祖细胞的保护和它们的分化的调节的制作方法

专利名称：祖细胞的保护和它们的分化的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用多硫酸化多糖与祖细胞相组合以改进祖细胞的活力(包括改进 祖细胞的深冷保存)，并且提供新颖的组合物、方法和使用。本发明还涉及用多硫酸化多糖 调节祖细胞的增殖和分化的用途。
背景技术：
人类祖细胞是未成熟的细胞，它们产生了所有不同类型的成熟细胞，这些成熟细 胞组成了成体的器官和组织。从祖细胞转变至成熟的、专一性的成体细胞经过了一个被称 为分化的过程。体内的祖细胞采用不同的分化途径来对来自其环境的不同刺激物进行应答。类似 地，在实验室中祖细胞可以通过将它们暴露于不同的生化试剂组合而受到刺激从而沿着不 同的途径分化。在适当的刺激下，除其他组织之外，祖细胞可以分化成血细胞、骨骼、软骨、 脂肪、血管或心肌。由于这个原因，对祖细胞作为治疗的基础用于修复和再生一定范围的组 织和器官的用途产生了极大的兴趣。祖细胞存在于胚胎中，并且也存在于成体组织中例如骨髓、脂肪、皮肤和牙髓中， 尽管与在胚胎中相比数量少很多。这两种类型的成体祖细胞是造血性的(它们生成新的骨 髓和血细胞)、以及非造血性的(它们生成实体器官和组织，例如骨，心脏和软骨)。造血型 成体祖细胞可以从骨髓容易地获得并且已经用于临床。然而，与非造血型成体细胞相关的 技术开发得相当少，这是由于难以获得足够数目的这些细胞并且难以使这些细胞在实验室 中生长。为了在治疗中使用祖细胞，必需的是能够将祖细胞在使用它们之前成功地储藏。 祖细胞必须以一种方式储藏，这样使得它们被有效保藏并且它们的活力得以维持。大体上， 这些祖细胞被深冷保存用于存储并且使用前解冻。细胞培养物的深冷保存(低于-100°C储藏)被广泛用于保持细胞的备份或储备， 而无需与喂养和照顾它们相关联的努力和开支。冷冻过程的成功取决于4个关键的方面 培养物的适当处理、受控的冷冻、适当的储存以及一种适当的深冷防护剂。最后这一点是特 别地重要，并且一种适当的试剂可以有助于保持细胞的活力。在临床情况下，特别地重要的是在深冷保存之后，细胞仍然有活力并且细胞活力 的任何增加将提高治疗的效果。此外，对于祖细胞而言为了治疗有效，它们有必要分化成所要求的细胞类型。因 此，对于开发祖细胞分化的有效调节剂以确保这些祖细胞分化成所要求的细胞类型也存在
着一种需要。而且，对于开发祖细胞增殖的有效调节剂也存在着一种需要。通常令人希望的是 祖细胞在体外和体内都增殖。所以，在深冷保存期间对于一种或多种可以保护祖细胞、增强它们的活力、调节它 们的分化和/或调节它们的增殖的试剂仍存在着一种需要。

发明内容
发明概述诸位本发明人目前已经发现，多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以改 进祖细胞的活力。特别地，诸位本发明人已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子 片段可以增强祖细胞的深冷保存。诸位本发明人也已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节 祖细胞的增殖。本发明人也已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节祖细 胞的分化。调节可以是向上调节或向下调节。已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性 分子片段可以调节分化成软骨细胞、成骨细胞、以及脂肪细胞。特别地，已经发现多硫酸化 多糖或它们的生物学活性分子片段可以诱导软骨形成。这些发现表明多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以与祖细胞进行组 合使用以便在深冷保存之后改进或增强祖细胞的活力，并且可以按照体外和体内的方法和 用途与祖细胞进行组合使用。所以，这些出乎意料的发现开启了在许多新应用中使用多硫酸化多糖或它们的一 种生物学活性分子片段的可能性。例如，通过调节分化，特别是软骨形成，除其他事物之外 还有可能重建软骨和椎间盘，防止关节退化并且增强无血管结缔组织的修复。本发明之前， 并不知道多硫酸化多糖可以调节祖细胞的分化，特别是软骨形成。而且，通过调节增殖，有 可能在体外和体内都控制祖细胞的生产。当与骨关节炎(OA)治疗本身相关的多硫酸化多 糖的使用公开时，以前并不知道多硫酸化多糖具有与祖细胞相关的有利的深冷保存特性、 或者并不知道它们可以调节所述细胞的分化和/或细胞增殖。所以，这开启了以前没有考 虑到的新的治疗途径。如在此所使用的，一种“生物学活性分子片段”是本发明的一种分子的一部分，它 保持全长分子的定义的活性，即在一个实施方案中能够增强活力、调节细胞分化和/或调 节细胞增殖。相应地，在第一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括一种祖细 胞以及一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细胞、以及 一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及一种载体介质。该载体介质可以是一种培养基、生物支架、深冷保存介质、生理介质、和/或一种 药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细胞以及 一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段，以及一种深冷保存介质。该组合物在体外和体内都可以使用。该组合物可以包含任何数量的祖细胞。在另一个实施方案中，本发明包含约1000 至约IxIOici个祖细胞。在另一个实施方案中，本发明包含约IxlO5至IxlO9个细胞。在另一 个实施方案中，本发明包含约100，000至约5xl08个祖细胞。在另一个实施方案中，本发明 包含约500，000至约2xl08个祖细胞、约IxlO6至约2xl08个祖细胞、或约IxlO6至约IxlO8个祖细胞。在又另一个实施方案中，该组合物包含约1x106、2X106、3X106、4X106、5X106、6X106、 7x106、8X106、9X106、1X107、2X107、3X107、4X107、5X107、6X107、7X107、8X107、9X107、1X108、 2x108、3X108、4X108、5X108、6X108、7X108、8X108、或 9xl08 个祖细胞。在又另一个实施方案中， 该组合物包含约IxlO8个祖细胞。在一个实施方案中，在该组合物中该多硫酸化多糖的浓度将取决于该组合物中的 细胞的数量。因此，在一个实施方案中，在该组合物中该多硫酸化多糖的浓度是从500ng/ ml/百万个细胞至10mg/ml/百万个细胞、或500ng/ml/百万个细胞至2000 μ g/ml/百万 个细胞、lyg/ml/百万个细胞至ΙΟΟΟμ g/ml/百万个细胞、或1 μ g/ml/百万个细胞至 500 μ g/ml/百万个细胞。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内500ng至10μ g/ml/ 百万个细胞；1 μ g至10 μ g/ml/百万个细胞；1 μ g至8 μ g/ml/百万个细胞；1 μ g至6 μ g/ ml/百万个细胞；Iyg至5μ g/ml/百万个细胞；Iyg至3μ g/ml/百万个细胞；2yg至 6 μ g/ml/百万个细胞；2. 5 μ g至5 μ g/ml/百万个细胞；或3 μ g至5 μ g/ml/百万个细胞。 在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内1 μ g至100 μ g/ml/百万个 细胞；1 μ g至50 μ g/ml/百万个细胞；1 μ g至20 μ g/ml/百万个细胞；1 μ g至15 μ g/ml/ 百万个细胞；10 μ g至100 μ g/ml/百万个细胞；20 μ g至100 μ g/ml/百万个细胞；或50 μ g 至100 μ g/ml/百万个细胞。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内 1 μ g 至 1，000 μ g/ml/ 百万个细胞；100 μ g 至 800 μ g/ml/ 百万个细胞；100 μ g 至 600 μ g/ ml/百万个细胞；100 μ g至500 μ g/ml/百万个细胞；200 μ g至500 μ g/ml/百万个细胞。在 另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在250 μ g至500 μ g/ml/百万个细胞的范围内。在一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度包括500ng、ly g、2y g、2. 5μ g、5y g、 ομ g、15y g、20y g、30 μ g、40 μ g、50 μ g、60y g、70 μ g、80 μ g、90 μ g、100 μ g、150 μ g、 200 μ g>250μ g、300 μ g>350 μ g、400 μ g、450 μ g、500 μ g>550 μ g、600 μ g、650 μ g、700 μ g、 750 μ g、800y g、850y g、900y g、950y g、1000 μ g、1050 μ g、1100 μ g、1150 μ g、1200 μ g、 1250 μ g、1300 μ g、1350 μ g、1400 μ g、1450 μ g、1500 μ g、1550 μ g、1600 μ g、1650 μ g、 1700 μ g、1750 μ g、1800 μ g、1850 μ g、1900 μ g、1950 μ g、或 2000 μ g/ml/ 百万个细胞。在 另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度包括多硫酸化多糖的浓度包括200 μ g/ml/ 百万个细胞、250 μ g/ml/百万个细胞、300 μ g/ml/百万个细胞、400 μ g/ml/百万个细胞、或 500 μ g/ml/百万个细胞。在又另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度包括250 μ g/ml/ 百万个细胞或500 μ g/ml/百万个细胞。可替代地，该多硫酸化多糖的浓度独立于该组合物中细胞的数量。因此，在本发 明的另一个实施方案中，在该组合物中该多硫酸化多糖的浓度是从500ng/ml至10mg/ml ； 500ng/ml 至 2000 μ g/ml ；1 μ g/ml 至 1000 μ g/ml ；或 1 μ g/ml 至 500 μ g/ml。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内500ng至10μ g/ml ；
1μ g 至 10 μ g/ml ； 1 μ g 至 8 μ g/ml ； 1 μ g 至 6 μ g/ml ； 1 μ g 至 5 μ g/ml ； 1 μ g 至 3 μ g/ml ；
2μ g M 6 μ g/ml ；2. 5μ g至5μ g/ml ；或3yg至5yg/ml。在另一个实施方案中，该多硫 酸化多糖的浓度在以下范围内1μ g至100μ g/ml ；1μ g至50 μ g/ml ；1μ g至20 μ g/ml ； 1 μ g 至 15 μ g/ml ； 10 μ g 至 100 μ g/ml ； 20 μ g 至 100 μ g/ml ；或 50 μ g 至 100 μ g/ml。在 另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内lyg至1000yg/ml ； IOOyg至800 μ g/ml ； 100μ gM 600 μ g/ml ；ΙΟΟμ gM 500 μ g/ml ；200μ gM 500 μ g/ml。$另一^^$ 施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内Img至I1OOOygAil ；100 μ g至800 μ g/ ml ； 100μ g 至 600μ g/ml ； 100 μ g 至 500 μ g/ml ；200 μ g 至 500 μ g/ml。在另一个实施方案 中，该多硫酸化多糖的浓度在250 μ g至500 μ g/ml的范围内。进一步，多硫酸化多糖的浓度包括500ng、ly g、2y g、2. 5μ g、5y g、10y g、15y g、 20μ g、30y g、40y g、50y g、60y g、70y g、80y g、90y g、100y g、150y g、200y g、250 y g、 300 μ g>350μ g、400 μ g、450 μ g、500 μ g>550μ g、600 μ g、650 μ g、700 μ g>750μ g、800 μg、 850 μ g、900y g、950y g、1000y g、1050 μ g、1100 μ g、1150 μ g、1200 μ g、1250 μ g、1300 μ g、 1350 μ g、1400 μ g、1450 μ g、1500 μ g、1550 μ g、1600 μ g、1650 μ g、1700 μ g、1750 μ g、 1800 μ g、1850 μ g、1900 μ g、1950 μ g、或2000 μ g/ml。进一步，多硫酸化多糖的浓度包括 200 μ g/ml、250 μ g/ml、300 μ g/ml、400 μ g/ml、或500 μ g/ml。进一步，多硫酸化多糖的浓度 包括 250 μ g/ml 和 500 μ g/ml。进一步，组合物包含的总多硫酸化多糖含量为Img、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、 8mg、9mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、70mg、80mg、 90mg、或100mg。进一步，组合物包含的总多硫酸化多糖含量为15至70mg、20至60mg、或 25 至 50mg。另一个实施方案包括约IxlO6至IxlO8个祖细胞以及25至50mg多硫酸化多糖。 另一个实施方案包含IxlO8个祖细胞以及25至50mg/ml多硫酸化多糖。在另一个实施方案中，该硫酸化多糖可以按照一个量值进行施用，从而在该生物 学区室中产生0. 01至100微克/ml生物介质浓度的多硫酸化多糖，例如0. 1至50微克/ml 生物学介质、0. 1至50微克/ml生物学介质、0. 1至10微克/ml生物学介质、1至10微克/ ml生物学介质、2至8微克/ml生物学介质、4至6微克/ml生物学介质、或4、5、或6微克 /ml生物学介质。提及生物学区室，它是指身体的一个区域，例如椎间盘、肌肉、滑膜关节、内滑膜组 织(半月板、滑膜)、外滑膜组织(关节囊(capsule))、内腱、外腱、贲门、心包、心肌、和/或 内脂肪组织、内韧带、外韧带、内真皮、皮下、腹膜内、静脉内、动脉内。该生物学介质将取决 于这种生物区室。生物学介质包括血液、血清、血浆、滑液、腹膜液、浆液、或脂肪组织。因 此，例如在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖可以按照一个量值进行施用，从而在滑膜关 节中产生1至10微克/ml滑液浓度的多硫酸化多糖。载体介质该组合物可以包含一种载体介质。在一个实施方案中，该载体介质是一种水性溶 液。该介质可以可任选地含有其他组分，这些组分保持了这些细胞的正常生理结构和功能， 特别地与维持它们的环境渗透压、PH、它的质膜和胞内细胞器的完整性和流动性相关。适合于本发明的载体包括常规单独地以及组合使用的那些，例如水、盐水、含水 葡萄糖(aqueous dextrose)、乳糖、格林氏溶液、哺乳动物克-林二氏溶液、厄尔氏溶液 (Earles' s solution)、盖氏溶液(Gey，s solution)、西蒙氏溶液(Simm' s solution)、台 罗德溶液(Tyrode solution)、透明质酸物(hyaluronan)、生理缓冲盐水(PBS)、洛克氏溶 液(Locke，s solution)、汉克斯氏溶液(Hank，s solution)、克-路二氏缓冲剂、缓冲剂； 由以下构成的缓冲剂MES-Na0H、HEPES-NaOH, TRICINE-NaOH, EPPS-NaOH, BICINE-NaOH,Tris (羟甲基)氨基甲烷-HC1、甘氨酸-NaOH、碳酸氢钠-CO2、碳酸钠-碳酸氢钠、二甲基 胂酸钠、马来酸氢钠-NaOH;培养基例如伊格尔培养基(Eagle’ s medium)、杜伯科氏培养 基或缓冲剂(Dulbecco，smedium orbuffer)、麦科伊氏培养基(McCoy，s medium)、克里克 氏培养基(Click，s medium)、埃姆斯氏培养基(Ames，medium)、α MEM、DMEM、Ham，s F12、 Ham，s F10、RPMI-1640CMRL 1066和1415 NCTC 135 ；商购的专门的细胞系培养基例如 Stemline 和 Megacell 、或商购的深冷保存试剂例如 profreeze(g^nCryoStor 。因此，在一个实施方案中，该载体介质是一种水性介质，它可以任选地进一步包括 以下组分中的一种或多种-有机盐和/或无机盐；-缓冲剂类-蛋白类，如BSA或转铁蛋白(transferin)；-生长因子类和细胞因子类，包括胰岛素样生长因子、胰岛素、成纤维细胞样生长 因子、BMP-TGF- β超级家族(例如，ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8、TGF β )以及成纤维细胞生长因 子家族、IGF、FGF、EGF、PDGF, VEGF ；-动物血清，包括FBS、新生胎牛/小牛、所有其他哺乳动物物种；-深冷保存剂类，如Profreeze 和 CryoStor ；-深冷保护剂类，包括二甲亚砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖类、或二甲基 乙酰胺；-碳水化合物类；-维生素类/辅因子类；-激素类-抗生素类-附着因子类；-氨基酸类；-血浆增容剂，如葡聚糖；-人类和其他哺乳动物物种的血浆；_血浆代用品；-透明质酸物(hyaluronan)和/或透明质酸，包括自然的或交联的两者。因此，在一个实施方案中，该载体介质包括一种水性介质，该介质水、盐水、含水 葡萄糖、乳糖、一种缓冲溶液、透明质酸物和乙二醇类、生理缓冲盐水(PBS)、格林氏溶液、洛 克氏溶液、汉克斯氏溶液、最低基础培养基，最低基础培养基α (0|^11)，或01^11。在一个实 施方案中，该载体介质包括α MEM。在一个可替代的实施方案中，该载体介质包括DMEM。在 一个可替代的实施方案中，该载体介质包括HAMS 12。该载体介质可以额外地包括深冷保存剂类，例如专有制备品，像Profreeze 或 CryoStor ο在一个可替代的实施方案中，该载体介质可以包括深冷保存剂类，例如像 Profreeze 或CryoStor 这样的专有制备品作为水性溶液。在该实施方案中，该组合 物不包含以下载体如，水、盐水、含水葡萄糖、乳糖、格林氏溶液、一种缓冲溶液、透明质酸 物、生理缓冲盐水(PBS)、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、α MEM ;DMEM;或HAMS F12，并且相反，包括一种深冷保存剂，例如像Profreeze 或CryoStor 这样的专有制备品，可任选地 与一种或多种以下的深冷保护剂相组合例如二甲亚砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他 糖类、或二甲基乙酰胺。作为一个例子，该载体介质可以包括Profreeze 和DMSO或由其 组成。该载体介质可以作为一种培养基，并且可以添加有机盐和/或无机盐、碳水化合 物类、维生素类、氨基酸类和/或其他实体，它们满足了细胞的营养要求，允许它们在体 外正常地分裂并且发挥作用。在一个实施方案中，该载体介质进一步包括血清和/或蛋 白添加物。因此，该培养基可以添加蛋白，包括但不限于BSA或转铁蛋白。除此之外，或 作为替代，该培养基可以添加血清，例如胎儿或新生儿血清，它们含有生长因子，例如胎 牛血清。这种制备品的配方以及使用这些介质的方法对于本领域的普通技术人员而言 是熟知的。适合的介质可见于 Adams RLP. Cell culture for Biochemists. Elsevier/ North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford. 1980, pp 84—97 and pp 246-260. (ISBN 0-444-80199-5)，和 Dawson RMC, Elliott DC, Elliott WH and Jones KM,Data forBiochemical Research(Third Edition),Clarendon Press,Oxford,2002,pp 417-448 (ISBN 0-19-855299-8)，其内容以其全文进行结合。在一个实施方案中，该载体介质作为一种深冷保存介质。用于冻融细胞的的深冷 保存介质包括使用通常已知的载体和/或培养基，包括在此说明的水性介质(单独使用 或与血清蛋白添加物相组合)。可替代地，该载体介质可以包括或包含专有制备品，例如 Profreeze 和CryoStor 。为了作为一种载体介质发挥作用，通常加入了保护细胞膜和 细胞器免于在冻融过程中形成由冰晶损伤的化合物。因此，在另一个实施方案中，该载体介质进一步包括一种或多种深冷保护 剂。适当的试剂或深冷保护剂包括二甲亚砜(DMS0)、甘油、蔗糖以及其他糖类。适当 的试剂的例子可以见于 Brudder S, Jaiswal N, Hainsworth S, W09739104 ；Farrant, J. 1980.Generalobservations on cell preservation. In :M. J. Ashwood-Smith and J.Farrant, Eds. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology, Pitman Medical Limited, Kent, England, p.1-18 ；Frederick V, et al. Recovery, survival and functional evaluation by transplantation offrozen-thawed mouse germ cells. Human Reprod. 2004,19 :948-53, Pegg DE, Principles of Cryopreservation. Methods Mol Biol. 2007 ;368 :39-57，其内容通过引用结合在此。因此，在另一个实施方案中，该 载体介质进一步包括一种试剂或深冷保护剂，它选自以下各项中的一种或多种二甲亚砜 (DMSO)、甘油、蔗糖和其他糖类。可替代的深冷保护剂包括二甲基乙酰胺(作为甘油的一种 替代)、海藻糖和/或蔗糖。在另一个实施方案中，该载体介质包括常规的深冷保护剂，可任 选地与生长因子类和/或分化因子类相组合。适合的载体介质的例子可见于W09832333、 W09739104 或 W01997/039104。在又另一个实施方案中，该载体介质进一步包括一种专有配制品，例如 Pro freeze 和 CryoStor 。Profreeze 由 Lonza-BioWhittaker 作为含有无动物来源组 分的冷冻介质而出售。该载体介质可以添加有在此中讨论的试剂或保护剂，特别是DMS0、甘油、蔗 糖和其他糖类，并且进一步特别是DMS0。在一个具体实施方案中，该载体介质包括Profreeze TM⑶NAO冷冻介质，可任选地与DMSO相组合。在另一个实施方案中，该载体 介质包括α MEM、Profreeze TM⑶NAO冷冻介质和DMSO。本发明考虑并包括了该载体介质实现多种要求的可能性。因此，该载体介质既可 以作为一种培养基也可以作为一种深冷保存介质发挥作用。同样地，该载体介质既可以作 为一种深冷保存介质也可以作为一种药学上可接受的载体发挥作用。该载体介质可以包括二甲亚砜(DMSO)和/或甘油。在一个实施方案中，该载体介 质包括二甲亚砜(DMSO)。在另一个实施方案中，该组合物包括至20% DMS0。在又另一 个实施方案中，该组合物包括 -15% DMS0,5% -15% DMSOU % -10% DMS0,5% DMSO, 7. 5% DMSOUO% DMS0U5% DMSO或20% DMSO。在一个具体实施方案中，该DMSO是高纯度 等级的DMSO。一些细胞可能会通过延长与DMSO的接触而受到不利影响。这可以通过在4°C下向 该细胞悬液加入DMSO并且在刚刚融化时将它除去而被降低少或消除。可替代地，可以使用 更低浓度的DMSO。作为一种另外的可能性，该载体介质可以包括甘油而不是DMS0。因此，在一个可替 代的实施方案中，该载体介质可以包括甘油。在一个实施方案中，甘油按照以下浓度存在 1% ~30%Λ% -20%,5% -20%U% -15%,5% -15%U% -10%或 5% -10%。在一个实施方案中，该介质包含DMSO或甘油与DMEM、HETA-淀粉和/或人血清组 分和/或其他增量剂相组合。在一个实施方案中，该载体介质对于注射液是可接受的，并且不影响这些细胞的 功能性。在一个实施方案中，该载体包含血清。在另一个实施方案中，该载体是一种无血清 的载体。在一个实施方案中，该载体介质包含血清，在一个实施方案中是人血清组分。在一 个实施方案中，该载体介质进一步包括胎牛血清(FBS)。在一个实施方案中，该组合物包括 1%-50% FBS0在另一个实施方案中，该组合物包括1 % -20% FBS、1% -10% FBS,5% FBS、 7. 5% FBSUO% FBSU5% FBS或20% FBS。可替代地，适合的血清包括在同样可能的浓度 下的BSA、转铁蛋白和/或卵黄蛋白。一种基于血清的深冷保存介质的例子可以是一种载体介质，该载体介质包括一 种水性溶液(例如，格林氏溶液、生理缓冲盐水(PBS)、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、α MEM、 DMEM或HAMSF12)以及一种深冷保护剂(例如，二甲亚砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他 糖类、或二甲基乙酰胺)以及血清(例如，FBS)。因此，一个示例性的基于血清的深冷保存介质可以是一种载体介质，它包括DMEM 或α MEM、DMSO以及血清(例如，使用胎牛血清)。该载体介质也可以是无血清的和/或无蛋白的，并且可以是一种化学确定成 分的介质。无血清介质的例子包括KnockOut SerumReplacement, KnockOut D-MEM、 StemPro -34SFM。一种无血清介质的例子可以是一种载体介质，它包括一种水性溶液(例如，格林 氏溶液、生理缓冲盐水(PBS)、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、aMEM、DMEM或HAMS F12)以及一 种深冷保护剂(例如，二甲亚砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖类、或二甲基乙酰胺) 以及一种深冷保护介质(例如，像Profreeze 或CryoStor 这样的专有制备品)。
因此，一种示例性的基于血清的深冷保存介质可以是一种载体介质，该载体介质 包括 α MEM、DMSO 以及Profreeze 、或仅仅是 DMSO 禾PProfreeze 。在一个实施方案中，该载体介质包括Pro freeze 。Pro freeze 是一种无血清
的冷冻介质，并且专门被配制为用于深冷保存已经在无血清的介质中繁殖的细胞。这种无 蛋白、无动物组分的介质是不含自然的动物蛋白的，并且当从冷冻存储复苏时保持着高细 胞活力。在另一个实施方案中，该载体介质包括Profreeze 以及DMS0，其中该DMSO可任 选地是7. 5%或15%。可替代地，该载体介质可以包括CRYOSTOR CryoStor 。在一个实施方案中，该介质可以包括缓冲剂类。缓冲剂类包括DMEM、磷酸盐缓冲 液、或CMF-PBS。本发明涵盖了通常使用的生理缓冲剂类。示例性的缓冲剂可见于文献中，例 如Lelong IH andRebel G. pH drift of"physiological buffers"and culture media used forcell incubation during in vitro studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 1998 ； 39 203-210 ；John A Bontempo. Development ofBiopharmaceutical Parenteral Dosage Forms, in Drugs and thePharmaceutical Sciences.Marcel Dekker Inc, NY(ISBN 0-8247-9981-X) :pp 91-108，其内容通过引用结合在此。该介质可以任选地进一步包括糖类(包括葡聚糖、海藻糖、蔗糖)或二甲基乙酰 胺(DMA)。在一个实施方案中，该组合物包括多个祖细胞；多硫酸化多糖以及一种载体介质， 该载体介质包括_ 一种水性介质，选自水、盐水、含水葡萄糖、乳糖、格林氏溶液、一种缓冲溶液、 透明质酸物、乙二醇类、生理缓冲盐水(PBS)、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、aMEM、DMEM、或 HAMSF12 ；-一种深冷保存介质，包括卩1*0&6626(1)或CryoStor ；以及-一种深冷保护剂，选自二甲亚砜(DMSO)和/或甘油。-在一个实施方案中，该深冷保存介质是Profreeze 。在一个实施方案中，该水性介质是a MEM或DMEM。在一个实施方案中，该深冷保护剂是DMSO。在一个实施方案中，该水性介质以-99%、约10%、约20%、约30%、约40%、 约50%、约60%、约70%、约80%、或约90%存在。在一个实施方案中，该深冷保存介质以-99%，约10%、约20%、约30%、约 40%、约50%、约60%、约70%、约80%、或约90%存在。在一个实施方案中，该深冷保护剂以-50%、1% -30%、1% _15%、1% -10%、 1% -7. 5%,2. 5%,5%,7. 5%,10%,12. 5%,15%,17. 5%或 20%的量存在。在另一个实施方案中，提供了多个祖细胞与一种多硫酸化多糖或它的生物学活性 分子片段，深冷保存于约5mL的Profreeze TMO)NA0冷冻介质、7. 5% DMSOjP 50% a MEM 中。在深冷保存的那个时间细胞浓度可以是在5mL冷冻介质中90xl06个细胞/深冷袋至 180x106个细胞/深冷袋。在又另一个实施方案中，该载体介质包括一种支持基质。该支持基质另外可以指 生物基质或生物支架。在另一个实施方案中，本发明提供了一种增强祖细胞的深冷保存的方法，包括将这些祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片 段用于增强祖细胞的深冷保存的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了一种改进祖细胞的活力的方法，包括将这些 祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片 段用于改进祖细胞的活力的用途。在另一实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖作为一种深冷保存剂的用 途。在另一个实施方案中，本发明提供了一种如在此所定义的组合物用于增强祖细胞 的深冷保存的用途。在另一实施方案中，本发明提供了一种改进祖细胞活力的方法，包括深 冷冻存如在此所定义的一种组合物并且随后融化该组合物。因此，将多硫酸化多糖加入到深冷介质中对祖细胞没有不良作用、并且对它们的 活力没有有害的作用已经第一次得到证明。事实上，将多硫酸化多糖加入到深冷介质中已 经显示出增强了祖细胞的活力。此外，已经显示出将多硫酸化多糖加入到祖细胞中保持或改进了祖细胞本身的活 力。因此，在另一个实施方案中，提供了多硫酸化多糖用于保持或改进祖细胞的活力的用 途。在另一个实施方案中，提供了一种保持或改进祖细胞活力的方法，该方法包含将一种多 硫酸化多糖与该祖细胞进行接触。还已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节祖细胞的增殖。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞增殖的方法，该方法包 括将一种祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片 段用于调节祖细胞的增殖的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了一种如在此定义的组合物用于增加增殖的用 途。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞增殖的方法，该方法包括使 用一种如在此定义的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种如在此定义的组合 物用于调节祖细胞的增殖的用途。在一个实施方案中，增殖是增加的或向上调节的。因此，将多硫酸化多糖与祖细胞一起使用可以改进这些祖细胞的增殖已经第一次 得到证明。这些多硫酸化多糖以一种浓度依赖的方式刺激祖细胞增殖。所以，多硫酸化多 糖可以用于其中增殖这些细胞是令人希望的应用中。例如，祖细胞的体外增殖将用于集落 的扩展用于生物工程领域内的应用。作为一个例子，一种生物支架可以用祖细胞的集落浸 渍，并且在37°C下由含有一种或多种多硫酸化多糖的培养基灌注。这将促进增殖从而进 一步移入并填充该支架，从而提供一种更加功能化的替代组织。作为另一个例子，一种预 先成型的(管状或半球形)生物支架可以与自体的或异体的祖细胞一起种下，并且用含有 一种或多种多硫酸化多糖的介质灌注，从而最终生成一种在宿主中(其中这些软骨是缺损 的)用于移植的气管或关节表面。关于这些用途的进一步信息可见于在Chen FH andTuan RS. Mesenchymal cells in rhematic diseases. Arthritis researchand Therapy. 2008 ；10 :223-239。体内多硫酸化多糖刺激增殖将利于促进移植物进入到大的缺陷处(例如，在关 节软骨中)或剥夺了活性的内源驻留细胞的隔区中(例如，椎间盘的中心)，由此减少了 修复和重建这种缺损所要求的时间。因为祖细胞也是抗炎细胞因子和免疫抑制因子的 一禾中丰富的来源(参见，例如 Aggarwal S and Pittenger A, Human progenitorcells modulate allogeneic immune cell responses. Blood. 2005 ;105 :1815—1822、Tyndale A, et al. Immunomodulatory properties ofprogenitor cells :a review based on an interdisciplinary meeting held atthe Kennedy Institute of Rheumatology Division, London, UK, 310ctober 2005. Arthritis Res Ther. 2007 ；9 :301_15 ； Jorgensen C,et al. Multipotent mesenchymal stromal cells in articular disease. BestPractice and Research Clinical Rheumatology. 2008 ;22 :269284)，它们在炎症部位的增殖或注射 之后的抗原应答将增加对抑制这些不想要的细胞加工的潜力。还已经发现多硫酸化多糖可以调节祖细胞的分化。该分化可以是向上调节或向下 调节。在另一个实施方案中，提供了一种调节祖细胞的分化的方法，这是通过将一种祖 细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的一种生物学活性分子片段来进行的。在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段用于 调节祖细胞的分化的用途。本发明调节了祖细胞的分化。本发明的细胞可以分化成软骨细胞、成骨细胞、以及 脂肪细胞谱系，并且在一个实施方案中可以分化成不同谱系的细胞类型，包括骨骼、软骨、 脂肪、肌肉、腱、以及间质(stroma)。具体地，在本发明的一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分 子片段可以调控分化成软骨细胞。在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物 学活性分子片段可以调节分化为成骨细胞。在又另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或 它们的生物学活性分子片段可以调节分化成脂肪细胞。在另一个实施方案中，这些多硫酸 化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成纤维软骨细胞。在另一个实施方案 中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成腱细胞(tenocyte)。 在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成心 脏细胞(cardiocyte)。特别地，已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节并诱导软 骨形成。在另一个实施方案中，本发明调节了祖细胞中软骨形成，这些祖细胞支持软骨细 胞表现型的分化和存活率。因此，一方面，本发明涉及软骨细胞或纤维软骨细胞的形成。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖向上调节了分化。在一个可替代的实施方 案中，该多硫酸化多糖向下调节了分化。在本发明的一个实施方案中，提供了一种在祖细胞中调节软骨形成的方法，该方 法包括将一种多硫酸化多糖施用一种祖细胞。在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖用于调节祖细胞中软骨形成的用 途。
在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖用于向下调节祖细胞中成骨作用 的用途。在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖用于阻止祖细胞中成骨作用的用 途。本方法或用途可以用于其中骨骼的生成对于宿主将是有害的应用中，例如在软组织部 位，这些部位要求灵活性以及活动用于正常的功能，例如肌肉(心脏)、间质、支持性结缔组 织、等等，或在以下部位，其中骨骼可能碰撞或缠绕神经纤维/神经根或血管，导致感觉异 常、麻痹、局部缺血以及潜在的不可逆的组织损伤。在另一个实施方案中，提供了一种处理细胞来经历软骨形成的方法，该方法包括 将一种祖细胞与有效量的一种多硫酸化多糖或它的一种生物学活性分子片段进行接触，持 续一段时间，并且在刺激该细胞分化的条件下。祖细胞术语“祖细胞”是指包括任何多能(multipotent)细胞。因此，术语祖细胞涵盖了 成体细胞和胚胎干细胞。在一个实施方案中，该祖细胞是一种间充质祖细胞。在另一个实施方案中，该祖细胞是一种内源性或外源性的胚胎的、或成体间充质 的、或间充质的祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞是一种多能的间质细胞。在另一个实 施方案中，该细胞是一种成体未分化的间充质细胞。在另一个实施方案中，祖细胞是一种软骨祖细胞。在一个实施方案中，这些祖细胞 是从骨髓衍生的。可替代地，这些祖细胞从软骨、滑膜组织、肌肉、脂肪组织、皮肤、脐带、牙 髓、或其他可获得的来源衍生的。在一个实施方案中，该祖细胞是一种体细胞，例如被内源性因子抑制分化的结缔 组织细胞。在另一个实施方案中，这些祖细胞是富集Stro-Itoi的细胞、或同质的Stro-Itoi细 胞、或Stro-Itoi子代细胞的群体。多硫酸化多糖该多硫酸化多糖家族可以被认为是任何天然发生的或半合成/合成的多硫酸化 多糖或它的一种生物学活性片段，它包含两个或多个糖环或碳水化合物结构，其中一个或 多个硫酸酯基团共价连接到该环或该结构上，正如通过肝素和多硫酸戊聚糖例证。根据一个实施方案，该多硫酸多糖或它的生物学活性片段可以是选自(但不限 于)自然发生的高分子量肝素、低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、多硫酸戊聚糖、多硫酸软骨 素、多硫酸壳聚糖、多硫酸皮肤素舒洛地昔、多硫酸葡聚糖、多硫酸化胰岛素、硫酸化乳糖酸 酰胺、硫酸化双醛糖酸酰胺、八硫酸蔗糖、墨角藻聚糖-1、墨角藻聚糖-2、硫酸化β-环糊 精、硫酸化Y-环糊精以及小的硫酸化的化合物，包括但不限于肌醇六硫酸酯。在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖包括多硫酸戊聚糖、多硫酸软骨素、多 硫酸壳聚糖、多硫酸葡聚糖以及肝素(高和低分子量)。在又另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖、多硫酸葡聚糖以及 肝素。在又另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖的钠 盐(NaPPS)、戊聚糖多硫酸酯的镁盐(MgPPS)、和/或戊聚糖多硫酸酯的钙盐(CaPPS)。
一种具体的多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖(PPS)或它的钠盐。多硫酸戊聚糖已经 显示出改进祖细胞的活力、增强祖细胞的深冷保持、调节祖细胞的增殖和/或调节祖细胞 的分化。多硫酸戊聚糖已经显示出向上调节分化，并且特别是诱导软骨形成。一种可替代的多硫酸化多糖是多硫酸葡聚糖。多硫酸葡聚糖已经显示出向下调节 或抑制分化，并且特别是向下调节或抑制软骨形成。用途本发明的祖细胞可以分化成许多细胞类型，包括软骨细胞、纤维软骨细胞、成骨 细胞以及脂肪细胞。因为祖细胞可以分化成软骨细胞或纤维软骨细胞，这些细胞在生成细胞外基质中 是有用的。细胞外基质可以适用于移入到需要这种治疗的患者体内的结缔组织缺损中。本发明可用于诱导软骨修复、再生或基质新生并且减缓其分解代谢，这是通过将 一种多硫酸化多糖或它的一种生物学活性分子片段与多个祖细胞相组合来进行的。在另一个实施方案中，本发明的组合物也可以用作一种免疫抑制剂、抗代谢分解 或抗炎剂。作为一个实例，本发明的组合物可以用于治疗类风湿性关节炎。在此所讨论的方法可以在体内或体外使用。在体内，除了其他事项之外，所插入的 祖细胞还可以在原位重建软骨。此外，也可以刺激在关节中驻留的祖细胞来原位重建软骨， 由此形成一种有效的指向性的治疗。在体外，本发明允许在一种生物基质中生成软骨，它可以随后被移植到患者体内。 这可以用来生成软骨以便部分地或全部替换活动关节的表面，用于替换软骨的/纤维软骨 的组织或可以从该过程受益的任何其他组织，它们已经受到损伤或由遗传异常产生，这些 异常需要外科矫治。本发明还发现用于可能未从目前可获得的内科或外科治疗受益的患者。例如，已 经遭受由外伤引起的急性损伤痛苦的许多运动员或个体可能具有软骨/纤维软骨缺损，这 些缺损是具有症状的。本发明提供了一种可以用于刺激新软骨生长来替换该缺损组织的方 法。这可以在体内通过刺激祖细胞在关节原位生长或在体外通过一种适当的生物支架来完 成，该生物支架是成型的从而适合放入该缺损中并且随后插入该缺损中；或者通过体内和 体外两种方法来完成。可替代地，它可以用于具有确定的关节退化的老年患者，例如在外周 关节和脊柱的骨性关节炎中，其中本发明可以用于刺激新软骨的生长从而替换该缺损组织 并阻止骨赘的进展并且降低炎症，这种炎症通常是这些障碍的症状的原因。在一个实施方案中，本发明已经鉴定了一种或多种化合物，这种或这些化合物可 以充当一种深冷保存剂以及可以调节分化的试剂。在一个实施方案中，本发明已经鉴定 了一种或多种化合物，这种或这些化合物可以充当一种深冷保存剂以及可以调节增殖的试 剂。在另一个实施方案中，本发明已经鉴定了一种或多种化合物，这种或这些化合物可以调 节增殖并调节分化。在另一个实施方案中，本发明已经鉴定了一种或多种化合物，这种或这 些化合物可以充当一种深冷保存剂、充当一种调节增殖的试剂、并充当一种可以调节增殖 的试剂。此类多用途的化合物以前没有发现与祖细胞相关。本发明已经鉴别出多个分子家族或它们的生物学活性片段，它们可以独立地或彼 此相组合增强祖细胞的深冷保存、调节它们的细胞增殖和/或调节它们的分化；由此，这些 分子在治疗处理时可以与祖细胞进行组合使用。
具体地，本发明允许祖细胞分化成软骨细胞/成纤维细胞，由此允许形成软骨或 纤维软骨。所以，使用祖细胞和多硫酸化多糖可以用于治疗退行性疾病、治疗软骨/纤维软 骨缺损、和/或阻止退行性疾病和软骨缺损的进展或将其最小化。本发明已经鉴别出一种新颖的组合物。这种组合物具有治疗用途，并且可以有利 地在体内或体外使用。在一个实施方案中，该方法是在体内进行的。可替代地，该方法是在 体外进行的。所以，在本发明的一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的用作药物的组合 物。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗由 软骨断裂或减小所影响的任何疾病，包括肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、骨 性关节炎(OA)、以及椎间盘退行性变(DD)、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新 生的方法。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗由 软骨断裂或减小所影响的任何疾病，包括肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、骨 性关节炎(OA)、以及椎间盘退行性变(DD)、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新 生的方法。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗以 下任何疾病，其中经由成骨作用的祖细胞分化是不想要的。例如，骨形成通常对于软组织修 复(例如，盘内注射)是不想要的。细胞从椎间盘进入到脊椎管中或到邻近器官上(例如， 食管)的渗漏可能是灾难性的。这样的一个例子可以在将BMP-2置于椎间盘隔间中来促进 脊柱融合(新骨)时看到。已经发现使用重组骨形成蛋白导致了威胁生命的并发症，因为 邻近该椎盘隔间形成的异位性骨，它造成气道和神经压迫。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗被 脂肪组织的断裂或减少所影响的疾病。在本发明的另一个实施方案中，在此提供了 一种如在此所说明的组合物用于制 造对由软骨断裂或减小所影响的任何疾病进行治疗的药物的用途，这些疾病包括肌肉骨骼 系统疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、骨性关节炎(OA)、以及椎间盘退行性变(DD)、退行性 疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新生的方法。所以，根据本发明的一个实施方案，在此提供了 一种治疗、减轻、减少或预防由软 骨断裂或减少所影响的任何疾病的方法，这些疾病例如肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性 关节炎(RA)、骨性关节炎(OA)、以及椎间盘退行性变(DD)、退行性疾病；以及诱导软骨修 复、再生或基质新生的多种方法，包括给予治疗有效量的如在此定义的一种组合物。这种应用的例子可以是将本发明的组合物注入具有软骨或椎间盘损伤的个体的 关节中、或全身地用于其他较难达到的位点，允许该制备品灌注该组织和细胞从而发挥其 独特的生物效应。施用可以包括治疗以下个体，这些个体可能不具有临床定义的疾病(通 常是OA或相关障碍)、但已经持续一种由(例如)运动或工作有关的活动所造成的对关节 组织的外伤损害。本发明的方法和用途还可以充当关节镜或开放手术后的一种预防方法，其中软骨 或半月板切除/清创是必需的。已经完全确定的是随着时间推移此类术后患者将普遍地发展到表现出要求内科治疗的症状的OA。通过减少软骨退化使得多种症状得以改进也不是不 可能，这是由于促进炎症的抗原产生减少的缘故。由此，使用在此讨论的本发明的组合物来调节引入到患者体内的祖细胞的分化和 /或细胞增殖，能够用于治疗、减轻、减少或防止由软骨断裂或减少所影响的任何疾病。特定 的疾病包括肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、骨性关节炎(OA)、以及椎间盘 退行性变(DD)、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新生的方法。在一个实施方案中，该组合物是通过静脉内进行给药的。根据又另一个实施方案， 该组合物是全身给药的。根据又另一个实施方案，该组合物是通过关节内进行给药的。根 据又另一个实施方案，该组合物是通过椎间盘内进行给药的。根据又另一个实施方案，该组 合物是全身给药的。在一个实施方案中的是将一种多硫酸化多糖与多个祖细胞相组合注射到该患者 的一个关节或多个关节中的方法。该多硫酸化多糖帮助调节这些祖细胞的分化和/或增殖。额外地，已经发现本发明的多硫酸化多糖还能够在分化的细胞中生成、向下调节 透明质酸物或透明质酸(HA)、或刺激透明质酸物或透明质酸(HA)的产生。这种透明质酸 (HA)可以在一种动物或细胞中(即一种动物体内或在一种体外的细胞中)产生。这个出乎意料的发现意味着本发明的组合物可用于替换关节中(特别是滑液中) 由于正常磨损和撕裂、退行性疾病或其他急性外伤的HA损失。因为滑液退化，它保护并润 滑关节的能力被降低。这使关节进一步退化，并且还可以刺激产生又造成进一步损伤的自 身抗原在过去，克服或至少减轻这个问题的一种方法是替换该滑液。然而，本发明提供了一种刺激生成透明质酸物或透明质酸(HA)、而不需要替换该 滑液其自身的手段。本发明的组合物可以与祖细胞进行接触，然后这些祖细胞分化成间充 质细胞(例如，软骨细胞或成纤维细胞)来增加HA的生成。这种HA是原位形成的，并且可 以用于替换滑液中损失的HA，它治疗、减少或至少减轻由这些退行性疾病或组织退化所引 起的损伤。因此，根据另一个实施方案，本发明涉及一种产生、向上调节透明质酸物(HA)或 刺激透明质酸物(HA)产生的方法，包括给予一种如在此定义的组合物。在本发明的一个实施方案中，这些组合物、方法和用途可以用于治疗关节炎或其 他退行性疾病。然而，在一个可替代的实施方案中，本发明排除了治疗关节炎或其他退行性 疾病的方法。确切地，一方面，本发明包括将一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段 与多个祖细胞进行组合给予来对治疗关节炎或其他退行性疾病进行治疗的用途。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗患者的方法，该患者患有肌肉 骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、骨性关节炎(OA)、以及椎间盘退行性变(DD)；退 行性疾病、滑膜关节的骨性关节炎、眼科学、术后腹部粘连的防止、皮肤治疗和修复以及细 胞外基质的功能的恢复；或用于诱导软骨修复、恢复或基质新生，包括给予一种如在此定义 的组合物，从而调节这些祖细胞的分化和/或增殖。该患者或受试者可以是人或动物患者。在一个实施方案中，该患者是一种哺乳动 物，包括人、马、犬、猫、绵羊、奶牛或灵长类动物。在一个实施方案中，该患者是人。该患者 可能患有一种退行性疾病和/或软骨缺损。该患者可能是一位运动员或可能已经遭受一种造成关节损伤的外伤。本发明涵盖了涉及到多硫酸化多糖和祖细胞的治疗方法。本发明还涵盖了这些多 硫酸化多糖和祖细胞用作药物；这些多硫酸化多糖以及祖细胞在制造用于如在此所说明的 治疗的药物中的用途；并且还涵盖了包含这些多硫酸化多糖和祖细胞的组合物和配制品。联合治疗本发明第一次鉴定了还可以调节分化和细胞增殖(特别是调节软骨形成和细胞 增殖)的多肽或它们的一种生物学活性片段。该多肽是α IX胶原的一种非胶原NC4结构 域或它的一种生物学活性分子片段(以下称NC4)。术语“一种生物学活性片段”与术语“一 种生物学活性分子片段”是同义的。出人意料的是，本发明已经发现尽管两个独立的家族可以独立地进行它们对软骨 形成和细胞增殖的调节，当组合在一起时它们能够协同地发挥作用，不仅增加它们各自的 效应而且提供了更大的作用特异性。这些未曾预料的发现开启了在许多新的应用中将一种多硫酸化多糖与NC4进行 组合使用的可能性，因为通过调节软骨形成，除了其他事项之外还有可能重建软骨和椎间 盘、防止关节的退化并且增强无血管结缔组织的修复。在本发明之前，并不知道一种多硫酸 化多糖和NC4的组合可以调节软骨形成和细胞增殖，并且显然不知道该组合会具有一种协 同效应。相应地，在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细 胞以及一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC4或它的一种生物学活性分 子片段。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括一种载体介质、培养基、深冷保存介质 和/或药学上可接受的载体。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细 胞、一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC或它的一种生物学活性分子片 段、连同一种载体介质。该载体介质可以是一种培养基、深冷保存介质或药学上可接受的载体。对本发明的组合物(这些组合物涉及祖细胞和多硫酸化多糖)的任何提及也涉及 包含多个祖细胞、多硫酸化多糖和NC4的组合物，包括浓度、细胞数和/或类型以及任选的 其他成分的量。此外，如在此定义的这些组合物的方法和用途也涉及包括一种多硫酸化多 糖和NC4这两者的组合物。因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种调节软骨形成和/或细胞增殖 的方法，该方法包括给予一种组合物，该组合物包括多个祖细胞、一种多硫酸化多糖或它的 生物学活性分子片段、以及NC4或它的一种生物学活性分子片段。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞增殖的方法，该方法包 括将一种祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC4或它的一 种生物学活性分子片段。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞分化的方法，这是通过 将这些祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC4或它的一种 生物学活性分子片段来进行的。
在一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与SEQ IDNO 1的片段至少 65%的氨基酸一致性。在另一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与SEQID NO 2的片段至少 65%的氨基酸一致性。在又另一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与以下序列的片段至少 65%的氨基酸一致性，这些序列是=SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6,SEQ ID N0:7、SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11、SEQID NO :12、 SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID NO :15、SEQ IDNO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO 19,SEQ IDNO20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22,SEQ ID N0:23、或 SEQ IDNO 24。在另一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与以上列出的片段至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100% 的氨基酸一致性。还有可能的是将本发明的组合物作为联合治疗的一部分来进行给药或使用。例 如，本发明的这种或这些多糖可以与一种或多种其他化合物进行联合给药。这些化合物可 以是一种结构修饰的骨性关节炎药物(SMOAD)。本发明延伸到联合治疗用于治疗在此所讨论的疾病。具体地，在一个实例中，本发 明延伸到使用一种多硫酸化多糖与另外一种试剂相组合用于治疗不同的退行性病症。应当 理解，这些试剂可以在相同的时间或不同的时间上进行给药。因此，该联合治疗可以包括将 这些活性剂一起进行给予，这些活性剂处于单一的配制品中或处于多个配制品中(在相同 的或不同的时间给药)。同样地，该联合治疗可以包括以不同的配制品在不同时间点所给予 的活性试剂。这些配制品可以进行依次给药，并且可以被一段时间(包括数小时、数天、数 周和数月)分开。本发明也延伸到如在此讨论的多硫酸化多糖与一种或多种生长因子相组合的用 途。本发明进一步延伸到如在此所披露的方法、用途、配制品和/或组合物，它们与一种或 多种生长因子相组合。可能的生长因子包括胰岛素样生长因子、胰岛素、成纤维细胞样生长 因子、BMP-TGF-β超家族(例如，81^-2，81^-7，81^-836 0)以及成纤维细胞生长因子家 族、IGF、FGF、EGF、PDGF 禾P VEGF0


图1.多硫酸戊聚糖(PPS)对正常的人类MSC冻/融活力的作用。在37°C水浴中 将人类MSC快速融化，并且用HHF (HBSS，含有5% (体积/体积)胎牛血清)洗涤2次。随 后，将这些细胞以8，000个细胞/cm2种于多个T-75烧瓶中。这些细胞一直生长直到70% 至80%的会合，用胰蛋白酶进行消化，并且以50xl06/ml的细胞浓度在添加指定浓度的PPS 的Profreeze Π. 5% DMSO中将这些细胞深冷保存。将安瓿从液氮库中取回，并且快速 融化、轻轻混合，并且在时间=0、30、60、90和120分钟时去除IOul样品。向每一个细胞样 品中加入290ul台盼蓝，并且进行细胞计数/活力测试。PPS并未对细胞活力产生不利的影 响。图2.柱状图显示在经受冻融循环之后悬浮在含有7. 5% DMSO和不同浓度的多硫 酸戊聚糖(PPS)的深冷介质中不同数量的鼠ATDC5祖细胞的活力。细胞活力是使用线粒体脱氢酶MTT测定来确定的。图3.不同浓度的多硫酸戊聚糖(PPS)对祖细胞在液氮中深冷保存并且快速融化 之后(如图1中所说明)的活力的作用。细胞活力是使用线粒体脱氢酶MTT测定来确定的。 显示的数据=平均值士 SD* = P < 0. 05相对于对照值图4.多硫酸戊聚糖(PPS)对人类祖细胞增殖的作用。原代人类祖细胞在24孔板 中在添加指定浓度的PPS的生长培养基中进行培养。在不同的时间间隔(第1、3、6天)，将 生长培养基去除并且用含有四唑鐺盐WST-I的无酚红的培养基替换，在37°C下/5% C02下 持续2小时。在有活力的细胞中WST-I被线粒体脱氢酶剪切从而产生一种甲臜(formazan) 染料，该染料可以使用ELISA酶标仪在波长450nm处检测到。显示了所有浓度的PPS对于 每个时间点在450nm处的吸光度。在第6天在超过1 μ g/ml的PPS浓度下观察到统计学上 显著的增殖增加Γρ < 0.01, AN0VA)。图5.多硫酸戊聚糖(PPS)对在微团培养(micromass culture) 4天之后人类祖细 胞DNA合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中 所确定。* = ρ < 0. 05广=ρ < 0. 005相对于对照物。图6.多硫酸戊聚糖(PPS)对用凋亡试剂处理的人类祖细胞的作用。将人类祖细 胞铺板于添加指定浓度的PPS的无血清培养基中。祖细胞的凋亡是通过加入30ng/ml IL-4 加上30，000U/ml IFN-y的组合来诱导的。5天培养后，通过胰蛋白酶消化收获细胞，并且 通过钙磷脂结合蛋白AKArmexin V)染色来评估活力。当祖细胞以超过lug/ml的PPS浓度 培养时，观察到了 IFN-Y/IL-4-诱导的凋亡(钙磷脂结合蛋白V阳性细胞)2倍的减少。图7.多硫酸戊聚糖(PPS)对人类祖细胞分化的作用矿化测定。将原代人类祖细 胞在96孔板中在无骨诱导性生长培养基(培养基对照)中或在骨诱导性条件下(a MEM，添 加10% FCS、100 μ ML-抗坏血酸-2-磷酸酯、地塞米松ICT7M和3mM无机磷酸盐)在指定浓 度的PPS的存在下进行培养。第28天，使用甲酚酞络合酮法(Cresolphthalein Complexone method)来确定每个孔的酸可溶的钙的浓度。(A)每yg DNA/孔的酸可溶的钙的浓度是 在使用荧光性DNA染色(Hoeshst 33258)来评估每个孔中DNA总量之后所测定的。当使用 lug/ml和lOOug/ml的PPS的浓度时，观察到矿化基质形成方面的统计学上显著的降低Γρ <0.01, AN0VA)。(B)在Χ20放大倍率下矿化培养物的相差显微照片。图8.多硫酸戊聚糖(PPS)对人类祖细胞分化的作用脂肪细胞的形成。将原代 祖细胞在96孔板中在无脂肪形成性生长培养基中(培养剂对照)或在脂肪形成性条件下 (0. 5mM甲基异丁甲基黄嘌呤、0. 5 μ M氢化可的松、以及60 μ M吲哚美辛)在指定浓度的PPS 的存在下进行培养。第28天，充满脂质的脂肪细胞的存在是使用亲脂性染料油红0来确定 的。每μ gDNA/孔的可溶脂的相对量是在使用荧光性DNA染色(Hoeshst 33258)来评估每 孔的DNA总量之后来测定的。(A)在超过lug/ml的PPS浓度下观察到脂肪细胞数量的统计 学上显著的增加Γρ <0.01, AN0VA)。(A)油红0标记的脂肪细胞在χ20放大倍率下的相 差显微照片。图9.多硫酸戊聚糖(PPS)对鼠祖细胞(祖细胞C3H10T1/2)在单层培养生长时蛋 白聚糖(PG)的生物合成以及DNA含量的浓度依赖性作用。显示的数据=平均值士SD。图10.多硫酸戊聚糖(PPS)对以单层培养生长2天的鼠祖细胞(C3H10TV2细胞)的DNA合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中 所确定。图11.多硫酸戊聚糖(PPS)对人类祖细胞在单层培养2天后进行的蛋白聚糖(PG) 生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如通过将放射性标记的硫酸根(sulfate)掺入到 PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)所确定。这些数据被表示为35S-GAG放射活性，作为每分 钟衰变数(DPM)、归一化为 DNA 含量。* = ρ < 0. 05 广=ρ < 0. 005 ；*** = ρ < 0. 0005。图12.多硫酸戊聚糖(PPS)对蛋白聚糖(PG)生物合成的浓度依赖性作用的柱状 图，正如在6天成团培养的鼠祖细胞细胞(ADTC-5)中通过将放射性标记的硫酸根掺入到PG 的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)中所确定。* = ρ < 0. 05相对于对照物。图13.在6天成团培养(pellet culture)中用不同浓度的PPS在维持培养基(MM) 中孵育的、由ATDC5细胞进行的胶原II型和Sox-9的基因表达。图14.肝素对蛋白聚糖(PG)生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在6天成 团培养的鼠祖细胞(ADTC-5)中通过将放射性标记的硫酸根掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖 (35S-GAG)中所确定。在这个细胞系中肝素在1.25至20ug/mL的浓度范围中并未展示出一 种软骨形成效应。图15.显示多硫酸戊聚糖(PPS)对蛋白聚糖(PG)生物合成的浓度依赖性作用的 柱状图，正如在7天成团培养的鼠祖细胞(C3H10T1-2)中通过将放射性标记的硫酸根掺入 到PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)中所确定。图16.显示PPS对由微团培养6天和9天的鼠祖细胞(C3H10T1-2)进行的蛋白聚 糖合成的浓度依赖性作用的柱状图。向该培养基(Ham's F12+10%FCS)中加入PPS并且每 48小时更换。在培养终止前24小时加入35S-S04。将合成归一化为DNA含量。< 0. 05， **P < 0. 005, ***P < 0. 0005 相对于对照物。图17.显示PPS对由微团培养5天的人类祖细胞进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖 性作用的柱状图。数据表示为35S-GAG放射活性，并且作为对照物的百分比(对照物取为 100% ) ο *P < 0. 05相对于对照物。图18. A 显示由微团培养10天的人类祖细胞所进行的多硫酸戊聚糖(PPS)浓度 依赖性刺激的胶原II型生成的柱状图，正如通过B中所示的扫描和数字分析免疫染色的微 团培养物所确定。(详见正文).图19.显示㈧透明质酸物(Supartz )和⑶多硫酸葡聚糖对由微团培养5天 的人类祖细胞进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据表示为35S-GAG放射 活性，并且作为对照物的百分比(对照物取为100% )或为DPM/ug DNA。< 0. 05相对于 对照物。图20.显示了添加指定浓度的PPS和/或透明质酸(Supartz )的生长培养基来 培养原代人类祖细胞的结果。在不同的时间间隔(第3天和第5天)，除去生长培养基并且 用含有四唑鐺盐WST-I的无酚红的培养基替换，在37°C下/5% C02下持续2小时。显示了 所有浓度的PPS和HA对于每个时间点在450nm处的吸光度。这个实验显示HA和PPS没有 协同地作用来刺激祖细胞增殖。图21.由乳酸克鲁维斯酵母(K. Iactis)表达的rhNC4(批号PBA-1202P)在缺少 (维持培养基，MM)和存在胰岛素(10微克/mL)(分化培养基，DM)时对蛋白聚糖(PG)生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将放射性标 记的硫酸根掺入到的PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)所确定。这些数据被表达为相对于 不含有rhNC4的对照培养物的％变化。P < 0. 05相对于对照培养物是统计学上显著的。图22.由乳酸克鲁维斯酵母表达的rhNC4(批号PBA-1202P)在缺少(维持培养基， MM)和存在胰岛素(10微克/mL)(分化培养基，DM)下对成团培养的ATDC5细胞进行的蛋白 聚糖(PG)生物合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据显示为相对于对照物的％变化，该对 照物取为100%。图23.由乳酸克鲁维斯酵母所表达的rhNC4(批号PBA-1202P)加上多硫酸戊聚糖 (PPS) (2微克/mL)在缺少(维持培养基，MM)和存在胰岛素(10 μ g/mL)(分化培养基，DM) 时对大分子DNA生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养1天 之后通过将放射性标记的3H-胸腺嘧啶核苷掺入所确定。这些数据被表达为相对于不含有 rhNC4的对照培养物的％变化。P < 0. 05相对于对照培养物是统计学上显著的。图24. rhNC4(批号PBA-1202P)与多硫酸戊聚糖(PPS)的结合对由鼠ATDC5祖细胞 的单层培养物进行的35S-PG生物合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据相对于对照物(维 持培养基，MM)表示，该对照物取为100%。图25.由鼠ATDC5祖细胞在存在和缺少rhNC4(批号PBA-1209P)以及PPS时以单 层培养方式培养2天所表达的骨标志物Runx2、MGP、HAS3、⑶44以及管家基因NADPH的基 因表达的RT-PCR检测。图26.由鼠ATDC5祖细胞在存在和缺少rhNC4(批号PBA-1209P)以及PPS时以单 层培养方式培养2天所表达的Rimx2和这些转导蛋白(Smad 2和Smad 4)以及管家基因 NADPH基因表达的RT-PCR检测。图27.色谱洗脱曲图，显示了多硫酸化多糖对由祖细胞进行的透明质酸物(HA)生 物合成的作用，这是通过测量3H-葡糖胺掺入HA中来进行的。在存在不同浓度的多硫酸戊 聚糖(PPS)持续9天时来自微团培养的人类祖细胞的培养基的Superdex-S200色谱图展示 于在组图A至D中。在玻璃酸酶酶解之前，放射活性曲图显示出由这些细胞将3H-葡糖胺 掺入到HA和PG中、但是在酶解后仅3H-PG保留在该柱的空隙体积中。在这些酶解和酶解 前样品的曲线中在空隙体积部分上面积上的％差异代表了由PPS浓度所限定的释放到培 养基中的3H-HA的量。图28.由乳酸克鲁维斯酵母细胞所表达的rhNC4(批号PBA-1202P)在缺少和存在 胰岛素(10微克/mL)下对DNA合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞 培养3天之后通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中所确定。这些数据被表达为相 对于不含有rhNC4的对照培养物的％变化。P < 0. 01相对于对照培养物是统计学上显著 的。图29.由乳酸克鲁维酵母细胞所表达的rhNC4(批号PBA-1202P)对鼠ATDC5祖细 胞数目的浓度依赖性作用的柱状图，这是在缺少和存在胰岛素(10微克/mL)下培养3天之 后使用血细胞计数器来确定的。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的％ 变化。P < 0. 01相对于对照培养物是统计学上显著的。图30.相对于对照物由rhNC4 (批号PBA-1200P) (5ug/ml)或胰岛素(10ug/ml)所 诱导的ATDC5细胞在13天内生长的动力学柱状图。将20，000个细胞/孔在第O天(开始)种下，其中每48小时更换培养基。在第6天，胰岛素处理的培养物达到会合，并且在第9天 PBA-1200P达到会合。在第9天，对照培养物也达到会合，但是与含有胰岛素或PBA-1200P 的培养物相反，它停止进行复制。图31.由乳酸克鲁维斯酵母所表达的rhNC4(批号PBA-1202P)在缺少(维持培养 基，MM)和存在胰岛素(10微克/mL)(分化培养基，DM)对蛋白聚糖(PG)生物合成的浓度依 赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将放射性标记的硫酸根掺 入到的PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)所确定。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4 的对照培养物的％变化。P <0.05相对于对照培养物是统计学上显著的。图31.显示由这 些祖细胞ATDC5细胞在存在和缺少胰岛素时进行的rhNC4刺激的PG合成，但是在缺少胰岛 素时在更高的浓度下更有效。图32.多硫酸戊聚糖(PPS)在存在胰岛素(10微克/mL)时对蛋白聚糖(PG)的 生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将放射 性标记的硫酸根掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)中所确定。这些数据被表达为 35S-GAG放射活性，作为相对于不含有PPS的对照培养物每分钟计数(CPM)以及每分钟衰变 数(DPM)。P <0.05是相对于对照培养物统计学上显著的。图32.显示了在PPS存在下由 鼠ATDC5祖细胞进行的PG合成的浓度依赖性刺激。图33.由乳酸克鲁维斯酵母所表达的rhNC4(批号PBA-1202P)加上多硫酸戊聚糖 (PPS) (2微克/mL)在缺少(维持培养基，MM)和存在胰岛素(10微克/mL)(分化培养基， DM)时对蛋白聚糖(PG)的生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞 培养1天之后通过将放射性标记的葡糖胺掺入到PG的葡糖胺多糖(3H-GAG)中所确定。这 些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的％变化。P <0.05相对于对照培养物 是统计学上显著的。图34.多硫酸戊聚糖(PPS)在缺少和存在胰岛素(10微克/mL)时对DNA合成(细 胞复制)的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将3H-胸 腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中所确定。这些数据被表达为相对于不含有PPS的对照培养 物的％变化。图35. SEQ ID NO 无信号肽的全长人类NC4的氨基酸序列。图36. SEQ ID NO :2_在乳酸克鲁维斯酵母培养物表达期间通过脯氨酸肽链内切酶 推定的作用所获得的截短的hNC4的氨基酸序列。图37.在牛、人、鼠和鸡NC4的序列之间的序列组合物。
具体实施例方式如在本说明书和权利要求中所使用，单数形式“一种/个”(“a"，‘‘ an")和 “该”包括复数的引用，除非在上下文中的其他地方清楚地指出。例如，术语“一种多肽”包 括多个多肽，包括它们的混合物。如在此所使用的，术语“衍生自”应当被认为是指一个指明的整体(integer)是从 一个特定的来源获得的，尽管不需要直接地从该来源获得。一种“组合物”旨在是指活性试剂与另一种惰性的(例如，一种可检出的试剂或标 记)或活性的(例如，一种佐剂)化合物或组合物的组合。
除非上下文在其他地方或明确地进行相反地说明，在此所叙述的本发明的整数、 步骤、或元素作为单数的整数、步骤或元素清楚地涵盖了单数和复数这两种形式的所叙述 的整数、步骤或元素。相对于任何单一的实施方案，在此说明的本发明的实施方案应当为认为参照在此 说明的本发明的任何其他实施方案进行施用。贯穿本说明书，除非上下文另外需要，词语“包括”、或变体例如“包括了”或“包括 着”应当理解为意指包括一个所述的步骤或元素或整数、或多个步骤或元素或整数的组，但 不排除任何其他一个步骤或元素或整数、或多个元素或整数的组。本领域的普通技术人员应当理解在此说明的本发明是容易进行改变和变更的，除 外确切地说明的那些。应当理解，本发明包括所此类的改变和变更。本发明还包括在本说 明书中逐个地或共同地提及或指出的所有这些步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤 或特征的任何和所有的组合或其中的任何两种或多种。本发明并非局限于在此说明的特定实例的范围内。功能上等效的产物、组合物和 方法清楚地在本发明的范围内，如在此所说明。无需过多的实验过程即可进行本发明，本发明使用了(除非另外指出)分子生物 学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液中肽合成、固相肽合成、以及免疫学的常规技术。 例如，此类操作说明于以下文件中，它们通过引用结合在此。1. Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning :A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Second Edition(1989)，whole of Vols I，II， and III ；2. DNA Cloning :A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed. ,1985), IRL Press, Oxford,whole of text ；3. Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach (M. J. Gait, ed. , 1984) IRL Press，Oxford，whole of text,and particularly the paperstherein by Gait，pp 1-22 ； Atkinson et al.，pp35_81 ；Sproat et al.，pp83_115 ；and Wu et al.，pp 135151 ；4. Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach(B. D.Hames&S. J. Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford, whole of text ；5. Perbal, B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；6. Wiinsch,E. ,ed. (1974)Synthese von Peptiden in Houben-WeylsMetoden der Organischen Chemie (MiiIer，E.，ed.)，vol. 15，4th edn.，Parts 1 and 2，30 Thieme， Stuttgart。7. Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weirand C. C. Blackwell, eds. ,1986,Blackwell Scientific Publications)。袓细胞本发明涉及了袓细胞。在它的最广泛的实施方案中，术语袓细胞旨在涵盖包括任 何多能细胞。因此，术语袓细胞涵盖了成体细胞和胚胎干细胞。这种袓细胞可以是一种间充质的袓细胞。该袓细胞可以是一个内源性或外源性的胚胎的、或成体间充质的、或间充质的袓 细胞。该袓细胞可以是一种多能间质细胞。该袓细胞可以是一种成体未分化的间充质袓细胞。该祖细胞可以是一种软骨祖细胞。这些祖细胞可以衍生自骨髓。可替代地，这些祖细胞可以衍生自软骨、滑膜组织、 肌肉、脂肪组织、皮肤、脐带、牙髓、或其他可获得的来源。这些祖细胞可以是一种体细胞，例如被内源性因子抑制分化的结缔组织细胞。在另一个实施方案中，这些祖细胞是富集Stro-Itoi的细胞、或同质的Stro-Itoi细 胞、或Stro-Itoi子代细胞的群体。—种类型的祖细胞是一种间充质的祖细胞(MPC)。最初地衍生自骨髓，MPC和MPC 样细胞已经被鉴定出存在于大量的成体组织中并且可以从其中分离出，其中它们被假定执 行了替换和再生局部细胞的功能，这些局部细胞由于正常的组织更新、损伤、或老化而损 失。这些组织包括脂肪、骨膜、滑膜、滑液(SF)、肌肉、真皮、乳牙、周皮细胞、骨小梁、髌下脂 肪体以及关节软骨。MPC可以反过来由一系列体外特征进行定义，这些特征包括表型标志物和多潜能 的分化功能特性的组合。尽管塑料附着对于间充质细胞而言是最常使用的并且是简单的分离操作，不同的 阳性和阴性表面标志物(例如Stro-Ι、⑶146/黑色素瘤细胞粘附分子、⑶271/低亲和力 神经生长因子、以及阶段特异性胚胎抗原-4)也已经被用于富集MPC产量和同质性。此外， 另一组表面标志物，包括⑶140b (血小板衍生的生长因子受体-D)、⑶340 (HER-2/erbB2)、 以及CD349 (卷曲蛋白-9 (frizzled-9))与CD217相结合也可以用于MPC富集。其他的祖细胞包括鼠祖细胞，包括细胞系C3H10T1/2和ATDC5或Mill祖细胞。C3H 10T1/2是由具有成纤维细胞样形态学的雌性C3H/He小鼠品系所衍生的骨髓祖干细胞系。 ATDC5细胞是具有上皮细胞样形态学的小鼠胚胎衍生的软骨祖细胞系。C3H10T1/2细胞系是在1973年从14至17天大的C3H小鼠胚胎建立的。这些细 胞在细胞培养中展示了成纤维细胞的形态学，并且功能类似于间充质的干细胞。用5-氮 杂胞苷抑制C3H10T1/2细胞中的甲基化产生了肌肉、脂肪、骨骼、或软骨细胞的稳定的形 态学和生物化学特征。提示了这种表型的变更是由响应于阻断甲基化的内源基因的激活 引起的。此外，已经显示骨形态发生蛋白4(BMP4)，转化生长因子型β超级家族的一个 成员，可以诱导将C3H10T1/2细胞定型为前脂肪细胞，当经历一个脂肪分化的科学试验计 划时，发展成该脂肪细胞表型的细胞(Tang Qi-Qun, Otto TC，Lane MD. Commitment of C3H10Tl/2pluripotent stem cells to theadipocyte lineage. Pro Natl Acad Sci USA, 2004 ；101 9607-9611)。这种ATDC5细胞系最初是从AT805畸胎癌的一种分化的培养株中分离的。 ATDC5细胞在生长期表达一种成纤维细胞表型。有关这种ATDC5细胞系的其他信息可见 于 Atsumi T, Miwa Y, Kimata K, Ikawa Y.A chondrogenic cell line derived from a differentiating cultureof AT805 teratocarcinoma cells. Cell Differ Dev. 1990 ；30 109-16。这些祖细胞可以是富集Stro-Itoi的细胞群。这些祖细胞可以是同质的Stro-Itoi 细胞，或Stro-Itoi子代细胞。Stro-Itoi细胞是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾脏、胰、脑、肾、肝、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨骼、韧带、腱、骨骼肌、真皮、以及骨膜中发现的细 胞；并且是能够典型地分化成多个种系，例如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此， Stro-Ibri细胞能够分化成大量的细胞类型，包括但不限于脂肪的、骨的、软骨的、弹性的、 肌肉的、以及纤维的结缔组织。这些细胞进入的特异性谱系定型和分化途径取决于不同的 影响，这些影响来自于机械影响和/或内源性生物学活性因子，例如生长因子、细胞因子、 和/或由宿主组织建立的局部微环境条件。因此，Stro-Itoi细胞可以是非造血祖细胞，这些 祖细胞分裂生成子细胞，这些子细胞是干细胞或前体细胞，它们将及时地不可逆地分化生 成一种表型细胞。在另一个实施方案中，这些Stro-Itoi细胞是从一种样品富集的，该样品从一位受 试者获得，例如有待治疗的受试者或相关的受试者或不相关的受试者(无论是相同的物种 还是不同的物种)。术语“富集的”、“富集”或它们的变体在此用于说明一群细胞，当与未处 理的群体相比时其中的一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例是增加的。在另一个实施方案中，在本发明中使用的细胞逐个地或共同地表达了一种或多种 标志物，这种或这些标志物选自下组，其组成为TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、⑶45+、 ⑶146+、3G5+或它们的任何组合。“逐个地” 一词是指本发明分开地涵盖了所述的标志物或多个标志物的组，并且是 指尽管单独的标志物或多个标志物的组可能并未在此分开列出，所附的权利要求可以分开 地定义此类标志物或多个标志物的组并且可以彼此分开。“共同地”一词是指本发明涵盖了任何数目或组合的所述的标志物或多个肽的组， 并且是指尽管此类数目的或组合的标志物或多个标志物的组未能在此确切地列出，所附的 权利要求可以分开地定义此类组合或亚组合，并且可以与标志物或标志物的组的任何其他 组合分开。在一个实施方案中，这些Stro-Itoi细胞额外地是TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+ 和/或⑶146+中的一种或多种。对于一种给定的标志物被称为是“阳性”的细胞，它可以表达低水平(Io或暗)或 高水平(亮，bri)的这种标志物，这取决于该标志物在细胞表面上存在的程度，其中这些术 语涉及在细胞分选过程中所使用的荧光强度或其他标志物。Lo (或暗或弱)与bri的区别 应当在有待分选的一种特定的细胞群上所使用的标志物的背景下进行理解。对于给定的标 志物称为“阴性”的一种细胞并不是该细胞完全不存在的。这些术语是指该标志物以一个 相对非常低的水平由该细胞表达，并且它在可检测地标记时产生一个非常低的信号或是可 检测高于背景水平。术语“亮”当在此使用时是指在细胞表面上的一种标志物，它在可检测地标记时产 生了一个相对高的信号。尽管不希望被理论束缚，提出“亮”的细胞与该样本中其他细胞相 比表达更多的靶标志物蛋白(例如，被STRO-I识别的抗原)。例如，STRO-Itoi细胞当用一 种FITC-偶联的STRO-I抗体进行标记时与不亮的细胞(STRO-1^ )相比产生了一种更大 的荧光信号，正如通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析所确定。在一个实施方案中，“亮” 的细胞构成了至少约0. 的最多亮标记的、包含在起始样品中的骨髓单核细胞。在另一个 实施方案中，“亮”的细胞构成了至少约0. 至少约0.5%、至少约至少约1.5%、或至 少约2%的最亮标记的包含在起始样品中的骨髓单核细胞。在另一个实施方案中，STRO-Is细胞相对于“背景”(即STRO-Γ细胞)具有2个对数量级的更高表达的STR0-1表面表达。 通过比较，STR0-1 @和/或STR0-1 +13]#细胞所具有的与2个对数量级更高表达的STR0-1表 面表达更低，典型地是约1个对数或低于“背景”。如在此所使用的，术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。 例如，该术语涵盖了肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在另一个实施方 案中，该TNAP是BAP。在另一个实施方案中，如在此所使用的，TNAP是指一种可以与由以下 杂交瘤细胞系产生的STR0-3抗体相结合的分子，该杂交瘤细胞系在布达佩斯条约的规定 下于2005年12月19日保藏于ATCC，保藏登录号为PTA-7282。此外，在另一个实施方案中，这些Stro-Itoi细胞能够产生克隆性CFU-F。在一个实施方案中，显著比例的多潜能细胞能够分化成至少2种不同的种系。这 些多潜能细胞可以定型的谱系的非限制性例子包括骨前体细胞；肝祖细胞，它们对于胆管 上皮细胞和肝细胞是多能的；神经限制的细胞，它们能够生成神经胶质细胞前体，该细胞前 体发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞；神经元前体，它们发展成神经元；心肌和心肌细 胞的前体，葡萄糖应答胰岛素分泌型胰腺细胞系。其他谱系包括但不限于成齿质细 胞、生成牙本质的细胞以及软骨细胞、以下以下各项的前体细胞视网膜色素上皮细胞、成 纤维细胞、皮肤细胞(例如，角质化细胞)、树突细胞、发囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和 骨骼肌的细胞、睾丸祖细胞、血管上皮细胞、腱细胞、韧带细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维 细胞、骨髓间质细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、周皮细胞、血管细胞、上皮细胞、 神经胶质细胞、神经元细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。在另一个实施方案中，这些Stro-Itoi细胞当培养时不能产生造血细胞。在一个实施方案中，这些细胞是从有待治疗的患者处获得的，使用标准技术进行 体外培养，并且用于获得扩展出的细胞用于作为一种自体的或异体的组合物给予该受试 者。在一个可替代的实施方案中，使用了这些已建立的人类细胞系中一种或多种的细胞。 在本发明的另一个有用的实施方案中，使用了一种非人类动物的细胞(或若该患者不是人 类，则来自另一个物种)。本发明也考虑使用获自或衍生自Stro-Itoi细胞和/或它们的子代细胞(后者也 称为扩展出的细胞)的上清液或可溶的因子，它们是由与这些祖细胞相组合进行体外培养 而产成的。本发明的扩展出的细胞可以具有多种多样的表型，这取决于培养条件(包括在 培养基中的数目和/或刺激因子的类型)、传代次数、以及类似因素。在某些实施方案中，这 些子代细胞是在约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10次传代后从亲本群体获 得的。然而，这些子代细胞可以在任何次数的传代之后从亲本群体获得的。这些子代细胞可以通过在任何适当的介质中培养来获得。如在提及一种细胞培养 物时所使用的，术语“介质”包括在这些细胞周围的环境的组分。介质可以是固体、液体、气 体或多种相和物质的混合物。介质包括液体生长培养基连同不能维持细胞生长的液体培养 基。介质也包括凝胶状的介质，例如琼脂、琼脂糖、明胶以及胶原基质。示例性的气体介质 包括将在培养皿上或其他固体或半固体支持物上生长的细胞暴露至的气相。术语“介质”也 指以下材料，该材料旨在用于一种细胞培养中，即使它还没有与细胞进行接触。换言之，一 种准备用于细菌培养的营养丰富的液体是一种介质。当与水或其他液体混合时变成适于细 胞培养的一种粉末混合物可以称为“粉末介质”。
在一个实施方案中，对于本发明的方法有用的子代细胞是使用标记了 STR0-3抗 体的磁珠、通过将TNAP+STRO-Γ多潜能细胞从骨髓分离、并接着培养扩展这些分离的细胞 而获得的(参见Gronthoset al. Blood 85 :929_940，1995用作适当培养条件的一个例子)。在一个实施方案中，此类扩展出的细胞(子代)(可任选的是至少5代之后)可以 是 TNAP\ CC9+、HLA 类 I+、HLA 类 ΙΓ、CD14\ CD19\ CD3\ CDlla^T、CD31\ CD86\ CD34"和 / 或CD80—。然而，有可能的情况是在不同的培养条件下对于在此说明的那些细胞不同的标志 物的表达可以发生变化。而且，尽管这些表型的细胞在扩展出的细胞群中可以占绝大多数， 它并不意味着存在着较少比例的不具有这种或这些表型的细胞(例如，小百分比的扩展出 的细胞可以是CC9_)。在一个实施方案中，扩展出的细胞仍然具有分化成不同细胞类型的能 力。在一个实施方案中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩展的细胞群所 包括的细胞至少25%是CC9+，在另一个实施方案中至少50% CC9+。在另一个实施方案中，用于获得上清液或可溶性因子、或细胞本身的扩展出的细 胞群所包括的细胞至少40%是STR0-1+，在另一个实施方案中至少45%是STR0-1+。在另一个实施方案中，这些扩展出的细胞可以表达一种或多种标志物，这种或这 些标记物共同地或逐个地选自下组，其组成为LFA-3、THY-U VCAM-U ICAM-U PECAM-U P-选择素、L-选择素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD 90、CD29、 CD18、CD61、整联蛋白 β 6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、 NGF-R、reF-R、瘦蛋白-R(STR0-2 =瘦蛋白-R)、RANKL,CD146 或这些标志物的 任何组合。在一个实施方案中，衍生自STRO-Itoi细胞的子代细胞对于标志物Stro-I 是阳性 的。这些细胞被称为组织特异性定型细胞(TSCC)，并且与STRO-Itoi相比细胞更致力于分 化，因此不太能应答诱导因子。TSCC可能被定型的谱系的非限制性例子可以包括肝祖细胞， 它们对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能性的；神经限制的细胞，它们能够生成神经胶质细 胞前体，该细胞前体发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞；以及神经元前体，它们发展成神 经元；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖应答胰岛素分泌型胰腺β-细胞系。其他定型的前体 细胞包括但不限于软骨细胞，成骨细胞，成牙本质细胞，生成牙本质的细胞以及软骨细胞， 以及以下各项的前体细胞视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(例如，角质化细 胞)、树状突细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌的细胞、睾丸祖细胞、血管内 皮细胞、肌腱细胞、韧带细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质细胞、破骨细胞和 造血-支持间质细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、周皮细胞、血管细胞、上皮细胞、 神经胶质细胞、神经元细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。前体包括可以特异性地导向 结缔组织的那些前体，特别是包括脂肪组织、蜂窝组织、骨组织、软骨组织、弹性组织以及纤 维结缔组织。在另一个实施方案中，这些子代细胞是如WO 2006/032092中所定义和/或说明的 多潜能扩展出的STRO-Γ多潜能细胞子代(MEMP)。用于制备衍生出子代的、STRO-Γ多潜能 细胞的富集群的方法可以在WO 01/04268和WO 2004/085630中说明。在一种体外的背景 中，STRO-I+多潜能细胞将很少作为一种绝对纯的制备物出现，并且将通常与其他细胞一起 出现，这些其他细胞是组织特异性定型细胞(TSCC)。WO 01/04268涉及从骨髓以约0. 至90%的纯度水平收获此类细胞。衍生出子代的、包括祖细胞的群体可以直接从组织来源获 得，或可替代地，它可以是一个已经在体外扩展出的群体。例如，这种子代是可以从一种收获的、未扩展的、基本上纯的STRO-Γ多潜能细胞 群获得的，包括它们所在群体的总细胞的至少约0. 1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、 50 %、60 %、70 %、80 %或95 %。这个水平可以通过以下方式达到，例如，通过选择对至少 一种标志物呈阳性的细胞，该标记物逐个地或共同地选自下组，其组成为TNAP、STR0-1气 3G5+、VCAM-I、THY-I、CD146 和 STR0-2。MEMPS可以与新收获的Stro-Itoi细胞进行区别，因为它们对于标志物STRO-Itoi是 阳性的并且对于标志物碱性磷酸酶(ALP)是阴性的。相比之下，新分离的Stro-Itoi细胞对 STRO-Itoi和ALP这两者都是阳性的。在本发明的另一个实施方案中，至少5%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所给予的细胞具有表型STRO-Ibri, ALP—。在另 一个实施方案中，这些MEMPS对于以下标志物中的一种或多种是阳性的，这些标志物是: Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α 3β I0在又另一个实施方案中，这些MEMPs未展 示出TERT活性和/或对于标志物⑶18是阴性的。这种Stro-Itoi细胞起始群可以衍生自任何一种或多种组织类型，包括骨髓、牙髓 细胞、脂肪组织和皮肤、或可能更广泛地来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网 膜、脑、毛囊、肠、肺、脾脏、淋巴结、胸腺、胰、骨骼、韧带、骨髓、腱以及骨骼肌。应当理解，在进行本发明中，分离带有任何给定细胞表面标志物的细胞可以受到 许多不同的方法的影响，然而某些方法依赖于将一种结合剂(例如，一种抗体或它的抗原 结合片段)结合到所关心的标志物上、之后跟随展示出结合的那些物质的分离，该结合是 高水平的结合、或是低水平的结合或者不结合。最便捷的结合剂是抗体或基于抗原的分子， 优选地是单克隆抗体或基于单克隆的抗体，这是由于后面这些试剂的特异性的缘故。抗体 可以用于两个步骤，然而其他试剂也是可以使用的，因此也可以采用这些标志物的配体从 而富集带有它们、或缺乏它们的细胞。可以将这些抗体或配体连接到一种固体支持物上，从而允许一种粗分离。这些分 离技术优选地将有待收集的馏分的活力的保留最大化。可以采用不同效率的不同技术来获 得相对粗的分离。所采用的具体的技术将取决于分离的效率、相关联的细胞毒性、实行的容 易程度和速度、以及对复杂设备和/或技术技能的需要。用于分离的操作可以包括但不限 于磁性分离(使用抗体涂覆的磁珠)、亲和层析以及用连接到固体基质上的抗体进行“淘 选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。用于进行FACS的方法对于本领域的普通技 术人员是清楚的。对抗在此说明的标志物中每一种的抗体是可商购的(例如，对抗STR0-1的单克隆 抗体是可以从R&D Systems,USA商购)、从ATCC或其他保藏机构获得和/或可以使用本领 域公认的技术进行生产的。优选的是用于分离Stro-Itoi细胞的方法，例如包括第一步是使用例如磁性激活细 胞分选(MACS)、识别高水平表达的STR0-1的一个固相分选步骤。然后，可以进行第二个分 选步骤，该步骤应该是令人希望的，从而造成更高水平的前体细胞表达。这种第二个分选步 骤可能涉及使用两种或多种标志物。获得Stro-Itoi细胞的方法还可以包括在第一个富集步骤之前使用已知的技术来收获该细胞的来源。因此，该组织将通过手术除去。然后，将包含该来源组织的细胞分成一 种所谓的单细胞悬浮液。这种分离是可以通过物理和/或酶促的方法来实现的。一旦已经获得一种适当的Stro-Itoi细胞群，可以通过任何适当的手段进行培养或 扩展来获得MEMP。在一个实施方案中，这些细胞是从有待治疗的受试者获得的，使用标准技术进行 体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩展出的细胞，用于作为一种自体的或异体 的组合物给予该受试者。在一个可替代的实施方案中，使用这些已建立的人类细胞系中一 种或多种细胞系的细胞来获得这些上清液或可溶的因子。在本发明的另一个有用的实施方 案中，使用一种非人类动物的细胞(或若该患者不是人类，则来自其他物种)来获得上清液 或可溶的因子。本发明可以使用来自任何非人类的动物物种的细胞来进行，这些非人类的动物物 种的细胞包括但不限于非人类的灵长类动物细胞、有蹄动物、犬科动物、猫科动物、兔形目 动物、啮齿动物、禽类和鱼类的细胞。本发明可以使用来进行的灵长类动物细胞包括但不限 于黑猩猩、狒狒、食蟹猴、以及任何其他新或旧大陆猴(Newor Old World monkey)的细胞。 本发明可以使用来进行的有蹄动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛 的细胞。本发明可以使用来进行的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙 土鼠的细胞。本发明可以使用来进行的兔形目动物的例子包括家兔、长腿野兔、野兔、白尾 野兔、雪鞋兔和鼠兔。鸡(Gallus gallus)是禽类的一个例子，可以使用它来进行本发明。对于本发明的方法有用的细胞可以在使用之前、或在获得该上清液或可溶的因子 之前进行储存。用于保存和储存真核细胞、并且特别是哺乳动物细胞的方法和科学试验计 划在本领域内是已知的(参见，例如 Pollard，J. W. and Walker, J. Μ. (1997)Basic Cell CultureProtocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J. ；Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, ffiley-Liss, Hoboken, N.J.)。遗传修饰的细胞在一个实施方案中，这些Stro-Itoi细胞和/或它们的子代细胞是被遗传修饰的， 从而例如表达和/或分泌一种感兴趣的蛋白，例如一种提供治疗益处和/或预防性益处的 蛋白，例如，胰岛素、高血糖素、生长抑素、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰 脂肪酶或淀粉酶、或与增强的血管新生相关联或其成因的一种多肽、或与一种细胞分化成 胰细胞或血管细胞相关联的一种多肽。用于遗传修饰细胞的方法对于普通技术人员而言将是清楚的。例如，将有待在细 胞中表达的一种核酸可操作地连接到一种启动子上用于在该细胞中诱导表达。例如，将该 核酸连接到一种启动子上，该启动子在受试者的不同细胞中是可操作的，例如病毒启动子， 例如CMV启动子(例如，CMV-IE启动子)或SV-40启动子。额外的适当的启动子在本领域 内是已知的，并且应当被认为参照本发明的现有实施方案进行施用。在一个实施方案中，该核酸以一种表达构建体的形式提供。如在此所使用的，术 语“表达构建体”是指一种核酸，该核酸在细胞中具有在与其可操作地连接的核酸上赋予表 达的能力(例如，报告基因和/或可以反选择的报告基因)。在本发明的上下文中，应当理 解，一种表达构建体可以包括或者是一种质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、病毒亚基因组的或基 因组的片段，或能够以一种可表达的形式保持和/或复制异源DNA的其他核酸。
用于构建一种适当的表达构建体来进行本发明的的方法对于普通技术人员 而言应该是清楚的，并且说明于例如Ausubel等人的文件中(在Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338,1987),或 Sambrook 等 人的文件(在:MoIecularCloning :Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)。例如，该表达构建体的元 件中每一种元件是使用例如PCR从一种适当的模板核酸扩增的，并且随后被克隆到一种适 当的表达构建体中，例如像，一种质粒或噬菌粒。适用于这种表达构建体的载体在本领域内是已知的和/或在此进行了说明。例 如，在哺乳动物细胞中一个适用于本发明的方法的表达载体是例如PcDNA载体套件的载体 (由Invitrogen提供)、pCI载体套件的载体(Promega)、pCMV载体套件的载体(Clontech)、 pM 载体(Clontech)、pSI 载体(Promega)、VP16 载体(Clontech)或 pcDNA 载体套件的载体 (Invitrogen)。专业的行家应该知道额外的载体以及此类载体的来源，例如Invitrogen Corporation、Clontech 或 Promega0用于将这种分离的核酸分子或包括以上物质的一种基因构建体引入到细胞中 用于表达的手段对于本领域的普通技术人员而言是已知的。用于一种给定的生物体 的技术取决于已知的成功的技术。用于将重组DNA引入到细胞中的手段除了其他之 外还包括微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染(例如通过使用 Lipofectamine (Gibco, MD, USA)和 / 或 Cellfectin(Gibco，MD, USA))、PEG-介导的 DNA 摄取、电穿孔和微粒轰击(例如通过使用DNA-涂覆的钨或金颗粒(Agracetus Inc.，WI, USA))。可替代地，本发明的一种表达构建体是一种病毒载体。适当的病毒载体在本领域 内是已知的并且是可商购的。用于递送一种核酸并且将该核酸整合到宿主细胞基因组中的 常规的基于病毒的系统包括例如一种逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。可 替代地，一种腺病毒载体对于引入一种核酸是有用的，该核酸仍然是附加型地进入宿主细 胞中。病毒载体是在靶细胞和组织中一种有效的和多用途的基因转移方法。额外地，已经 在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。例如，一种逆转录病毒载体大体上包括顺式作用长末端重复(LTR)，其中包装能力 达到6kb至IOkb的外来序列。最小的顺式作用LTR对于载体的复制和包装是足够的，然 后用它将该表达构建体整合到该靶细胞中从而提供长时程表达。广泛使用的逆转录病毒 载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SrV)、 人免疫缺陷病毒(HIV)、以及它们的组合的那些载体(参见，例如Buchscher et al. , J Virol. 56 2731-2739(1992) Johann et al, J. Virol. 65 1635-1640(1992) ；Sommerfelt et al, Virol. 76 58-59(1990) ；Wilson et al, J. Virol. 63 274-2318(1989) ；Miller et al.，J. Virol. 65 2220-2224(1991) ；PCT/US94/05700 ；Millerand Rosman BioTechniques 7:980-990,1989 ；Miller,A. D. HumanGene Therapy 7 5-14,1990 ；Scarpa et al Virology 75 849-852,1991 ；Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA90 :8033_8037，1993)。也已经开发了不同的腺病毒相关联的病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。使 用本领域中已知的技术可以容易地构建AAV载体。参见例如美国专利No. 5，173，414和 No. 5，139，941 ；国际
发明者皮特·高希 申请人:蛋白生物动力私人有限公司