 为。图9中，(A)图表示损伤后采用BrdU标记以追踪BrdlT细胞体内迁移和分化示 意图，(B)和(C)图表示对追踪12h的心脏组织切片进行免疫染色的结果，(D)和(G) 图表示对追踪Oh的心脏组织切片进行免疫染色的结果，(E)和(F)图表示对追踪24h的 心脏组织切片进行免疫染色的结果，(H)和⑴图表示对追踪36h的心脏组织切片进行免 疫染色的结果。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为 前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，下述实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按常规条件，所用的试剂均可在市场上购买。在阅读说明书后， 这些实施方式和其它实施方式对本领域或其他领域的技术人员是显而易见的，但本发明 的精神范畴和保护范围不限于下述的实施例，下述实施例是为了清楚公开本发明的内容 而不是限制本发明。实施例1小鼠肝脏干/祖细胞的识别、定位及体内动力学研究材料与方法材料动物小鼠(3周至4周大)源自浙江省医学科学院动物中心，动物许可证号为 No. SCXK (浙)2003-0001。试剂免疫荧光所使用的抗-BrdU单克隆抗体购自Amersham公司；抗血管内皮标 志CD31抗体购自BDPharmingen公司；抗细胞周期蛋白cyclind3和细胞周期依赖性激 酶cdk6单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司。抗Sca_l单克隆抗体购自BD Pharmingen公司；抗c_Kit多克隆抗体购自Santa Cruz公司；抗ck_19多克隆抗体购自 Abeam 公司；抗-CD31 抗体购自 BD Biosciences Pharmingen 公司。 使用的二抗分别为购自Invitrogen公司的Alexa Fluor488标记的驴抗小鼠抗体、 AlexaFluor488标记的羊抗兔抗体、Alexa Fluor488标记的驴抗大鼠抗体、Alexa Fluor594 标记的猴抗小鼠抗体、AlexaFluor546标记的羊抗大鼠抗体、Streptavidin 568标记的抗体、Streptavidin 488标记的抗体。TRITC耦联的猴抗小鼠和FITC耦联的猴抗小鼠抗体 均购自Jackson immuno Research公司。所有二抗的稀释度均为1 200。方法新生小鼠的BrdU标记追踪实验于新生小鼠(5天，12只)皮下注射5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU，Sigma公司)， 连续注射5天，每日两次，每次每只注射的剂量优选为50-100mg/kg(10mg/ml in PBS, pH7.4)。之后，分别于距离第一次给予BrdU标记后的2周、2个月、4个月和23个月对 标记小鼠体内标记的干/祖细胞进行追踪(图la)，所述每个时间点至少入选3只小鼠。 实验期间，所有小鼠均未出现死亡。5-Fu损伤结合BrdU注射于尾静脉单次注射5-氟尿嘧啶(5-Fu，Sigma公司)对3周至4周大的小鼠造成 损伤，每只的注射剂量优选为150mg/kg(20mg/mlinPBS，pH7.4)。注射后小鼠均未死 亡。此后，瞬时注射BrdU标记(脉冲)进入DNA合成期的干/祖细胞，每只小鼠给予 标记的剂量优选为50-100mg/kg(10mg/mlinPBS，pH7.4)，进一步，标记小鼠被随机分 为四组，分别为距离第一给药损伤3天、4天、5天和7天组，优选的，处死小鼠所取组 织的时间分别为3天，4天，5天和7天。其中，所述每个时间点入选3只小鼠；进一步，药物注射损伤后3天组又分为0小时、12小时、24小时、36小时和10 周进行持续观察；进一步，药物注射损伤后4天组又分为0小时、12小时、24小时和36 小时进行持续观察。其中，所述每个时间点至少入选3只小鼠。组织准备乙醚麻醉小鼠后，用预冷的无菌PBS缓冲溶液经右心室原位灌注至动物全身血 液全部流出，然后再经右心室用10%中性甲醛灌注固定全身组织。从动物移出所有组 织，用手术剪剪切所有组织样品，以便将组织切割成更小的部分，进一步，本实施例选 用肝组织，组织经PBS缓冲液清洗后放入10%中性甲醛固定过夜。进一步，用PBS缓 冲液清洗样品3次，每次5分钟，随后分别保存于70%乙醇和30%蔗糖溶液中备用。石蜡切片的制备将保存于70%乙醇的部分肝组织样品经酒精梯度(80%、90%, 95%和100% ) 脱水，每个梯度停留3至5分钟，再二甲苯透明3-5分钟，浸蜡三次，每次30分钟至1 个小时，包埋后切片(Leica切片机，德国)，切片厚度优选为5 ym。荧光免疫组化及激光共聚焦观察a)石蜡包埋的切片(5i!m)浸入二甲苯中脱蜡3次，每次3至5分钟；b)通过浓度依次降低的酒精梯度(100%、95%, 80%, 70%, 50%和30%)， 每个梯度停留3至5分钟；c)用0.01M的枸橼酸缓冲液(pH6.0)对组织切片进行抗原修复后(70°C，1至2 个小时)，于室温下冷却30分钟，组织切片再用0.2% TBS (0.2% Tween-20+PBS, pH7.4) 透膜10至20分钟；d)加入3%牛血清白蛋白(BSA)，室温孵育30分钟至1个小时以封闭非特异性 位点；e)滴加含有抗-BrdU的DNase-1于组织切片上进行酶消化；
f)室温消化30分钟至1个小时后，加入稀释的抗BrdU单克隆抗体，4°C孵育过 夜；g)吸去一抗，用0.2%的TBS再次透膜10至20分钟后，加入对应的二抗， DAPI(1 1000稀释)加入二抗溶液中；h)室温避光孵育30分钟后，吸去二抗，再用PBS洗3次，每次3至5分钟，避 光晾干后用荧光封片液封片，激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察。进一步，如果一个BrdU阳性细胞距离门静脉或中央静脉不多于5或6个肝细 胞，就可认为此BrdU阳性细胞是处于门管周围或中央静脉周围。计数至少6个随机高倍 视野(400X)来计算BrdU阳性细胞的个数。所有BrdU阳性细胞的数量均由两个计数者 分别计数。统计所有采集的数据按照“平均差士标准差”的方式进行统计。采用2 尾-Student’ s检验进行两组之间的显著性分析，p < 0.05表示统计具有显著性差异。结果成体小鼠肝组织中存在干/祖细胞图1表示成体小鼠肝组织中干/祖细胞的识别、定位及体内动力学分析。(a)表 示BrdU脉冲追踪说明图例。(b)-(d)图表示追踪时间为2周时，所述细胞在肝区不同位 置的定位和分布特征。以BrdU(红，核)和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对肝组织 切片进行免疫染色。进一步观察发现，位于S期的细胞主要为大小各异的肝实质细胞， BrdU标记的信号强度各不相同，有些是“BrdU重”标记，有些为“BrdU轻”标记。 所述“BrdU重”标记指的是含有BrdU标记强度超过50%，所述“BrdU轻”标记指的 是含有较少BrdU标记及标记强度低于50%。进一步，所有“BrdU重”标记的细胞均 在细胞核表达cyclind3(数据未显示)。而“BrdU轻”标记细胞不表达cyclind3蛋白。 进一步观察发现，所述细胞不表达Sca-1或c-Kit分子标志。此外，不同BrdU强度的细 胞主要分布在门管区周围和中央静脉周围。进一步，类管状结构的周围或外部也含有标 记的细胞簇。(e)-(g)表示追踪时间为23个月时，所述细胞在肝区不同位置的定位和分 布特征图。以BrdU(红，核)和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对肝组织切片进行免 疫染色。进一步观察发现，BrdlT的实质细胞仍然主要定位于门管区周围，且细胞的大 小不一。(f)图表示，“BrdU轻”标记的细胞位于一个中央静脉周围。(g)图表示在这 个中央静脉附近的小管，其上也含有一个BrdU+的细胞。所述图片的放大倍数为原始大 小的400倍。(h)图表示从幼年到衰老期小鼠肝组织中干/祖细胞的动力学特征及统计分析结 果，当追踪至2个月时，标记保留细胞的百分比从2周时的9.94%骤降为约1.6%。此 后，所述细胞的百分比几乎保持恒定不变。p = 0.02624 <0.5表明追踪2周和2个月两 组之间相比有显著性差异；p = 0.1027 > 0.5表示追踪2个月和23个月两组之间相比没 有显著性差异。进一步，所有观察结果表明，成体小鼠肝组织内存在数量基本保持恒定 不变的所述细胞，且所述细胞主要由实质细胞组成。进一步，所述细胞主要位于门管区 和中央静脉周围。上述数据为成体肝组织内存在干/祖细胞提供功能证据。实施例2 5-Fu损伤后不同时间点激活的肝干/祖细胞组织定位及其再生动力学 行为图2采用BrdU(红，核)、cyclind3 (青绿，核)和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对肝组织切片进行免疫染色的结果及分析。(a)图表示对对照组肝组织的染色结果。 进一步观察发现，双阳性的核位于一个大的管状结构周围。所有BrdU和cydind3双阳 性的细胞是实质细胞，非实质细胞基本没有。BrdU阴性细胞不在其核中表达cydind3。 (b)图表示损伤后3天的染色结果。进一步观察发现，一个双阳性细胞定位在一个类胆管 状的结构上，其核质比低。(c)图表示损伤后4天的染色结果。进一步观察发现，几乎 不能在管状结构上检测到双阳性细胞的存在。(d)图表示损伤后5天的染色结果。进一 步观察发现，不同形状的双阳性细胞急剧增加，他们主要位于管状结构附近。进一步， 上述数据表明肝干/祖细胞显著地从大的管状结构周围被激活。进一步，那些cydind 3 阳性细胞也在其核中表达cyclind3依赖激酶cdk6(数据未显示)。这进一步表明，cyclind 3及其对应的激酶cdk 6共同参与扩充肝干/祖细胞细胞数量的控制。(e)图表示损伤后 7天的染色结果。本发明人发现，中央静脉周围或肝内胆管附近出现BrdlT的实质细胞。 进一步，上述数据表明包括中央静脉和门管区在内的大的管状结构周围是一个潜在的 微环境，在组织受到损伤后，干/祖细胞可从这些区域激活。(f)图表示不同时间点双阳 性细胞的统计分析结果。C 表示对照组；D 表示天数。进一步观察发现，损伤后4 天，肝脏受损程度最大，5-Fu几乎完全抑制肝干/祖细胞的增殖。3天和4天比较，、 =0.0412 <0.05表示两组之间相比有显著性差异，进一步，4天和5天比较，"p = 0.0066 < 0.01表示两组之间相比有极显著性差异。所述图片的放大倍数为原始大小的400倍。实施例3损伤后3天不同时间点激活的肝干/祖细胞的组织定位及再生动力学行 为图3采用BrdU(红，核)、cyclind3 (青绿，核)和DAPI(分子探针公司)(蓝，
核)对肝组织切片进行免疫染色的结果及分析。(a)图表示损伤后0小时的染色结果。 进一步观察发现，双阳性的实质细胞位于管状结构上，另外，一个BrdU阳性的非实质细 胞定位在管状结构附近的窦状隙中。(b)图表示追踪12小时的染色结果。进一步观察 发现，形状各异的双阳性细胞仍主要位于管状结构周围。而且，非实质细胞在此时也参 与再生，其定位在管状结构附近的窦状隙中。(c)图表示追踪24小时的染色结果。本发 明人发现，双核的双阳性实质细胞出现在管状结构附近，这进一步表明，此细胞正在进 行分裂，优选的，此细胞可能在进行对称分裂。其右上角的图是BrdU阳性细胞的高倍 放大。相反，类管状结构上的细胞是BrdU阴性的，这表明在此时是处于静息状态。同 时，一个非实质细胞它有一个奇怪的核形态，很可能属于管状周围“裸”单核细胞，它 定位于窦状隙内。(d)图表示追踪36小时的染色结果。进一步观察发现，双阳性实质细 胞仍在管状结构周围出现，图中的右下角是对三个双阳性的细胞进行高倍放大的结果。 进一步，上述数据表明，被标记的干/祖细胞在原位进行再生组织。(e)图表示追踪10 周时BrdU的染色结果。(e’)图表示采用分子探针DPAI染色的结果。本发明人惊喜 的发现，在损伤后追踪达10周的时间仍在门管区周围检测到BrdU阳性的细胞，主要呈分 散分布，进一步，该细胞是实质细胞。更进一步表明，肝再生完成后所述标记细胞仍存 在于小鼠肝组织中。上述数据从另外一面表明肝内干/祖细胞的原位存在。(f)图表示 每个时间点的双阳性细胞的统计分析结果。12小时和36小时比较，= 0.0218 < 0.05 表示两组之间相比有显著性差异，进一步，36小时和10周比较，"p = 0.0232 < 0.05表 示两组之间相比有显著性差异。进一步观察发现，双阳性的细胞数量在0至36小时之间呈增加趋势。所述图片的放大倍数为原始大小的400倍。实施例4损伤后4天不同时间点肝干/祖细胞的组织定位及其再生动力学行为图4采用BrdU(红，核)、cyclind3 (青绿，核)和DAPI (分子探针公司)(蓝， 核)对肝组织切片进行免疫染色的结果及分析。(a)图表示对损伤后0小时的肝组织切片 的免疫染色结果。进一步观察发现，几乎不能在管状结构上检测到双阳性细胞。(b)和 (b’)图表示追踪12小时的染色结果。进一步观察发现，虽然在肝的Zone II区出现双 阳性细胞(b’)，但肝干/祖细胞仍主要位于管状结构周围(b)。 (c)和(c’ )图表示追 踪24小时的染色结果。进一步观察发现，肝干/祖细胞仍主要定位在此区域附近。进 一步，有些细胞在进行对称分裂以扩充其数量。进一步，上述数据表明此时进入DNA合 成的细胞数量达到最高峰，门管区周围和中央静脉周围的肝干/祖细胞从其微环境被显 著激活。(d)图表示追踪36小时的染色结果。采用BrdU(绿，核)、CD31(红，细胞 膜)和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对肝组织切片进行免疫染色。进一步观察发现， 门管区仍含有BrdU阳性细胞，进一步，CD31染色显示这个阳性细胞位于血管(门静脉) 附近。(e)图表示每个时间点的双阳性细胞的统计结果及分析。进一步观察发现，双阳 性细胞的数量在12小时后急剧下降，12小时和24小时比较，、=0.0134 < 0.05表示两 组之间相比有显著性差异，进一步，24小时和36小时比较，"p = 0.0232 < 0.05表示两 组之间相比有显著性差异。所述图片的放大倍数为原始大小的400倍。实施例5小鼠心脏干/祖细胞的识别、定位及体内动力学研究材料与方法、组织准备同实施例1。心脏组织切片将保存于70%乙醇的部分心脏组织样品经酒精梯度(80%、90%, 95 %和 100%)脱水，每个梯度停留3至5分钟，再二甲苯透明3-5分钟，浸蜡三次，每次30分 钟至1个小时，包埋后切片(Leica切片机，德国)，切片厚度优选为5 u m。荧光免疫组化及激光共聚焦观察i)石蜡包埋的切片(5i!m)浸入二甲苯中脱蜡3次，每次3至5分钟；j)通过浓度依次降低的酒精梯度(100%、95%, 80%, 70%, 50%和30%)， 每个梯度停留3至5分钟；k)用0.01M的枸橼酸缓冲液(pH6.0)对组织切片进行抗原修复后(70°C，1至2 个小时)，于室温下冷却30分钟，组织切片再用0.2% TBS (0.2% Tween-20+PBS, pH7.4) 透膜10至20分钟；1)加入3%牛血清白蛋白(BSA)，室温孵育30分钟至1个小时以封闭非特异性 位点； m)滴加含有抗-BrdU的DNase_l于组织切片上进行酶消化；n)室温消化30分钟至1个小时后，加入稀释的抗BrdU单克隆抗体，4°C孵育过 夜；0)吸去一抗，用0.2%的TBS再次透膜10至20分钟后，加入对应的二抗， DAPI(1 1000稀释)加入二抗溶液中；p)室温避光孵育30分钟后，吸去二抗，再用PBS洗3次，每次3至5分钟，避 光晾干后用荧光封片液封片，激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察。
统计所有采集的数据按照“平均差士标准差”的方式进行统计。采用2 尾-Student’ s检验进行两组之间的显著性分析，p < 0.05表示统计具有显著性差异。结果成体小鼠心脏组织中存在干/祖细胞图5表示成体小鼠心脏组织中干/祖细胞的识别、定位。(A)-(D)图表示追踪 时间为2周时，所述细胞群在心脏组织不同位置的定位和分布特征。以BrdU(红，核) 和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对心脏组织切片进行免疫染色。(A)-(C)图中左边一 列是低倍镜下观察图片，右边一列是左边一列图片中方框部分的局部放大图；具体的， (A)图表示心脏瓣膜基部的所述标记细胞；(B)图表示心尖处的所述标记细胞；(C)图 表示左心室心肌层中的所述标记细胞，进一步观察发现，所述细胞群的细胞核形态有差 异，主要呈簇状分布，BrdU信号强度在不同细胞之间有不同，其中，随着追踪时间的延 长，分散的所述细胞呈上升趋势。(D)图表示用anti-BrdU(绿色)和anti-CD31 (红色) 抗体对追踪2周的样品所进行的免疫染色结果，箭头所示为心脏血管内皮周围的心脏干/ 祖细胞或其子代，呈簇状分布。(E)图表示用anti-BrdU抗体对追踪2个月的心脏组织 切片样品进行免疫染色的结果，具体的，(E)图为低倍镜下的心脏冠状动脉近端；线条 右边所指为(E)图的局部放大图，箭头所示为附着在冠状动脉内皮的内表的所述标记细 胞，长箭头表示所述细胞半嵌入内皮，短双箭头表示所述细胞群完全嵌入冠状动脉内皮 中，细胞核用DAPI(蓝色)显示。(F)-(F’)图表示以BrdU(红，核)、c_Kit(绿色)、 Sca-1 (绿色)和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对追踪4个月的心脏组织切片进行免 疫染色的结果，具体的，结果显示，所述细胞群或其子代表达选用的两种干细胞表面抗 原，其中，(F)图表示所述细胞表达c-Kit，(F’ )图表示所述细胞表达Sca-1，进一步， (F” )图表示所述细胞其中约36%是c-kit+;所述细胞其中约15%是SCa-l+，进一步表 明，心脏组织中有其他的心脏干/祖细胞群具有长期保留标记的能力；(G)-(H)图表示 以BrdU(红，核)、和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对追踪23个月的心脏组织切片进 行免疫染色的结果，其中，(G)图表示BrdU染色的结果，(H)图表示融合的结果(BrdU 和DAPI)，进一步表明所述细胞群能够长期保留标记。图6表示从幼年到衰老期小鼠心脏组织中心脏干/祖细胞群的动力学特征及统计 分析结果，当追踪至4个月时，所述细胞群的百分比从2周时的约8.3% 士4.6%骤降为约 4.5% 士2.0%。此后，所述细胞群的百分比几乎保持恒定不变。★，★★表示均与23m 样品中的所述细胞的百分比作t检验，★★表示P< 0.02，4m和23m间没有显著差异。 进一步，上述数据为成体心脏组织内存在干/祖细胞提供功能证据。“w”表示“周”；
“m”表示“月”。实施例65-Fu损伤后不同时间点激活的心脏干/祖细胞组织定位及其再生动力学 行为图7采用BrdU(红，核)和DAPI(分子探针公司)(蓝，核)对对照和损伤后的 心脏组织切片进行免疫染色的结果及分析。(A)图表示对对照组心脏组织切片样品的染 色结果；(B)图表示对损伤后4天的心脏组织切片样品进行免疫染色的结果；(C)图表示 对损伤后5天的心脏组织切片样品进行免疫染色的结果；(D)图表示对损伤后7天的心脏 组织切片样品进行免疫染色的结果。然而，在损伤后3天，几乎未发现BrdlT细胞(数 据未显示)，表明损伤后3天，心脏受损程度最大，5-Fu几乎完全抑制心脏干/祖细胞的增殖。损伤后4天，BrdlT细胞的数量显著增加(图7B)，然而，在损伤后的第5天 (7C)、第7天(7D)的心脏组织中，BrdlT细胞逐渐回复到基准水平，表明激活的所述细 胞再生受损的心脏。图8表明定量分析的统计结果，进一步显示在损伤后第4天的心脏中，BrdlT 细胞占心脏细胞总数约为5% 士0.9%，约分别是对照心脏中BrdlT细胞的11倍，损伤后 第5天的6倍，第7天的7倍。这些结果表明5-Fu已经有效地清除那些正常心脏中的 临时增殖细胞(P< 0.0005)，并且，损伤后第四天心脏干/祖细胞被激活并开始大量增 殖(P< 0.001)。 “c”为对照，“d”代表“天” ；★，★★均与对照组做t检验，
< 0001，00005。实施例7损伤后4天不同时间点激活的心脏干/祖细胞的组织定位及再生动力学 行为图9采用BrdU(红，核)、N_cad (青绿，胞膜)和DAPI (分子探针公司)(蓝， 核)对心脏组织切片进行免疫染色的结果及分析。(A)图表示损伤后采用BrdU标记以追 踪BrdlT细胞体内迁移和分化示意图“w”、“d”和“h”分别代表“周”、“天” 和“小时”，注射BrdU后作为Oh开始取样，随后每隔12h取一次样并分别记为“Oh”、
“12h”、“24h”和“36h”。 (D)和(G)图表示对追踪Oh的心脏组织切片进行免疫 染色的结果，观察发现约11个BrdU+细胞成簇分布，主要成群分布在左心室和心尖的心 肌层中。(B)和(C)图表示对追踪12h的心脏组织切片进行免疫染色的结果，所述细胞 群大部分分散在心肌层中，少部分成簇分布在心外膜(数据未显示)，其中，几乎所有的 BrdU+细胞都保持着与Oh心脏中的BrdlT细胞相同的细胞核形态，很可能表明干/祖细胞 先通过增殖的方式扩充细胞数量从而启动受损心脏再生。(E)和(F)图表示对追踪24h的 心脏组织切片进行免疫染色的结果，发现心肌层中开始出现一些具有梭形细胞核的BrdlT 成熟细胞，表明所述心脏干/祖细胞随后逐渐分化为成熟心肌细胞。(H)和⑴图表示 对追踪36h的心脏组织切片进行免疫染色的结果，发现一些BrdU+细胞与周围的心肌细胞 形成了心肌润盘结构，表明在心脏干/祖细胞被激活并开始增殖36h后，部分BrdlT细胞 和(或)其子代细胞已分化为成熟的心肌细胞，经过上述进程从而快速再生受损的心脏组
幺口最后说明的是，尽管参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本 领域的技术人员应当理解，任何基于本发明对其作出的各种各样的改变或修改均属于本 发明的精神范畴和保护范围。
权利要求
1.一种识别、定位干/祖细胞及研究其再生动力学的方法和应用，其特征在于，采用 可掺入到细胞DNA的标记以识别、定位组织中的干/祖细胞，该方法具有普遍适用性， 用于识别、定位所有组织中包括从受损组织中激活的干/祖细胞群，包括对所述细胞群 或其子代进行长期识别和追踪的方法，其中，该方法也特别包括对所有组织中原先存在 的增殖性细胞进行清除，从而激活组织的细胞群中所包含的一个或多个干/祖细胞及进 一步对损伤后激活的干/祖细胞群或其子代进行长期识别和定位的方法，也包括研究所 述细胞群或其子代在体内再生受损组织的动力学的方法和进一步筛选所述细胞群或子代 表达的分子标志物，其中所述细胞群在正常及受损组织中均可以长期保留标记，所述获 得的细胞群或其子代在诸如研究、治疗等领域具有潜在应用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用可掺入到细胞DNA的标记以识 另O、定位所有组织中的干/祖细胞群及其子代，并研究其动力学行为，其中，具体步骤 如下a)标记动物制备于新生动物皮下注射标记，其中，优选的实施方案选择的标记是 BrdU,优选5至6天大的新生动物，其中，动物优选小鼠，优选的时间方案和给予剂量是 每日两次，连续五天，每次每只注射的剂量为50mg-100mg/Kg体重；b)干/祖细胞的识别、定位及体内动力学特征其中，优选的选取时间点分别为距 离第一次注射标记为2周、2个月、4个月和23个月的时间，所述每个时间点至少入选3 只小鼠，其中，BrdU所标记的干/祖细胞数量为一个或多个干/祖细胞及其子代，所述 干/祖细胞在追踪一定时间后其数量基本保持不变，不同组织中此细胞群所占的比例不 一样，其中，所述干/祖细胞群长期保留标记，所述长期保留标记的细胞群是并且持续 是BrdU标记阳性(BrdU+),所述长期保留标记的细胞群居住于组织内的特定微环境(小 生境)内；C)采用已知的分子标志物以进一步识别BrdU+标记的细胞群或其子代细胞，其中筛 选所述细胞群表达的分子标志物。
3.—种识别、定位干/祖细胞及研究其再生动力学的方法和应用，其特征在于采 用预先清除所有组织中原先存在的增殖性细胞的试剂，从而激活其中的干/祖细胞群， 随后采用可掺入到细胞DNA的标记对此述激活的干细胞群或其子代进行长期识别和定 位，进一步研究其再生受损组织的动力学行为，具体步骤如下a)损伤后标记动物制备给予动物一定剂量的试剂，试剂优选肿瘤化疗药物，具体 而言，优选药物是5-氟尿嘧啶(5-Fu)，优选于3周至4周大的成体动物静脉单次注射 150mg/Kg的5-氟尿嘧啶(5-Fu)，优选的动物是小鼠，优选的，采取尾静脉注射，之 后，再注射标记，优选的实施方案选择的标记是BrdU，优选的注射剂量为50-100mg/Kg 体重；b)标记动物分组注射BrdU标记的动物随后被随机分组，其中，优选的分为4组， 根据距离第一次注药物的时间分别分组定为损伤后3天、4天、5天和7天组，其中，药 物注射后3天损伤组又进一步分为O小时、12小时、24小时、36小时和10周；其中， 药物注射后4天损伤组又进一步分为0小时、12小时、24小时和36小时，所述每个时间 点至少入选3只小鼠；C)激活后的干/祖细胞的定位及再生受损组织的动力学特征其中，所述的激活后的干/祖细胞群或其子代能融合BrdU标记，进一步，所述细胞群或其子代负责对受损组 织进行再生，其中所述细胞群或其子代在组织恢复至稳态后仍能长期保留标记，其中， 保留标记的时间可以长达至10周，其中，所述BrdU所标记的干/祖细胞或其子代的数量 为一个或多个，所述长期保留标记的细胞群或其子代是并且持续是BrdU阳性(BrdlT)， 所述长期保留标记的细胞群或其子代定位在组织特定的微环境内，进一步，所述的细胞 群或其子代在损伤后3天和4天的再生动力学行为有不同且所述细胞群的再生动力学因组 织不同而不同；d)采用已知的分子标志物以识别BrdU+标记的细胞群或其子代细胞，进一步筛选所 述细胞群表达的新的分子标志物。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，所述识别、定位的干/祖细 胞群源自哺乳动物、啮齿动物来源的心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、卵巢 组织、睾丸组织、胃组织、小肠组织、肌肉组织、皮肤组织、牙组织、肺组织、神经组 织、骨髓组织、脑组织和其他潜在包含干/祖细胞群的任选组织。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，所述识别、定位的干/祖细胞群 源自人类来源的心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、卵巢组织、睾丸组织、胃 组织、小肠组织、肌肉组织、皮肤组织、牙组织、肺组织、神经组织、骨髓组织、脑组 织和其他潜在包含干/祖细胞群的任选组织。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其特征在于，已被标记的所述 细胞群，其子代细胞也能被相应的标记所长期保留并得以识别，并进而对其进行定位， 其中，所述子代细胞由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/ 祖细胞的一种或多种组成。
7.根据权利要求1或2或3或6中任一权利要求所述的方法，标记所述干/祖细胞群 或其子代的物质也可选为氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核 苷(EDU)和其他可长期标记所述细胞群或细胞系或其子代的分子。
8.根据权利要求1或3中任一权利要求所述的方法，用于清除组织内预先存在的增殖 性细胞进而激活干/祖细胞群的物质也可选择为其他可用于肿瘤化疗的化疗试剂或药物 或者选择其他具有同样作用的试剂的一种或多种组合。
9.根据权利要求1或2或3中任一权利要求所述的方法，已知的或未知的分子从非干 细胞群中鉴定以及分离所述干/祖细胞群及其子代的分子标志包括，已知的表面分子， 如蛋白质，配体，糖蛋白，CD分子及其他，未知的可以分离出此细胞群或细胞系或者其 后代的表面分子。已知的胞内标志，如蛋白质，酶；未知的胞内标志，采用这些标志可 以分离出此细胞群或细胞系或者其后代；已知的以及未知的在核内能特异的与此细胞群 或细胞系或者其后代染色体相结合的标志，如蛋白质，DNAs，RNAs,抗体，配体，甲 基化和化学试剂，其中，所述的抗体可以是荧光标记或磁珠富集。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中所述的细胞群或细胞系或 者其后代或者进一步经遗传修饰后作为诸如包含脏器疾病的细胞治疗及组织工程中细胞 来源的应用。
全文摘要
本发明涉及一种识别、定位干/祖细胞及研究其再生动力学的方法和应用，属于成体干/祖细胞领域。具体而言，本发明特别涉及对正常组织中的干/祖细胞进行的识别、定位及研究其动力学行为特征的方法，本发明还特别涉及一种清除所有组织中原先存在的增殖性细胞，进而激活其中干/祖细胞并对激活的干/祖细胞识别和定位的方法和进一步研究其再生受损组织的动力学行为特征的方法。本发明还涉及进一步鉴定所识别的干/祖细胞或其子代表达的分子标志物。本发明的方法具有普遍适用性，可用于有效识别和定位所有成体组织中的干/祖细胞及研究其再生受损组织的动力学行为特征，根据本发明获得的干/祖细胞有益于其在包含例如研究、治疗或诊断方面的应用。
文档编号C12Q1/68GK102021245SQ201010543068
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年1月15日
发明者卢晶晶, 卢淼淼, 卢磊磊, 李福生 申请人:卢磊磊, 李福生