专利名称：治疗和预防葡萄球菌及其它细菌感染的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗或预防包括葡萄球菌属某些种(Staphylococcusspp)的细菌感染导致的细菌生物薄层、感染、疾病或症状的方法和组合物。
背景技术：
抗药性葡萄球菌是重要的医学难题葡萄球菌(Staphylococci)(尤其是金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis))是人类主要的病原体，据报道，在美国其是医源性感染最常见的原因。每年医源性感染导致的住院大约有两百万，在美国，使医院死亡率上升了35％。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染是医源性肺炎、手术部位和血液感染、医疗器械相关的感染，以及例如骨髓炎、脓毒性关节炎、皮肤感染、心内膜炎和脑膜炎的社区获得性(community-acquired)感染的首要原因(Rubin RJ等人，Emerg Infect Dis.1999；59-17[1])。目前，全世界95％以上感染了葡萄球菌的患者对例如青霉素和氨苄青霉素的一线抗生素没有反应。抗药性葡萄球菌一度主要局限于医院和疗养院中，但是现在已向公众传播(Lowy FD.N.Engl.J.Med.1998；339520-532[2])。抗药性细菌的出现和传播突出了寻找对包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌及其它菌类的细菌性感染的预防和替代的抗生素治疗的新方式的需要。
金黄色葡萄球菌通过生成毒力因子导致疾病金黄色葡萄球菌是人类皮肤正常菌群的一部分，但是其因为形成生物薄层和/或产生毒性外分子(exomolecules)可导致重大的疾病。该毒素包括中毒性休克综合症毒素-1(TSST-1)，其是一种导致中毒性休克综合症的致热性毒素、葡萄球菌肠毒素，其是食物中毒的主要原因、使得细菌利用其代谢环境并使其能在宿主内传播的蛋白酶、通过葡萄球菌表达、分泌或掩蔽并已显示出影响感染过程结果的溶血素、杀白血球素和其它毒力因子[2]。
一种治疗改进的新方法是干扰葡萄球菌的毒力(生物薄层的形成和毒素的产生)。消除毒力因子的产生不仅使得细菌的致病性降低很多，而且使得细菌对宿主免疫防御和传统抗生素更加敏感(Balaban等人，Science 1998；280438-440[3])。
群体感应(quorum sensing)调控葡萄球菌的毒力通过群体感应机制，可以调控生物薄层的形成和毒素的产生，其中细菌产生和分泌的分子(自体诱导物)达到阈浓度并激活信号转导途径，导致了编码毒力因子的基因的激活[2]。
金黄色葡萄球菌在指数生长早期表达例如粘连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白和蛋白A的表面分子，这时细菌的密度较低[2]。粘着性分子的表达使得细菌能够附着并定居于宿主细胞和植入的医疗器械上。密度较高时，细菌生成使得细菌存活、散播并产生感染的毒性外分子，例如毒性休克综合症毒素-1(TSST-1)、肠毒素、蛋白酶和溶血素[2]。
细菌在较低的密度下表达粘着性分子并定居的能力，和在较高的密度下表达毒性外分子并导致疾病的能力归因于一种复杂的调控过程，其涉及到群体感应(QS)机制(Kleerebezem M等人，Mol.Microbiol.1997；24895-904[4])，以及基因座(genetic loci)的活化，例如traP(Balaban N等人，J Biol Chem 2001；2762658-2667[5])、agr(Lina G等人，Mol Microbiol 1998；28655-662[6])、sar(Heyer G等人，Infect.Immun.2002；70127-133[7])和sae(Giraudo AT等人，FEMS Microbiol.Lett.1999；17715-22[8])。这些过程并行或协调地调控着毒力[5]。
迄今为止已经描绘了两种葡萄球菌群体的感应系统(SQS)。SQS 1由自体诱导物RNAIII-活化蛋白(RAP)和它的靶向分子TRAP组成[3，5]。RAP是一种大约33kDa的蛋白质，它是核糖体蛋白L2(由rplB基因编码)的直向同源体，通常由277个氨基酸组成。RplB在真细菌中是高度保守的(见以下详细说明)。TRAP是在RAP存在下磷酸化的～21kDa的蛋白质[5]。TRAP的序列在葡萄球菌菌株和物种中是高度保守的，并且它的二级结构在革兰氏阳性细菌中也是高度保守的。TRAP通常由167个氨基酸组成(见以下详细说明)。
SQS 2包括基因调控系统agr的产物。agr编码了两种异向转录的转录产物RNAII和RNAIII(Novick RP等人，Mol.Gen.Genet.1995；248446-458[9]，和Novick RP等人，EMBO J 1993；123967-3975[10])。RNAIII是编码AgrA、AgrC、AgrD和AgrB的多顺反子转录产物，其中AgrD是生成在AgrB协助下被加工并分泌的自诱导肽(AIP)的前体肽(Otto M.Peptides 2001；221603-1608[11]，和Saenz HL等人，ArchMicrobiol 2000；174452-455[12])。一旦agr被活化，分泌出AIP，它便诱导了AgrC[6]和AgrA的磷酸化，生成了名为RNAIII的调控RNA分子[10]。RNAIII正调控(upregulate)了大量分泌性毒素的产生[10]。
SQS1和SQS2之间的相互作用RAP诱导了其靶向分子TRAP的磷酸化，以一种仍然未知的方式导致细胞粘着性的增加和agr的激活。一旦agr被激活并产生RNAII(指数生长中期)，便生成了八肽(AIP)和它的受体AgrC。AIP负调控(downregualte)TRAP的磷酸化[5](导致粘着性降低)，并独立地正调控它的受体AgrC的磷酸化[6]。这便导致了AgrA的磷酸化，结果生成RNAIII。RNAIII导致了许多毒性外分子的表达[10]。
SQS1抑制治疗和预防细菌感染的新方式为小鼠接种RAP(天然或重组的)可以保护它们不受金黄色葡萄球菌的攻击[3]。这便确认了RAP在金黄色葡萄球菌致病机理中的重要作用，并为新疫苗的开发带来机会。
RNAIII抑制肽(RIP)可以抑制葡萄球菌感染。RIP通过干扰已知的SQS1的功能来抑制葡萄球菌的粘附并产生毒素。RIP与RAP竞争诱导TRAP的磷酸化，从而导致了对TRAP磷酸化的抑制[5]。这便导致了细胞粘着性的降低和生物薄层的形成，抑制了RNAIII的合成和毒力的表型[3]。肽RIP首次从凝固酶阴性的葡萄球菌培养物上清液中分离出，这种凝固酶阴性的葡萄球菌99％确定为木糖葡萄球菌。RIP的序列鉴定为YSPXTNF，其中X可以是半胱氨酸、色氨酸或修饰的氨基酸，以及类似YKPITN的肽衍生物(Gov Y等人，Peptides，2001；221609-1920[13])。合成的RIP类似物设计为其酰胺形式YSPWTNF(-NH2)，并显示出对体外RNAIII抑制，和对包括蜂窝织炎(在小鼠体内对抗金黄色葡萄球菌的史密斯扩散(Smith Diffuse)试验)、脓毒性关节炎(在小鼠体内对抗金黄色葡萄球菌LS-1的试验)、角膜炎(在兔子体内对抗金黄色葡萄球菌8325-4的试验)、骨髓炎(在兔子体内对抗金黄色葡萄球菌MS的试验)、乳腺炎(在牛体内对抗金黄色葡萄球菌Newbould 305、AE-1的试验和环境感染的试验)的体内金黄色葡萄球菌感染的抑制极为有效(Balaban N等人，Peptides 2000；211301-1311[14])。这些发现表明RIP能够作为有用的治疗分子来预防和抑制葡萄球菌感染。
生物薄层相关的感染表面附着的细菌在它们自身合成的水合多聚母体上聚集，形成生物薄层。这些固着群落的形成和它们本身对抗微生物制剂的抵抗力是许多持久性和慢性细菌感染的根源(Costerton JW等人，Science.1999；212841318-1322[15])。生物薄层优先在惰性表面或死组织上产生，一般在医疗器械和例如死骨上的死骨片的死组织碎片上产生；生物薄层也可以在活的组织上形成，如在心内膜炎的情况下。生物薄层在一个或多个位置缓慢生长，而且生物薄层感染经常缓慢地产生显性症状。附着的细菌细胞释放抗原并刺激抗体的产生，但是这种抗体不能有效地杀死生物薄层内的细菌，而且可能导致周围组织的免疫复合损伤。即使是在有极好的细胞和体液免疫反应的个体内，生物薄层感染也很少由宿主免疫机制消灭。抗生素治疗一般可逆转生物薄层释放的浮游细胞导致的症状，但是不能杀灭生物薄层。由于这个原因，生物薄层感染一般在几个抗生素治疗周期之后显示反复症状，直到将附着群体由外科手术从体内除去。因此，预防生物薄层的形成非常重要，而不是在它们一旦形成以后试图根除。
如表1所示，葡萄球菌导致了许多与生物薄层相关的医源性感染[15]。
表1 涉及生物薄层的人类医源性感染的部分列表
RIP降低细菌粘着性RIP降低了细菌在真核细胞(在HEp2细胞上测试)和在塑料(在聚苯乙烯、聚硅氧烷和聚氨酯上测试(Balaban N等人，Kidney Int.2003；63340-345[16])上的粘着性。RIP可以用来涂覆医疗器械以防止葡萄球菌感染。
RIP衍生自AIPRIP衍生自AIP，因为RIP是一种线性肽[13]，而AIP必须包含半胱氨酸硫代内酯(thiolactone)结构以维持活性[11]，RIP的感受器是TRAP[5]，而AIP的感受器是AgrC[6]，RIP抑制细胞的粘着和毒素的生成[16]，而抑制性AIP抑制毒素的生成但是激活细胞的粘着(VuongC，Saenz HL，Gotz F，Otto M.金黄色葡萄球菌中agr群体感应系统对聚苯乙烯粘附性的影响(Impact of the agr quorum-sensing system onadherence to polystyrene in Staphylococcus aureus).J Infect Dis 2000；1821688-1693[17])。
RIP的分子机制尽管尚未充分了解其确切的分子机制，已经知晓RIP抑制agr的表达(RNAII和RNAIII[13])，从而抑制了毒素的产生(Vieira-da-MottaO等人，Peptides，2001；221621-1628[18])。已知由于在RIP存在下agr对裸细胞的粘附与野生型同等地被抑制，RIP是以不依赖agr的机制调控细胞的粘附的[16]。由于RIP抑制了TRAP的磷酸化[5]，并且已经证实TRAP对细胞粘附、agr表达和发病机理(见以下详述)来说是至关重要的，因此RIP通过TRAP，并可能通过另外的靶底调控了金黄色葡萄球菌的发病机理。
以上讨论的RIP通过其抑制群体感应机制的机制涉及到TRAP磷酸化的抑制。已有表皮葡萄球菌中TRAP的存在和TRAP磷酸化的证据(见以下详述)，它表明在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中具有类似的群体感应机制，并且RIP有干扰生物薄层形成和两种物种导致的感染的潜力。另外，有证据显示在所有的葡萄球菌菌株和物种中TRAP是保守的，因此其它葡萄球菌物种具有上述类似的群体感应机制。因此，RIP应该对任何类型的葡萄球菌均有效。
RAP和TRAP是多种类型细菌的治疗靶点其它导致感染的细菌似乎具有序列与TRAP类似的蛋白。这些细菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、无害利斯特氏菌(Listeriainnocua)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monoctogenes)(见本发明详述)。
更进一步，RAP是核糖体蛋白L2的直向同源体，由rplB基因编码。L2在细菌中是高度保守的，具体包括链球菌属某些种(Streptococcusssp)、利斯特菌属某些种(Listeria spp)、乳球菌属某些种(Lactococcusspp)、肠球菌属某些种(Enterococcus spp)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobtylicum)和杆菌属某些种(Bacillus spp)。该结果表明目的为扰乱金黄色葡萄球菌中RAP功能的治疗在L2合成细菌的治疗上将同样有效(见详述)。
发明内容
本发明特征在于治疗和/或预防细菌感染，或细菌感染导致的疾病的方法和组合物，其特征在于所述的细菌为表达RAP或TRAP或类RA-或类TRAP分子的细菌(例如包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的葡萄球菌属某些种，包括枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌的杆菌属某些种，包括无害利斯特氏菌、单核细胞增生利斯特氏菌、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠埃希氏菌和丙酮丁醇梭菌的利斯特菌属某些种)。
本发明特征在于包括涂敷器械、全身性注射(静脉注射IV、腹腔注射IP、肌肉内IM或皮下注射SQ)、局部涂敷或口服的治疗方法。
本发明的一个方面是含有包含特定氨基酸序列的多肽的组合物，该氨基酸序列包括通式Y(K或S)PXTNF(序列号09/839,695中的SEQ ID NOS1和2)的全部或部分，其中任何氨基酸均可以被修饰，X可以是C、W或I。在一些实施方式中还提供了药物组合物。
本发明的另一个方面是其中的多肽包含特定的氨基酸序列的组合物，该氨基酸序列包含通式IKKY(K或S)PXTN，其中X为C、W、I或修饰后的氨基酸。在一些实施方式中还提供了药物组合物。
本发明的另一个方面是治疗某些细菌感染的宿主的方法，其中将RAP受体的拮抗剂给予宿主。一些实施方式中宿主是人类患者。更多的实施方式中宿主是动物，例如但不限于实验动物。在一些实施方式中该拮抗剂是多肽、多肽模拟物(peptidomimetic)或抗体。
本发明的另一个方面是编码本发明多肽的核酸分子。该核酸分子可以是RNA或DNA或反义核酸分子。在一个实施方式中，该核酸分子包括RIP、RAP或TRAP或它们的类似物的核苷酸序列。
另一方面，本发明特征在于分离的天然或重组RAP多肽，以及编码上述RAP多肽的核酸。
另一方面，本发明特征在于分离的天然或合成RIP多肽以及编码上述RIP多肽的核酸。
另一方面，本发明特征在于分离的TRAP多肽(天然或重组体的，TRAP或TRAP同源体)，以及编码上述TRAP多肽的核酸。
图1是从下列细菌推出的RAP(RplB)氨基酸序列的多序列比对分析(ClustalW)金黄色葡萄球菌RN6390B(AF205220)、表皮葡萄球菌RP62A(TIGR数据库)、酿脓链球菌M1 GAS(AE014137)、单核细胞增生利斯特氏菌EGD(AL591983)、乳酸乳球菌(AE006438)、粪肠球菌(TIGR数据库)、大肠埃希氏菌K12(AE000408)、丙酮丁醇梭菌(AE007808)和枯草芽孢杆菌(Z99104)。
图2是显示rRAP(2□g)的凝胶照片(条带1、3)，将含有天然RAP(30□1 30倍浓度的指数期后期上清液蛋白)(条带2、4)的金黄色葡萄球菌RN6390B的培养物上清液进行SDS-PAGE(12.5％)。凝胶用Western印迹，用丽春红对膜进行染色以观测蛋白(条带1、2)，在牛奶中封闭，并与单克隆抗rRAP抗体(腹水，以1∶1000稀释)孵育。结合的抗体由联结了氧化物酶的抗小鼠抗体检测，其由化学发光和膜放射自显影观测(条带3、4)。
图3A显示含有rnaiii::blaZ融合结构的金黄色葡萄球菌(2×107指数早期)生长45分钟，其rRAP的量逐渐增加(1-100□g)。以OD490/650nm测定□-内酰胺酶活性并记录。部分纯化的RAP(天然的，通过10kD截止膜(cutoff membrane)的金黄色葡萄球菌RN6390B＞10kDa的后期指数生长期上清液)作为阳性对照。
图3B中的凝胶照片显示了在存在(条带1)或不存在(条带2)1mg rRAP的条件下生长30分钟的细胞(108指数早期)，收集细胞，进行Northern印迹，采用放射性同位素标记的RNAIII-特异性DNA来检测RNAIII的存在。膜进行放射自显影并测定条带密度。
图4显示了Balb/c天然小鼠(对照)或接种rL2的小鼠在2×109金黄色葡萄球菌免疫性实验中的百分比死亡率。
图5显示了2×109金黄色葡萄球菌免疫性实验中存活的接种rL2的动物中损伤的发生。
图6A显示了从指数早期生长了数小时的细胞的生长曲线和它们在不同时间间隔测量的密度(OD 600nm)。圆TRAP+。正方形TRAP-。
图6B中的凝胶照片显示了图6A中反映的每一生长阶段的细胞样品(相当于～3×108个细胞)。收集细胞并用Northern印迹，采用放射性同位素标记的RNAIII-特异性DNA来检测RNAIII的存在。膜进行放射自显影。金黄色葡萄球菌TRAP+(条带1、2、3)和金黄色葡萄球菌TRAP-(条带4、5、6)。条带1、4指数早期。条带2、5指数中期。条带3、6后期指数期。
图7A中的照片显示了生长在绵羊血琼脂平板上以测试溶血作用的细胞。TRAP+的溶血作用表示在图的上半部分，TRAP-表示在底部。
图7B表示指数早期的金黄色葡萄球菌TRAP+和TRAP-菌株的粘着性，其在聚苯乙烯微量滴定板上在37℃下生长了4小时。粘着性细菌用番红染色，并测定490nm的吸收。
图8表示金黄色葡萄球菌8325-4母株(TRAP+)(左区)和金黄色葡萄球菌8325-4(TRAP-)突变株(右区)的损伤尺寸。
图9是由葡萄球菌菌株和物种推出的TRAP氨基酸序列的多序列比对分析(ClustalW)。
图10显示了TRAP及其同源体的二级结构预测。金黄色葡萄球菌TRAP(GenBankAF202641)、单核细胞增生利斯特氏菌LMO2213(GenBankAL591982)和枯草芽孢杆菌YhgC(GenBankZ99109)的推出的氨基酸序列进行比对，附有用PCIPRED v.2.4预测的推测二级结构，卷曲用实线表示，螺旋用水平圆柱表示，链(strands)用箭头表示。
图11显示的基因区域图是从GenBank和相应的基因组计划数据库得到的DNA序列的基础上设计的。金黄色葡萄球菌traP(AF202641和该研究)及其在表皮葡萄球菌(TIGR数据库和该研究)、单核细胞增生利斯特氏菌(AL591982)、无害利斯特氏菌(AL596171)、枯草芽孢杆菌(Z99109)和炭疽芽孢杆菌(TIGR数据库)中的同源体用灰色箭头表示；反向箭头表示推测的转录终止子。侧翼hemE和ecsB基因之间的距离(单位kB)显示在中断的双向箭头里。HemE基因编码正铁血红素IX生物合成途径的晚期步骤中的一种酶，ecsBC基因编码蛋白分泌装置的组件和分泌性蛋白基因的转录是协同的(枯草芽孢杆菌)；cadD基因与金黄色葡萄球菌质粒pRW001的非常相似；pbpF基因编码一种与枯草芽孢杆菌萌发过程有关的青霉素结合蛋白；基因yhgB、yhfA和yhaA编码功能未知的假拟蛋白。
图12中，通过将带有P32的早期指数细胞生长1小时，凝胶照片显示了单核细胞增生利斯特氏菌菌株1001(条带1)、单层细胞增生利斯特菌菌株ScottA(条带2)和伊氏利斯特菌菌株3009的体内磷酸化。通过SDS PAGE进行全部细胞匀浆分离，凝胶进行放射自显影。
图13中的凝胶照片显示RIP抑制金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中的TRAP磷酸化。金黄色葡萄球菌(右)和表皮葡萄球菌(左)在存在或不存在RIP的情况下在体内磷酸化1小时。通过SDS-PAGE分离全部细胞匀浆，凝胶进行放射自显影。
图14A描述了存在RIP的情况下(RIP-)和不存在RIP的情况下(RIP+)的粘着性。在存在或不存在5μg RIP(RIP+/-)的情况下将FITC标记的细菌细胞(106CFU)滴在含有104融合的HaCat细胞的微量滴定板。将细胞在37℃下温育30分钟，用PBS洗涤，测量485/530nm处的荧光。
图14B描述了存在RIP的情况下(RIP-)和不存在RIP的情况下(RIP+)的粘着性。表皮葡萄球菌在聚苯乙烯板上生长3小时，用番红对粘着性细菌进行染色，测量490nm处的吸收。
表1在存在或不存在局部(A)或肠胃外(B)的抗生素预防的情况下使用涂布有RIP的聚酯纤维移植物对表皮葡萄球菌感染的预防。
表2RIP防止聚酯纤维移植物相关的表皮葡萄球菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)感染。
简图1是提出的金黄色葡萄球菌发病机理。
具体实施例方式
描述本发明的蛋白质、制剂和方法之前，应当理解为本发明并不限于所描述的具体化合物、特征和步骤，这些当然可以变化。还应当理解本文使用的术语仅仅为了描述具体的实施例，而不是用来限定本发明的范围，本发明的范围仅受所附的权利要求书的限定。
本文提及的所有出版物和专利在此引为参考，结合引用的出版物和专利公开并描述具体的方法和/或材料。本文讨论的出版物和专利提供的仅仅是它们在本发明的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容不应认为是准许本发明由于存在先于现有发明的这些出版物或专利原因，而不被给予权利。此外，提供的发表或授权日期可能与真实日期不同，可能需要单独确认。
通常，此后采用的术语以及细胞培养和蛋白质生物化学方面的实验室流程是本领域所公知和常用的。通常，酶促反应和柱层析是根据制造商的说明书进行的。除非另外定义，本文采用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。尽管任何与本文所述相似或相当的方法和材料可以用于本发明的实施或测试，但本文描述的是优选的方法和材料。为了本发明，以下定义了上述的术语。术语“药学可接受的”或“治疗可接受的”是指不干扰活性成分的效果或生物活性，并对宿主或患者无毒的物质。
术语“编码(encoding)”或“编码(encode)”通常指以可翻译形式存在的序列信息，通常可操作地与启动子连接。当功能启动子提高那个序列的转录或表达时，该序列可操作地与启动子连接。由于相同的信息内容以很接近的形式存在，尤其是当其与促进正义链的表达的序列连接时，人们认为反义链也编码序列。采用标准或修饰的基因编码时，信息是可转换的。参见诸如Watson等人著(1987)，基因的分子生物学(The Molecular Biology of the Gene)(第四版)，第1&2卷，Benjamin，Menlo Park，California。
用于指核酸序列时，术语“同源”表示两个或多个核酸序列的大部分相同。通常为其序列的至少约70％，优选其序列的至少95％。
另一个序列基本相同的指征是它们是否在严格的条件下与相同的核苷酸序列杂化(参见诸如Sambrook等人著，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1985)。严格的条件依赖于序列，在不同的环境下有所不同。通常，严格的条件选择是低于热熔点约5℃(特定序列在定义的离子强度和pH值下的TA)。Tm是(在定义的离子强度和pH值下)50％的目标序列与精确配对的探针杂化的温度。一般来说，严格的条件是pH值为7、温度至少约60℃时盐浓度至少约0.2M的条件。
用于指蛋白质、多肽或肽时，这些术语在此是可以交换使用的，术语“同源”是指两种蛋白质或多肽氨基酸序列的大部分相同。通常为其序列的至少约97％，优选其序列的至少约95％。多肽或蛋白质的同源性分析一般用序列分析软件测量，参见诸如Genetics ComputerGroup的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison Wisconsin 53705。蛋白分析软件使用同源性测量对替换、缺失和其它修饰进行同源序列比对。保守性替代一般包括下列基团内的替代甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸。
本文采用的术语“分离的”意指描述在不同于化合物天然存在的环境中的目的化合物(例如聚核苷酸或多肽)。“分离的”意指包括基本上富含目的化合物和/或目的化合物的部分或基本上提纯的样品内的化合物。
术语“分离的”应用于例如核酸时，是指基本上从其它大分子、细胞组分，或者与例如核糖体、聚合酶、其它核酸序列等的天然核酸自然伴随的DNA序列中分离出的核酸。这个术语包括与其天然存在的环境中不同的核酸或多肽，包括重组体或克隆的DNA分离制品和化学合成的类似物，和通过异源系统生物合成得到的类似物。基本纯或生物纯的核酸包括核酸的分离形式。
术语“生物纯”或“基本纯”是指基本上或实质上不含天然状态下发现的通常与其伴随的成分的材料，例如至少60％不含与其天然相关的其他成分，优选75％不含与其天然相关的其他成分，最优选90％不含与其天然相关的其他成分。
术语“重组体”是指非天然存在的核酸序列，或通过另外两种分离的序列片断的人工组合，即通过化学合成、基因工程等生成。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指任何哺乳动物的治疗性介入，优选人类或牛类，或任何其他能够受到如本文所述可预防和/或治疗的类型的细菌感染的动物。可以认为这样的动物的范围非常广，包括像人类和鸟类这样完全不同的物种。
(i)预防，即使临床症状未发生，例如防止感染发生和/或发展到有害的状态。
(ii)抑制，即停止临床症状的发展，例如停止正在进行的感染使得感染完全消灭或者达到不再有害的程度。
(iii)缓解，即导致临床症状的退化，例如导致感染导致的发热和/或炎症的缓解；和(iv)在生物薄层形成的预防上(或细菌的微生物证据(在实际症状之前))。
治疗通常应用于对任何本文所述的物种导致的细菌感染易感的任何哺乳动物(例如哺乳动物、鸟类等)，通常为哺乳动物，例如人类或牛类，其治疗可以应用于细菌感染的预防或活性细菌感染的改善，其中的细菌是葡萄球菌属某些种的细菌。
术语“有效量”和/或“治疗量”是指足够为被治疗的疾病状态提供预防和/治疗的剂量。这将基于患者、疾病和被影响的治疗而变化。在细菌感染的情况下，“有效量”是实际上提高治疗感染的概率所必需的那个量，特别是提高成功预防感染或当已发生时将感染消除的概率的那个量。
本文所用的术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”是用来包括任何氨基酸序列，并包括修饰的序列(例如糖基化、加入聚乙二醇、包含保守氨基酸替代、包含保护基，包括例如5-氧代脯氨酰的、酰胺化等)。该术语包括天然存在的(例如非重组体)蛋白质、多肽、肽和寡肽，以及根据本领域公知的方法重组或人工合成的蛋白质、多肽、肽和寡肽。与本发明一起使用的术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”包括在葡萄球菌属某些种中天然存在的分子和可用于治疗感染或生成可用于治疗感染的抗体的分子。本文应用“多肽”、“蛋白质”或“肽”指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，“多肽”、“蛋白质”或“肽”和类似的术语并非意指将氨基酸序列限定为与引用的蛋白质分子相关的天然的氨基酸全序列。另外，本发明的多肽和蛋白质或其片段可以以具有D型氨基酸而不是自然界存在的L型氨基酸的合成形式生成。
本文所用的“聚核苷酸”是指寡核苷酸、核苷酸及其片段或部分，以及肽核酸(PNA)及其片段、部分或反义分子，和基因或合成源的单链或双链DNA或RNA，并代表了正义链或反义链。使用的“聚核苷酸”指特定的聚核苷酸序列时(例如RIP、TRAP或RAP蛋白编码聚核苷酸或RIP衍生物、类TRAP或类RAP蛋白编码聚核苷酸)，“聚核苷酸”用来包括编码与引用的蛋白质在功能上相当的蛋白质的聚核苷酸，例如，聚核苷酸的简并变体(即编码相同的氨基酸序列并且由于基因密码的简并而存在的核酸序列上的变体)，或编码引用的蛋白质的生物活性变体或片段的聚核苷酸。
“反义聚核苷酸”是指与给定聚核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述给定聚核苷酸序列包括的转录或翻译相关的聚核苷酸序列(如启动子)，和/或给定聚核苷酸序列的编码序列，其特征在于所述反义聚核苷酸能够与聚核苷酸序列杂化。尤其值得关注的是能够在体外或体内抑制转录和/或翻译的反义聚核苷酸。
本文所用的“肽核酸(peptide nucleic acid)”是指包含例如赖氨酸，和氨基已加上的氨基酸残基的寡聚体分子。这些小分子也命名为抗基因剂(anti-gene agents)，通过结合到其互补(模板)核酸链上来停止转录延伸(Nielsen等人1993 Anticancer Drug Des 853-63)。
术语“抗体”用来指能够结合抗原的免疫球蛋白。本文所用的抗体用来包括能够结合目的抗原决定基、抗原或抗原片段的整个抗体和任何抗体片段(如F(ab)′、Fab、Fv)。本发明优选的检测抗体和疫苗抗体对目的蛋白质是免疫反应性或免疫特异性的，并因此特异性地和选择性地与目的蛋白质结合，例如抗-RAP或TRAP抗体。术语“抗体”包括所有类型的抗体，例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体和通过噬菌体呈现法产生的抗体。本发明特别优选的抗体是与RAP或TRAP亲和度相对高的抗体。本发明的抗体优选与特定物种有免疫反应性或对特定物种有免疫特异性，例如从金黄色葡萄球菌得到的RAP或TRAP。
蛋白质的“抗原片段”是指这个蛋白质上能够结合抗体的部分。
“特异性结合”是指抗体在例如蛋白质的抗原决定基、例如RAP蛋白的特定多肽上的高抗体亲抗原性和/或高亲和力结合。抗体与其在该特定多肽上的抗原决定基的结合优选强于相同抗体与任何其它抗原决定基的结合，尤其是那些可能存在于与目的特定多肽相关的分子中或与其相同的样品中的抗原决定基，例如更强地结合在例如RAP蛋白的抗原决定基片段上，以便通过调节结合条件使抗体几乎专一地结合在期望的蛋白质的抗原决定基位点或片段上。
“可检测标记性抗体”是指附有可检测标记的抗体(或保留结合特异性的抗体片段)。可检测标记通常通过化学结合连接，但是当标记是多肽时，它也可通过基因工程技术连接。可检测标记的蛋白的产生方法在本领域是公知的。本领域公知的可检测的标记包括放射性同位素、荧光团、顺磁标记、酶(如辣根过氧化物酶)，或者发射可检测的信号(如放射性、荧光、色)或将标记暴露在其底物后发射可检测的信号的其它分子部分或化合物。各种可检测信号/底物对(例如辣根过氧化物酶/二氨基联苯、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白、荧光素酶/荧光素)、标记抗体的方法和使用标记抗体的方法在本领域是公知的(参见例如Harlow and Lane编辑(AntibodiesA Laboratory Manual(抗体实验手册)(1988)Cold Spring Harbor Laboratory印刷，Cold SpringHarbor，NY))。
本发明为葡萄球菌属某些种和其它细菌导致的感染的预防和治疗提供了多肽。这些多肽包含通式Y(K或S)PXTNF(SEQ ID NOS1和2，Serial No.09/839.695)，其中X是C、W或I。氨基酸可以修饰，可以包括D型氨基酸。在另外的实施方式中，该多肽可以包含通式KKY(K或S)PXTN，其中X是C、W或I，或修饰的氨基酸。
本发明的范围还包括了编码本发明的多肽的核酸的使用。这样的核酸可以是DNA、RNA或反义核酸。本发明的核酸分子可以以合成或提纯、分离的分子提供，包括但不限于“裸DNA”；或为了给药与其它化合物的复合体在例如但不限于质粒或病毒的载体中，包括表达载体。这样的技术在本领域中是公知的。本发明的多肽优选通过任何本领域中的公知技术从头合成，或可以由例如RNA或DNA的核酸编码，并转移到宿主中。
本发明的多肽一般给予感染了诸如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌的葡萄球菌，或有这样的感染风险的宿主。该宿主一般是人类患者。也可以用本发明的组合物治疗的动物，包括但不限于例如牛、绵羊、山羊、兔子和猪的具有经济或兽医重要性的动物，以及例如大鼠、小鼠、家兔或豚猪的实验动物。
本文所用的“治疗剂量”是预防、减轻、缓和或降低患者症状的严重程度的剂量。本发明的组合物可以预防性地用来防止葡萄球菌感染，或可以在症状发作之后治疗性地使用。在一些实施方式中，向给药的化合物中诱导抗体的形成是合乎需要的。在这样的例子中，优选本领域中使用的标准免疫流程。用于免疫所给药的组合物可以任选包括佐剂。
在本发明的一些实施方式中，提供了RAP或TRAP或RAP受体的拮抗剂。不限于任何一种理论，RIP可以通过与RAP竞争，结合RAP受体而作用，从而充当了RAP、TRAP和/或RAP受体的拮抗剂。这样的拮抗剂包括但不限于与RAP或TRAP特异性结合的抗体；与RAP或TRAP配体特异性结合的抗体；RAP、TRAP或RIP的配体；反义核酸；RAP、RIP和它们的配体的辅助肽、非肽和仿肽类似物。
抗体可以是合成的、单克隆或多克隆的，可以用本领域公知的技术产生。为了治疗的用途，经常优选具有人类恒定区和可变区的“人类”单克隆抗体，以使患者针对抗体的免疫应答最小。这样的抗体可以通过使含有人类免疫球蛋白基因的转基因动物免疫来生成。参见Jakobovits等人Ann NYAcad Sci 764525-535(1995)。与合成或半合成的抗体相关，这样的术语用来包括但是不限于抗体片段、同工型抗原交换抗体(switched antibody)、人源化抗体(例如小鼠-人类、人类-小鼠等)、杂交体、具有多特异性的抗体、全合成的类抗体分子等等。
如下文所讨论，可以为了阻断配体与RAP、TRAP或RIP的结合的能力，和/或为了其它性质，例如在体内对抗细菌感染的保护能力，对抗体进行筛选。
在本发明的一些实施方式中，反义核苷酸分子用作RAP或TRAP的拮抗剂。反义核酸分子是核酸的互补寡核苷酸链，其设计为结合特定的核苷酸序列以抑制靶向蛋白质的合成。这些试剂可以单独使用或与其它拮抗剂联合使用。
反义拮抗剂可以提供为例如RNA的反义寡核苷酸(参见例如Murayama等人Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7109-114(1997))。反义序列也可以提供在病毒载体中，例如，举例来说，在乙肝B病毒中(参见例如Ji等人，J.Viral Hepat.4167-173(1997))；腺病毒相关病毒中(参见例如Xiao等人，Brain Res.75676-83(1997))；或包括但不限于HVJ(仙台病毒)—脂质体基因输送系统的其它系统(参见例如Kaneda等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.811299-308(1997))；“肽载体”(参见例如Vidal等人，CRAcad.Sci IU 32)279-287(1997))；如游离载体或质粒载体中的基因(参见例如Cooper等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.946450-6455(1997)，Yew等人，Hum Gene T Jier.8575-584(1997))；如肽-DNA聚集体中的基因(参见例如Niidome等人，J.Biol.Chem.2721530.7-15312(1997))；如“裸DNA”(参见例如U.S.5,580,859和U.S.5,589,466)；和脂质内载体(inlipidic)系统(参见例如Lee等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.14173-206(1997))。
可以通过多种本领域的公知技术和/或本申请中公开的技术，对RAP、TRAP或RAP受体的候选拮抗剂进行功能筛选，例如小鼠模型中保护不受金黄色葡萄球菌的感染。在所有药物化学家公知的药典中可以找到大量适当的本发明的拮抗剂的制剂Remington′sPharmaceutical Sciences，(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1975))，特别是其中Blaug、Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊、油膏、胶质、蜡、油、脂质、无水吸收基、水包油或油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶和含有聚乙二醇的半固态混合物。
有效治疗所必需的活性成分的量取决于许多不同的因素，包括给药的方式、靶点、患者的生理状态和其它给予制剂。因此，治疗剂量应当调节为使安全性和有效性最优化。一般地，体外使用的剂量可以为活性成分的原位给药提供有效量的有用指导。治疗具体疾病的有效剂量的动物试验提供了人类剂量的进一步预测性指示。在例如Goodman和Oilman的The Plumnacological Basis of Therapeutics，第7版(1985)，MacMillan Publishing Company，New York和Remington的Phannaceutical Sciences，第18版(1990)，Mack Publishing Co.EastonPerm中，描述了各种需要考虑的事项。其中讨论了给药方法，包括口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、透过皮肤、鼻吸入、电离子导入给药等等。
本发明的组合物可以根据给药的方法以各种单位剂型给药。例如，适于口服给药的单位剂型包括例如粉末、药片、药丸、胶囊的固体剂型和例如酏剂、糖浆和悬液的液体剂型。活性成分还可以无菌液体剂型肠道外给药。胶囊包含活性成分和作为非活性成分的粉末载体，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁等等。
另外的可以加入以提供期望的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其它已知的期望的性质的非活性成分的例子有红色氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、食用白墨水等等。类似的稀释剂可以用于制造压缩药片。药片和胶囊都可以制造为缓释产品，以便在数小时内提供药物的持续释放。压缩药片可以是糖衣或膜衣的，以掩盖任何令人讨厌的味道并防止药片与大气接触，或者是肠溶衣的以便在肠胃道中选择性分解。口服的液体剂型可以包含色素和调味品，以增加患者的接受程度。
本发明的组合物在药物制剂中的浓度变化范围可以很大，即从低于约0.1wt.％，通常在或低于约2wt.％到差不多20wt.％到50wt.％或更高，而且根据选择的特定给药模式，主要由液体体积、粘度等选择。
本发明的组合物也可以通过脂质体给药。脂质体包括乳液、泡沫、胶团、不溶性单分子层、液晶、磷脂分散液、片状层等。在这些制剂中待输送的本发明的组合物单独或与结合在例如抗体的目的靶底上的分子一起，或与其他治疗性或抗原性组合物一起结合为脂质体的一部分。因此，本发明的用本发明的期望的组合物填充或修饰的脂质体能够系统地输送，或被指向目的组织，然后脂质体在那里输送选择的治疗性/抗原性多肽组合物。
本发明所用的脂质体由标准的形成囊泡的脂类组成，通常包括中性或带负电的磷脂和甾醇，如胆固醇。磷脂的选择通常由例如脂质体的大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性决定。可以使用多种制备脂质体的方法，如在此引入作为参考的例如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美国专利4,235,871号、4,501,728号、4,837,028号和5,019,360号中所述。
包含本发明的组合物的脂质体悬浮液可以静脉内给药、局部给药、表面给药等，其剂量根据给药的方式、所传输的本发明的组合物和所治疗的疾病的阶段和其他因素变化。
对于固体组合物，可以使用传统的无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。对于口服给药，通过结合任何例如先前所列举的载体的通常采用的赋形剂，形成药物可接受的无毒组合物，其通常为活性成分，即一种或多种本发明的本发明的组合物的10-95％，更优选其浓度为25％-75％。
对于气雾剂给药，本发明的组合物优选以与表面活性剂和挥发剂一起的极细的形式提供。本发明的组合物的典型百分比为0.01wt.％-20wt.％，优选1％-10％。该表面活性剂当然必须是无毒的，并优选溶于挥发剂。这样的试剂的代表性例子是含有6到22个碳原子的脂肪酸的酯或偏酯，例如己酸、辛酸、月桂酸、软脂酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric acid和油酸与脂肪族多元醇或其环酐。也可以采用混合酯，例如混合或天然的甘油酯。表面活性剂可以构成组成的0.1wt.％-20wt.％，优选0.25-5％。组合物的平衡一般是挥发剂。如果需要还可以包括载体，如例如用于鼻内传输的卵磷脂一样。
另外可以以储存型系统(depot-type system)、微囊剂型，或通过本领域公知技术的植入物来输送本发明的构成物。同样地，可以通过泵向目的组织输送构成物。
如果制剂中的活性试剂不被制剂失活并且制剂在生理学上是相容的，任何前述的制剂在根据本发明的治疗或疗法中都可能是恰当的。可以制备本发明的多肽的多克隆和/或单克隆抗体。本发明的多肽由此可以如本文所述制备，并偶联到例如钥孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)的载体分子上，以选定的限量向家兔注射几个月以上。可以测试家兔血清对其多肽的免疫反应性。通过以多肽注射小鼠可以产生单克隆抗体。单克隆抗体可以通过本领域公知的方法筛选，如例如Harlow和Lane(1988)AntibodiesA laboratory manual.Cold SpringHarbor Press，New York和Coding(1986)Monoclonal antibodiesPrinciples and Practice(第二版)Academic Press，New York中所描述。抗体与多肽的抗原决定基的特异性免疫反应性可以测定。这些抗体将用于诊断检验或用作药物组成的活性成分。
为了产生多克隆抗体，可以选择适当的目标免疫系统，一般为小鼠或家兔，尽管可以使用其它的物种如山羊、绵羊、母牛、豚鼠和大鼠。根据本领域公知的方法将基本上纯化的抗体引入到免疫系统中。免疫反应一般通过免疫测定法来测定。合适的例子包括ELISA、RIA、荧光测定等等。这些抗体将用于诊断化验或用作药物组成的活性成分。
RAP核酸和蛋白本发明还提供了一种从非致病的葡萄球菌属某些种中分离并提纯的蛋白质(RAP)。该RAP蛋白的分子量大约为33kDa。在一个实施方式中，RAP蛋白由包含09/839,695号序列中SEQ ID NO12的序列并包含09/839,695号序列中SEQ ID NO13的氨基酸序列的聚核苷酸编码。以下的序列表中提供了这些序列。
RAP核苷酸术语“RAP基因”通常用来命名RAP基因和它们的相同形式。“RAP基因”还意指编码具体RAP蛋白的开放阅读框，以及相邻的与表达调控有关的5′和3′非编码核苷酸序列(如启动子区)。为了在染色体外维持或整合到宿主中，可以将该基因导入到适当的载体中，在一个实施方式中，该RAP基因包含09/839,695号序列中SEQ ID NO12的序列。
RAP调控序列可以用来识别RAP表达的转录或翻译调控所需要的顺式作用序列，尤其是在生长的不同阶段(例如早期、中期和晚期对数期)，以及用来识别调控或介导RAP表达的顺式作用序列和反式作用因子。这样的转录或翻译控制区可以可操作的连接到RAP编码序列或其它编码序列上。
本发明所用的核酸组合物可以编码全部或部分的合适的RAP蛋白。通过根据传统方法化学合成寡核苷，通过限制性内切酶酶切消化、通过PCR扩增等，可以得到该DNA序列的片段。一般地，该DNA片段将有至少约10个邻接的核苷酸，通常至少约15nt，更通常至少约8nt到约20nt，更通常至少约25nt到约50nt。这样的小的DNA片段可用于PCR引物、杂交筛选等。更大的DNA片段，即大于100nt，可用于生成编码的多肽。用于例如PCR的扩增反应时，将使用一对引物。
引物序列的精确组成对本发明并不重要，但是如本领域所公知，对于大部分应用，引物将在严格的条件下与目的序列杂交。优选选择一对引物，其生成的扩增产物至少约50nt，优选至少约100nt。引物序列的选择算法通常是已知的，商业软件包中可以提供。扩增引物与DNA的互补链杂交，并且互相引发。
分离并得到基本纯的，通常为除完整的细菌染色体之外的RAP基因和RAP编码序列。通常，得到的DNA基本不含其它的不含RAP序列或其片段的核酸序列，一般纯度至少为约50％，通常至少约90％，一般是“重组体”，即以一种或多种一般在天然染色体上不与它相连的核苷酸为侧翼。
该DNA序列以多种方式使用。它们可以用作鉴别其它葡萄球菌菌株或其它细菌的RAP编码序列的探针。从其它的株、种或属中分离的同源体彼此具有很大的序列相似性，即至少75％，通常至少90％，更通常至少95％的序列同源性。通常，本发明的RAP编码序列(包括同源体、变异体等)的特征是具有如MPSRCH程序(Oxford Molecular)执行的Smith-Waterman同源性搜索算法所测定的大于至少约65％的序列同源性，优选至少约75％，更优选至少约85％，可能大于至少约90％或更多。为了本发明的目的，使用Smith-Waterman算法计算序列同源性如下如MPSRCH程序(Oxford Molecular)执行的Smith-Waterman同源性搜索算法所测定，DNA全长序列中同源性必须大于65％，程序中的使用仿射间距搜索(affine gap search)具有下列搜索参数间距开放补偿(gap open penalty)，12；和间距扩张补偿(gap extensionpenalty)，1。
具有序列相似性(similarity)的核酸也可以通过低严格性条件下的杂交来检测，例如在50℃下的6XSSC(0.9M盐水/0.09M柠檬酸钠)中，并且当经受55℃下的1XSSC(0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠)洗涤时保持结合。另外，序列相似性也可以通过高严格性条件下的杂交来检测，例如在50℃或更高的温度下的0.1XSSC(15mM盐水/0.15mM柠檬酸钠)中。通过使用探针，特别是DNA序列的标记探针，可以分离出同源或相关的基因。也有可能从哺乳动物源中鉴别RAP的同源体。
编码的RAP DNA也可以用来在生物样品中检测基因的表达。文献中已经很好地建立了探查样品中特定核苷酸序列存在的方法和材料，在此不需要详细描述。mRNA从细胞样品中分离。mRNA可以通过RT-PCR来扩增，使用逆转录酶形成互补DNA链，接下来使用目标DNA序列专用的引物来进行聚合酶链式反应扩增。或者，mRNA通过凝胶电泳来分离，转移到例如硝化纤维素、尼龙的适当支持物上，然后用目标DNA的片段作为探针来探测。也可以使用其它的技术，如寡核苷酸连接测定、原位杂交、杂交到排布在固体芯片上的DNA探针。mRNA杂交到RAP序列的检测是样品中RAP基因表达的指征。
可以出于多种目的对RAP核酸序列进行修饰，尤其是它们在细胞内使用时，例如，为了到基因的切割将其结合到核酸切割试剂上，例如如铁或铬的螯合金属离子；等等。
RAP编码序列和/或启动子序列可以以本领域公知的不同的方式突变，以产生启动子强度、编码蛋白的序列等的目标变化。这样的突变的DNA序列或产品基本上与本文提供的序列类似，即分别在至少一个核苷酸或氨基酸上不同，而且可能是在至少2个但是不多于10个的核苷酸或氨基酸上不同。这种序列变化可以是取代、插入或缺失。缺失可以进一步包括更大的变化，例如结构域的缺失。其它目的修饰包括融合蛋白的产生(例如与绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶等等)。
克隆基因的体外诱变技术是已知的。Gustin等人，1993Biotechniques 1422；Barany，1985Gene 37111-23；Colicelli等人，1985Mol Gen Genet 199537-9；和Prentki等人，1984 Gene 29303-13中可以找到突变扫描流程的例子。Sambrook等人，1989 Molecular CloningALaboratory Manual(分子克隆实验手册)，CSH印刷，第15.3-15.108页；Weiner等人，1993 Gene 12635-41；Sayers等人，1992 Biotechniques13592-6；Jones和Winistorfer，1992 Biotechniques 12528-30；Barton等人，1990 Nucleic Acids Res 187349-55；Marotti和Tomich，1989 Gene AnalTech 667-70；和Zhu 1989 Anal Biochem 177120-4中可以找到定点诱变的方法。
RAP蛋白RAP蛋白可以通过任何合适的方法产生，例如，通过从天然表达RAP的细菌中分离，通过重组体方法(如通过含有09/839,695号序列中SEQ ID NO12序列的聚核苷酸的表达)，通过合成方法等等。
在一个实施方式中，RAP直接从生成RAP的葡萄球菌菌株中分离，例如金黄色葡萄球菌。一般地，从指数期后的培养肉汤中收集野生型细胞。然后将细胞离心，对上清液进行提纯，例如通过过滤，然后冻干，重新分散在水中并进一步提纯。
可以从中分离出RAP的葡萄球菌可以包括但不限于金黄色葡萄球菌、S.capitus、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、头状葡萄球菌(S.capitis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、S.chronii、模仿葡萄球菌(S.simulans)、S.caseolyticus、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、克氏葡萄球菌(S.kloosii)、缓慢葡萄球菌(S.lentus)、路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、S.scruri、模仿葡萄球菌(S.simulans)和木糖葡萄球菌(S.xylosus)。优选从金黄色葡萄球菌中分离RAP。
在另一个实施方式中，RAP-编码核苷酸被用来合成全长RAP蛋白或其片段，尤其是与功能性结构域对应的片段(如与RAP相互作用的磷酸化位点等)；并包括目的多肽融合成为其它蛋白或其片段。例如，可以采用表达盒，其提供了可以是诱导型或组成型的转录和翻译起始区，其中在转录起始区的转录控制下可操作的连有编码区，以及转录和翻译终止区。各种转录起始区可以在表达宿主中发挥作用。
根据表达的目的，该多肽可以根据传统方式在原核生物或真核生物中表达。蛋白质的大规模生产中，例如大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母(S.cerevisiae)的单细胞有机体，或者例如脊椎动物尤其是哺乳动物的高级生物的细胞，如COS 7细胞，可以用作表达宿主细胞。或者可以合成RAP片段。
通过使用表达宿主可以获得大批量多肽时，可以根据传统的方式分离并提纯RAP蛋白，例如采用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它的提纯技术。纯化的蛋白通常纯度至少约80％，优选纯度至少约90％，纯度可能接近并达到100％。
该RAP蛋白(天然的、重组的或合成的)可以用于产生抗体，其中短的片段提供对特定多肽具有特异性的抗体，更大的片段或整个蛋白用于整个多肽表面的抗体的产生。抗体可以产生为RAP野生型或变异型。抗体可以产生对应于这些结构域的分离的肽，或产生天然蛋白，例如通过表达RAP的细胞的免疫作用、与膜内插有RAP蛋白的脂质体的免疫作用等等。
抗-RAP抗体本发明还提供了与RAP特异性结合并发生免疫反应的抗体。该抗体可以是单克隆的、多克隆的或人源化的，并是使用本领域公知的方法制备的。通常，抗体根据传统方式制备，其中的蛋白质或其抗原部分自身或其与如KLH、pre-SHBsAg、其它的病毒或真核蛋白质等的已知免疫抗原载体偶联用作免疫原。如果合适的话，可以使用各种佐剂与一系列注射剂。对于单克隆抗体，一次或多次加强注射之后，分离脾，通过细胞融合将淋巴细胞无限增殖，然后筛选结合的高亲和抗体。在一个优选实施方式中，脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞以约20∶1到约1∶1的比例混合，但是优选以约2∶1的比例。优选用同一物种的动物作为融合过程所用的体细胞和骨髓瘤细胞的来源，其中的动物选择大鼠、小鼠、家兔、母牛、鸡、火鸡或人。体细胞和骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤细胞，其通过标准程序在培养液中生长以产生期望的单克隆抗体。进一步的描述参见如Monoclonal AntibodiesA LaboratoryManual，Harlow and Lane eds.，Cold Spring Harbor Laboratories，ColdSprinig Harbor，New York，1988。如果需要的话，编码重链和轻链的mRNA可以通过在大肠埃希氏菌中的克隆来分离和诱变，重链和轻链混合以进一步增强抗体的亲和性。体内免疫接种产生抗体的替代方案作为的方法包括结合在噬菌体“展示”库上，通常结合体外亲和成熟。
本发明的多克隆抗体可以通过向大鼠、小鼠、兔、牛、鸡或火鸡中注射RAP以启动免疫原反应来产生。它们可以是多克隆或单克隆的，也可以是基因工程的或合成的。RAP可以与例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)的蛋白载体偶联。也可以使用佐剂。在适量时间内建立高效价的(high-titer)抗-RAP抗体之后，收集血清或卵。可以通过放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或通过免疫沉淀法来测试血清或卵中抗体的存在。免疫球蛋白可以通过顺序沉淀法、从盐溶液中“盐析”蛋白质部分的传统方法，或者通过本领域公知的层析方法来分离。
RAP细菌中的RAP(RplB)序列RAP从金黄色葡萄球菌RN6390B的培养物上清液中提纯，RAP的NH2末端序列测定为IKKYKPITN(Balaban N等人，Science 2000，287391a[18])。将该序列与几个金黄色葡萄球菌数据库进行比较(TblastN算法)，其中仅发现一个ORF与上述肽序列高度匹配。该ORF编码推定的277个氨基酸的蛋白质，它是L2(或RplB)序列的直向同源体。
金黄色葡萄球菌RN6390B中的相应基因通过PCR扩增，并进行测序(GenBank登录号为AF205220)。金黄色葡萄球菌的推定RplB与其它细菌中的RplB高度同源(图1)。而且，将它的序列与其它可得到的金黄色葡萄球菌基因组序列对比，发现它在菌株中是高度保守的(数据未显示)。
重组体RAP(称为rRAP或rL2)的产生为了生成rRAP，设计了加入限制酶切位点的对应于rap(rplB)基因5′和3′端的正向和反向引物。这些引物通过PCR并使用金黄色葡萄球菌RN6390B染色体DNA作为模板扩增完整的rplB基因，。将扩增的DNA消化并连接到在插入的基因的5′端具有六个组氨酸标记的pET14b载体(Novagen，WI)的相应位点上。含rap(pET2-5)的质粒用来转化大肠埃希氏菌BL-21(DE3)/pLysS。诱导并收取细胞，重组体His-rRAP蛋白通过镍柱分离，his(组氨酸)标记通过凝血酶去除。
特别地，为了生成rL2，基于rap序列(下划线的)设计了加入5′Ndel和3′BamHI限制酶切位点的对应于rap基因5′和3′端的正向和反向引物。这些引物，5′GAA TTC CATATG GCT ATT AAA AAG TATAAG3′(核苷酸1-21(09/839,695号序列中SEQ ID NO14))和5′CGCGCG GATCCT TAT TTT TTC TTA CGT CCACG3′(核苷酸840-819(09/839,695号序列中SEQ ID NO15)的互补物)用来通过PCR并使用金黄色葡萄球菌染色体DNA作为模板扩增完整的rap基因。将扩增的DNA用Ndel和BamHI消化并连接到在插入基因的5′端具有六个组氨酸标记的pET14b载体(Novagen，WI)的相应位点上。含rap(pET2-5)的质粒用来转化大肠埃希氏菌BL-21(DE3)/pLysS(SBpET2-5)。通过向培养物中加入1mM IPTG并温育3小时，诱导重组蛋白质的合成。收取细胞，用50mM Tris pH 7.9缓冲液洗涤一次。根据制造商的说明书并加以一些修改，使用镍柱分离重组His-rRAP蛋白(Xpress SystemsProtein Purification，Invitrogen，CA)。将50mL的细胞沉淀重新分散在10mL结合缓冲液(20mM磷酸钠pH 7.8+0.5M NaCl)中并超声(15秒2转的最大水平脉冲，间隔30秒)，然后在微离心分离机中旋转。将上清液装到预平衡过的镍柱上。
装入之前，将含螯合琼脂糖珠的柱子中装入含有50mM NiCl的带电荷缓冲液，并用结合缓冲液平衡。用5倍体积的结合缓冲液将柱子冲洗三次，接下来用5倍体积的20mM磷酸钠+0.5M NaCl pH 7.8冲洗三次，然后用缓冲液调节pH到6。然后用0-5M咪唑将重组体蛋白从柱子中洗脱出来。用凝血酶除去His标记。
单克隆抗-rRAP抗体识别天然RAP
单克隆抗体从rRAP引发的小鼠中产生。用ELISA测试杂交瘤细胞上清液中抗注射的抗原的特定抗体的存在。克隆阳性杂交瘤细胞并用来培育腹水。为了测试重组体蛋白的抗体是否识别天然分子，将rRAP和部分提纯的天然RAP(野生型金黄色葡萄球菌RN6390的指数期后期上清液，＞10kDa)进行SDS-PAGE(12.5％)，用Western印迹，用丽春红对膜进行染色(图2条带1，2)。将膜封闭，与阳性抗rRAP杂交瘤细胞制成的腹水(1∶10000稀释)温育。结合的抗体由结合氧化物酶的抗小鼠IgG检测，并通过化学发光显影观测(图2条带3，4)。如图2所示，培育的抗rRAP的单克隆抗体特异性识别分泌到上清液的天然分子(图2条带4)。
重组体RAP具有活性并诱导RNAIII合成为了测试rRAP是否具有活性并能够诱导RNAIII合成，将含有rnaiii::blaZ融合结构的金黄色葡萄球菌细胞与递增量的rRAP保温。作为对照，细胞仅与培养基保温(负对照)。通过加入在□-内酰胺酶的存在下变成浅红色的黄色底物硝噻吩(nitrocefin)来检测RNAIII(□-内酰胺酶活性)。当试验组和对照组之间的差别至少两倍，一组变为浅红色而另一组仍然是黄色时该方法是有用的。如图3A所示，rRAP以浓度依赖的方式激活RNAIII的合成，达到了2.25nmole/107细菌的阈值水平。RNAIII通过重组体RAP的激活与部分提纯的RAP的激活类似。与不加rRAP时比较，在2.25nmole rRAP的存在下RNAIII合成(□-内酰胺酶活性)的增加是显著的(P＜0.00169)。我们还通过Northern印迹测试了RNAIII合成的诱导，其中细胞在有rRAP和无rRAP的条件下生长30分钟，收取细胞，采用Northern印迹，用RNAIII-特异性放射性同位素标记的DNA检测RNAIII的存在。膜用放射自显影并测定条带密度。如图3B所示，rRAP诱导了RNAIII的合成。
TRAPTRAP对金黄色葡萄球菌发病机理是必需的已经显示RAP诱导TRAP的磷酸化，RIP抑制TRAP的磷酸化[5]。为了显示TRAP对于金黄色葡萄球菌发病机理的重要性，破坏金黄色葡萄球菌8325-4中的traP基因，测试母株(TRAP+)和突变株(TRAP-)的生长、RNAIII合成、毒素的生成和发病机理。为了测试细胞生长和RNAIII合成，细胞从指数生长期的早期培养到后期。相隔一段时间测定细胞密度，并收集每一生长时期的细胞样品，用Northern印迹，并用RNAIII-特异性放射性元素标记的DNA来检测RNAIII的存在。如图6A所示，观察不到TRAP+和TRAP-菌株之间在细胞生长上的差别。从指数期中期观察到了TRAP+菌株中RNAIII的合成，但是在TRAP-菌株中并不存在(图6B)，证实了TRAP是RNAIII合成的诱导中的重要因子。
已知RNAIII正调控许多金黄色葡萄球菌毒素的生成，其中一些是溶血素[2]。为了测试溶血素的产生，TRAP+和TRAP-菌株在绵羊血琼脂板上在37℃下生长过夜，然后在4℃下(以测试□和□溶血素)。如图7A所示，在TRAP-菌株中没有观察到溶血现象，证实了TRAP是毒素生成的重要因子。
为了测试TRAP是否对生物薄层的形成具有重要性，TRAP+和TRAP-菌株在聚苯乙烯孔中生长，并用番红对粘着性细菌进行染色。如图7B所示，TRAP-菌株中的番红染色大大降低，表明TRAP是细胞粘着性和生物薄层形成的重要因子。
为了测试TRAP在金黄色葡萄球菌体内发病机理中的重要性，将TRAP+和TRAP-菌株皮下注射入小鼠和动物中，然后测试死亡率、损伤的产生和整体健康。如图8所示，所有注射4×108CFU(在板上生长的TRAP+)的动物(n＝10)产生了平均大小为1.74cm2的损伤。所有注射6×109CFU(在板上生长的TRAP+)的动物(n＝5)产生了平均大小为9.4cm2的损伤。8只注射1.3×109CFU(在培养物(*)中生长的TRAP+)的动物(n＝8)中，4只在头24小时内死亡，剩余的产生了大的损伤，平均大小为8.63cm2。另一方面，所有注射了TRAP-菌株的动物显得完全健康，包括产生很小损伤的个别动物。特别地，注射3×108CFU在板上生长的TRAP-的动物(n＝10)中没有一个产生损伤。所有注射2.6×109CFU在板上生长的TRAP-的动物(n＝5)产生了平均大小为0.62cm2的小损伤。注射1.5×109CFU在培养物(*)中生长的TRAP-的动物(n＝8)中，7只动物完全没有产生损伤，一只动物产生0.4cm2的小损伤(平均大小0.05cm2)。注射TRAP+和TRAP-菌株的动物之间损伤大小的差别十分显著(p＜0.0008)。这些结果证实，TRAP的表达对于金黄色葡萄球菌发病机理十分重要，为预防或治疗葡萄球菌感染的新药开发打开了新领域。
TRAP的氨基酸序列分析金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的各种临床分离物中的traP基因通过PCR进行扩增，并测定其序列。这些序列与不同数据库(包括NCBI微生物基因组数据库[http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Micro-blast/unfinishedgenome.html])中BLAST检索的对比表明，TRAP对于葡萄球菌是唯一的。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌TRAP蛋白的推导出的氨基酸序列的对比表明它们在葡萄球菌中是高度保守的。来自不同菌株的金黄色葡萄球菌TRAP蛋白序列的多序列比对分析(ClustalW)表明它的序列分为两个亚组(图9)。组I包括8325中的TRAP，其与COL、MSSA476、Mu50/ATCC700699和N315(16)中的TRAP以及我们的临床鼻孔-分离物#7和11相同。组II包括我们的临床鼻孔分离物12和15以及MRSA252(桑格中心数据库)。组I的TRAP与组II的～97％相同(blastP算法测定的E值为2e-84)。组I TRAP和组II TRAP序列与表皮葡萄球菌序列的相似度为近似86％(E值为9e-65)。
金黄色葡萄球菌临床分离物#12正好在TRAP终止密码子之前插入了IS1181(GenBank登录号AJ489447)。IS1811的插入转变了天然的traP终止密码子，但是在下游27bp处引入了另外一个终止密码子，这便将TRAP从167个氨基酸延长到176个氨基酸(TRAP+GSSSFMVGR)(图9)。与其它临床或实验室菌株类似，TRAP是磷酸化的，并且RNAIII在菌株分离物#12中表达，这表明插入元素并没有损害它的功能(未显示)。
TRAP的二级结构预测TRAP对葡萄球菌是高度唯一的，但是与枯草芽孢杆菌(GenBank登录号Z99109)中的假拟蛋白YhgC蛋白具有一定的序列相似度(E值为9e-15)。有趣的是，除枯草芽孢杆菌之外，160个真细菌基因组中，仅仅在蜡状芽孢杆菌有97％相似的炭疽芽孢杆菌(TIGR数据库)、无害利斯特氏菌和单核细胞增生利斯特氏菌的ORF能够被鉴别，其与TRAP具有一定的序列相似度(E值分别为0.005、0.035和0.1)。与TRAP类似，所有的ORF恰好为167个氨基酸，除了YhgC为166个氨基酸(图10)。
使用蛋白质结构预测服务器The PCIPRED v.2.4对这些蛋白质的二级结构进行预测[http//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psiform.html/]。有趣的是，尽管这些ORF的序列相似度非常低，它们预测的二级结构与TRAP的非常相似(图10)。
金黄色葡萄球菌TRAP基因区的染色体结构(chromosomalorganization)以及与其它革兰氏阳性真细菌的比较所有的葡萄球菌(金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中)基因组中都可以找到TRAP基因区的相同结构(图11)。该TRAP基因有两个多顺反子操纵子侧翼；其中之一(traP上游)编码正铁血红素IX生物合成途径晚期步骤的酶(hemEHY基因)，第二个(traP下游)编码推定的多蛋白质转运系统(ecsAB(C)基因)。traP基因转录的方向与heme和ecs操纵子均相反。在枯草芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌中的yhgC区和利斯特菌中的类TRAP ORF中也可以找到相同的结构(图11)。这些结果表明，TRAP代表了细菌中的一类信号转导蛋白，它可以作为除葡萄球菌之外的许多细菌物种的治疗靶点。
TRAP和类TRAP分子的磷酸化和RIP对TRAP磷酸化的抑制因为类TRAP分子在除葡萄球菌之外的其它细菌物种中已找到，我们测试了它们是否经历磷酸化。我们培育了带有P32的各种利斯特菌菌株(单核细胞增生利斯特氏菌和伊氏利斯特菌(L.ivanovii))和各种炭疽芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的菌株，我们用SDSPAGE测试了TRAP(21kDa)的磷酸化，并随后进行了放射自显影。如图12所示，对于利斯特菌属某些种，21kDa的蛋白质如所预期的发生体内磷酸化。对于芽孢杆菌属某些种得到了类似的结果(未显示)。这些结果暗示发病机理也可以通过细菌表达的类TRAP蛋白中的TRAP磷酸化来调控。
为了测试表皮葡萄球菌中的TRAP磷酸化，如关于金黄色葡萄球菌的测试所述，进行了体内磷酸化测定[5]。简单地说，在具有有放射性同位素标记的正磷酸盐的不含磷的缓冲液的存在下，在存在或不存在RIP(10□g/107细胞)的情况下，培育指数早期的表皮葡萄球菌。温育1小时之后，细胞通过离心收集，并用溶葡萄球菌素处理，接下来加入样品缓冲液，全部细胞匀浆物不经煮沸直接应用于15％SDSPAGE，胶进行放射自显影。作为阳性对照，在6390B金黄色葡萄球菌上进行相同的实验。结果(图13)显示TRAP磷酸化在表皮葡萄球菌中也能够被RIP抑制。鉴于在表皮葡萄球菌中也发现了TRAP的事实，这些结果并不令人惊讶，而且它们显示TRAP的磷酸化和表达对于葡萄球菌发病机理的重要性。由于它的序列在表皮葡萄球菌菌株和物种中是高度保守的，而且由于它的二级结构与其它细菌中的类TRAP分子相似，TRAP可以作为除葡萄球菌之外的许多细菌物种的治疗靶点。
RIP已经表明RIP(天然或合成的，YSPWTNF或衍生物)不仅抑制RNAII和RNAIII的合成，并因此抑制毒素的生成[13，18]，但不显示RIP抑制金黄色葡萄球菌在人类细胞上粘附，和抑制塑料上生物薄层的形成[16]。表皮葡萄球菌的毒性经常与它们在宿主细胞上的粘附能力和在医疗器械上形成生物薄层的能力有关。为了测试RIP是否能够防止表皮葡萄球菌定居宿主细胞，并因此成为治疗和预防的候选物，将表皮葡萄球菌与铺满的角质形成细胞(HaCat细胞)层在存在或不存在RIP的情况下温育30分钟。如图14A所示，RIP显著(p＜0.05)降低了表皮葡萄球菌在HaCat细胞上的粘着性。
为了测试RIP是否降低了表皮葡萄球菌对塑料的粘着性和生物薄层的形成，指数早期的表皮葡萄球菌在聚苯乙烯微量滴定板上生长3小时，用番红对粘附细胞进行染色。这些实验条件容许了生物薄层的形成(如原子力显微镜所观察，未显示)。如图14B所示，RIP显著降低了粘附到塑料上的细胞的数目。这些结果清楚地显示，RIP抑制了表皮葡萄球菌在宿主细胞上的粘附和在体外塑料上的粘附。
RIP能够保护不受移植物相关的感染并与抗生素协同作用为了测试RIP是否能够保护不受移植物相关的感染，使用了大鼠-移植物模型。
方法移植物相关感染的引入将大鼠(Wistar成年雄性(300-350g)，n＝15/实验组)麻醉，剃掉它们背上的毛，并用10％的聚乙烯吡酮磺溶液清洗皮肤。通过1.5cm的切口在中线的一侧制造皮下袋。在无菌条件下，将1cm2无菌胶原封口的聚酯纤维移植物(AlbograftTM，Sorin Biomedica Cardio，S.p.A.，Saluggi VC，Italy)植入袋中。在植入之前，在存在或不存在抗生素(莫匹罗星100mg/l，quinupristin-dalfopristin 50mg/l，levofloxacin 30mg/l，利福平5mg/l)的情况下，立刻将聚酯纤维移植物在10mg/l RIP的盐水溶液中浸泡20分钟，或在单一的盐水或非活性RIP肽类似物(YKPETNF)中浸泡作为对照。将袋用皮肤钳闭合，将含有或不含有2×107细菌的1ml无菌盐水溶液用结核菌素注射器接种到移植物表面上，以生成皮下充满液体的袋。向一些移植物仅用RIP或盐水浸泡的动物中腹膜内注射抗生素(唑啉头孢菌素30mg/kg，imipenem 30mg/kg，teicoplanin 10mg/kg，levofloxacin 10mg/kg)。植入7天后将移植物植出。估计粘附在移植物上的RIP为10-26□g。
移植物感染的测定将植出的移植物置于无菌管中并用无菌盐水溶液洗涤，放置到含10ml磷酸盐缓冲的盐水溶液的管中，超声5分钟以从移植物上去除粘附的细菌。通过在血液琼脂板上培养细菌悬浮液的10-倍稀释系列溶液(0.1ml)进行活细菌的定量。将所有的板子在37℃下保温48小时，测定菌株的存在。通过每一块板子上克隆形成单位(CFU)的数目的计数来对测定细菌的数量。为了测定细菌是否从移植物上有效地除去，将移植物洗涤并超声，并在尼康Eslipse E600光学显微镜(日本尼康Y-THS)下观察。
统计分析体内实验的定量培养结果用平均□SD的平均数来代表。这些结果的对比通过数据的对数转化差异性分析进行。体外粘附检验的统计分析用微软Excel(微软，WA)提供的Student’s(学生)t-检测进行。当P值为□0.05时为显著。
结果为了测试RIP是否能够防止移植物相关的感染，将聚酯纤维移植物用RIP或不用RIP，用或不用不同类型的抗生素(局部预防实验)涂覆。将涂覆的移植物植入大鼠体内，向植入物中注射细菌，一个星期后除去植入物，测定细菌负载。或者，首先用RIP涂覆聚酯纤维移植物，注射细菌，抗生素通过腹腔途径给药(胃肠外预防实验)。作为阴性对照，无局部或肠胃外RIP/抗生素预防下将移植物植入，不注射细菌。作为阳性对照，植入移植物，注射细菌，但是不给予RIP/抗生素预防。作为RIP的阴性对照，使用RIP类似物(YKPETNA)的非活性形式，代替RIP。
结果(表1)清楚地表明，RIP降低了log 3测试的所有菌株的细菌负载，而且当它与一些抗生素一起应用时，它能够100％消除细菌负载。具体地，1)包括在未受感染的负对照组中的动物没有一只具有移植物感染的微生物证据。
2)包括在感染的未经处理的阳性对照组中的所有15只大鼠显示了移植物感染的证据，接种的GISE菌株、MRSE菌株和MSSE菌株的定量培养结果分别显示为6.8×106+/-1.9×106CFU/ml、8.1×106+/-2.2×106CFU/ml、7.3×106+/-6.4×105CFU/ml。涂覆非活性RIP肽类似物的移植物显示了与未经处理的对照组类似的移植物感染，接种了GISE菌株、MRSE菌株和MSSE菌株的定量培养结果分别显示为6.52×106+/-3×106CFU/ml、7.08×106+/-2.1×106CFU/ml、5.4×106+/-8×105CFU/ml。
3)与未经处理的对照组比较，所有具有10mg/l RIP浸泡过的聚酯纤维移植物的组显示了葡萄球菌感染密度降低的证据，接种了GISE菌株、MRSE菌株和MSSE菌株分别为6.2×104±2.0×104CFU/ml(p＜0.05)、7.4×103±1.8×103CFU/ml(p＜0.001)、9.1×103±2.3×103CFU/ml(p＜0.001)。
4)在接种了GISE的大鼠中，RIP移植物的处理比肠胃外抗生素预防更好地抑制细菌(＞10-100倍)，(见表1B)比levofloxacin和利福平局部预防更加有效，但是没有莫匹罗星和quinopristin-dalfopristin局部预防有效(见表1A)。在接种了MRSE或MSSE的大鼠中，除肠胃外实验中的Teicomplanin(见表1B)和局部预防中的莫匹罗星、quinupristin-dalfopristin(见表1A)之外，RIP处理与大多数抗生素相当或者更加有效。
5)当RIP移植物处理与抗生素预防相关联时，细菌负载抑制的水平更高(如果与单独的单一试剂相比)，在一些情况下达到100％，如RIP与肠胃外给予的teicoplanin在MRSE和MSSE菌株的情况下(p＜0.001vs单一试剂)(见表1B)，以及RIP与局部给予的莫匹罗星或quinupristin-dalfopristin在所有菌株的情况下(p＜0.001vs单一试剂)(见表1B)。
金黄色葡萄球菌MRSA、MSSA和GISA以及对万古霉素有抗性的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌株VISA和VISE(未显示)得到了相似的结果。
存体内RIP能够防止移植物相关的感染动物(15/组)接受皮下袋内的植入聚酯纤维移植物。接下来用表皮葡萄球菌(在MSSE、MRSE和GISE上测试)或金黄色葡萄球菌(在MSSA、MRSA和GISA上测试)感染移植物。移植之前将聚酯纤维移植物在含或不含20mg/l的RIP的盐水中浸泡，有些动物接受10mg/L的RIP腹腔注射作为预防处理。结果总结于表2A和2B。
这些结果清楚地显示，RIP能够用来涂覆医疗器械以预防任何类型葡萄球菌的感染，以及RIP与抗生素协同作用。
国际缺失空白页鉴别适于预防和/或治疗葡萄球菌感染的制剂本发明所特别关注的是鉴别具有影响RAP和/TRAP的表达和/或功能的制剂。通常，目的制剂是抑制RAP或TRAP活性的制剂，例如通过抑制RAP的能力来影响RNAIII合成的激活。这样的制剂是致病性葡萄球菌感染治疗开发的候选物。特别关注的是具有对人类细胞的毒性低和/或对葡萄球菌的特异性高的试剂的筛选实验，优选选择对制剂的作用基本上没有或很小有抗性压力的菌株，并且基本不影响宿主的正常菌群(例如不同于广谱抗生素)。
术语“制剂”在本文中用来描述任何分子，例如如上文所述具有改变RAP或TRAP活性的能力或者模拟或提高RIP活性的能力的蛋白质或药物。通常，以不同的制剂浓度平行运行多个测定混合物，以检测对不同浓度的差示反应。一般，以这些浓度之一作为阴性对照，即零浓度或低于检测水平。
候选制剂包括许多化学种类，然而它们一般为有机分子，优选分子量大于50但小于约2,500道尔顿的小有机化合物。候选制剂含有与蛋白质的结构相互作用尤其是氢键结合所必需的官能团，一般包含至少一种胺基、酰基、羟基或羧基，优选有至少两个化学官能团。候选制剂经常包含用一个或更多的上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。候选制剂也可以在包括但不限于肽、糖类、脂肪酸、甾类、外激素、嘌呤、嘧啶的生物分子、衍生物、结构类似物或其组合当中找到。
候选制剂可以从包括合成或天然化合物库的广泛来源中获得。例如，可以利用多种方法来进行许多种有机化合物或生物分子的随机或定向合成，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，细菌(例如非致病性葡萄球菌)、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库也可以得到或者容易生成。另外，天然或人工生成的库和化合物容易通过传统的化学、物理和生物化学方法修饰，可以用来生成组合库。已知的药理制剂可以经受定向或随机的化学修饰，如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等，以生成结构类似物，可以含有如脯氨酰基的保护基，或可以含有D型氨基酸。
候选制剂的筛选可以使用许多种体外测定来筛选候选制剂，包括例如蛋白质-蛋白质结合、蛋白质-DNA结合测定、电泳迁移率变动分析、蛋白质结合的免疫测定等等标记的体外结合测定。提纯的天然的或重组的或合成的RAP、TRAP和/或RIP多肽，和/或人工生成的肽或RAP、TRAP和/或RIP的片段可以用于不同的筛选测定，以鉴别结合、调节(如增加或抑制)或模拟天然蛋白质的作用的配体或底物。提纯的蛋白还可以用来测定三维晶体结构，其可以用于模拟分子间相互作用、转录调控等。
筛选测定可以是结合测定，其中一种或多种分子可以与标记连接，该标记直接或间接地提供可检测的信号。各种标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、例如磁性微粒的微粒等等。特异性结合分子包括几对，例如生物素和链霉抗生物素蛋白、地高辛和抗地高辛等。对于特异性结合组件，互补的组件通常根据已知的程序所用的检测的分子来标记。通常，所采用的特定类型的筛选测定优选可以进行大量候选分子的平行、同时筛选的检验。
本发明的筛选测定包括检测候选制剂对RAP、TRAP和RIP在RNAIII生成和/或毒力因子生成中的作用的影响的测定。例如，候选制剂可以与致病性葡萄球菌接触，在制剂的存在下rnaiii转录水平与RIP、RAP、TRAP和/或RIP、RAP和TRAP组合存在下rnaiii转录水平相比较。这样的筛选测定可以使用含有与rnaiii或毒力因子基因相关的可操作的报道基因系统，例如CAT(氯霉素乙酰转移酶)、p-半乳糖苷酶等的的重组体宿主细胞，以利于rnaiii或毒性基因转录的检测，或利于RNAIII或毒力因子生成的检测。另外可选地，筛选测定可以使用本领域公知的杂交技术(例如Northern印迹、PCR等)来检测rnaiii或毒力因子的转录。
多种其它试剂也包括在本文所述的筛选测定中。测定为结合测定时，这些试剂包括用来促进目的蛋白质-蛋白质结合、蛋白质-DNA结合，和/或降低非特异性或本底相互作用的试剂，如盐、例如白蛋白的中性蛋白、去垢剂等。可以使用提高测定效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸抑制剂、抗菌剂等。可以以任何能够提供需要的结合的顺序加入组分的混合物。在任何合适的温度下进行温育，一般在4℃到40℃之间。选择温育时间以达到最佳活性，也可以优化为促进快速高通量筛选。一般0.1到1小时之间便已足够。
动物模型中候选制剂的筛选如上述测定中所检测的具有期望的活性的制剂可以在非人类动物模型中对它们影响葡萄球菌毒力因子生成和葡萄球菌感染的能力进行进一步筛选。选定的动物模型随着一系列因素而改变，包括但不限于待筛选的候选制剂所针对的葡萄球菌的特定致病性菌株、候选试剂用作治疗剂的最终宿主等的若干因素而变化。适用于筛选检测的动物包括任何容易感染选定的葡萄球菌物种的动物。例如，葡萄球菌物种为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌时，动物模型可以为啮齿动物模型，优选大鼠和小鼠模型。
通常，将候选制剂作为药物给予葡萄球菌易感的非人类动物，其中该动物已经感染了葡萄球菌或接受与候选药物一起的感染剂量的葡萄球菌。候选制剂可以任何期望的方式和/或适于制剂输送的方式给药，以达到期望的结果。例如，候选制剂可以通过注射(例如静脉注射、肌肉注射、皮下注射或直接注射入待达到期望的效果的组织)、局部、口服或任何其他期望的方式给药。通常，该筛选将包括大量接受不同剂量和浓度的候选制剂(从无制剂到能够成功输送给动物的量的上限)的动物，并可以包括不同制剂中制剂的传输。该制剂可以单独给药，或两种或更多种联合给药，尤其是制剂的联合能够导致协同效应时。该制剂可以用来涂覆随后将植入动物内的器械。
给予制剂对动物模型的影响可以通过任何合适的方法监测，例如评测葡萄球菌相关损伤的数目和大小、感染微生物的证据、整体健康等。当候选制剂以期望的方式影响葡萄球菌感染时(例如通过降低感染负载、促进损伤退化等)，候选制剂可鉴别为适用于葡萄球菌感染的治疗的制剂。
治疗细菌感染本发明提供了预防或治疗易受某些细菌感染的人类或动物(如人类金黄色葡萄球菌)的方法，通过给予某种制剂，例如通过抑制RAP-介导的RANIII的激活和随后的毒力因子生成来抑制RAP或TRAP在促进毒力因子生成的活性的制剂。
具有期望的药理活性的化合物可以在生理可接受的载体中作为药物给予宿主，以进行致病性葡萄球菌感染的治疗或预防。治疗剂可以以多种方式给药，口服，局部，肠胃外，如皮下、腹膜内、血管内、肺内(吸入剂)等。取决于导入的方式，该化合物可以各种方式配制。制剂中有治疗活性化合物的浓度可以从约0.1-100wt.％变化。
药物组合物可以以各种剂型制备，例如颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、悬液剂、软膏剂、洗液剂等等。适于口服或局部使用的药物级有机或无机载体和/或稀释剂可以用来组成含有治疗活性的化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水介质、植物和动物油脂。稳定剂、润湿和乳化剂、改变渗透压的盐或确保合适的pH值的缓冲液以及可以用作辅助剂的皮肤渗透促进剂。
在一个实施方式中，通过将RIP或和例如抗RAP-抗体的RAP或TRAP抑制剂或二者一起作为药物给药来治疗宿主。在一个实施方式中，RAP抑制剂与其他RAP或TRAP抑制剂一起给药，并且/或者与其他葡萄球菌毒性的抑制剂一起给药，例如与RIP和/或与传统抗生素一起给药。在另一个实施方式中，给予RAP或TRAP抑制剂，RIP和RAP或TRAP抑制剂(如抗RAP或TRAP抗体)作为药物。这样的组合治疗(例如多种RAP抑制剂的给药；RAP和RIP的给药；和/或TAP或TRAP抑制剂、RIP和/或TRAP或RAP抑制剂的给药)可以涉及活性成分的同时给药或顺序给药。剂量摄入法可以调整为提供最佳的治疗反应。例如，可以每天以几个分开的剂量给药，或者剂量可以由治疗情况所需要成比例降低。该活性化合物可以任何方便的方式给药，例如口服、静脉、肌肉、皮下、颊、经过皮肤或吸入进入。
由RIP、RAP抑制剂、TRAP抑制剂或其组合物组成的制剂可以以治疗有效量给药，例如，足以提高成功预防或治疗感染的几率的剂量。这样的制剂可以通过任何产生相似效果的制剂可接受的给药模式来给药，优选全身性给药。给药可以包括上述的与其它抑制剂的组合，如传统的抗生素。
治疗感染的人类剂量水平是已知的，通常包括每日剂量为每天体重的约0.1到500.0mg/kg，优选为约6.0到200.0mg/kg，最优选为约12.0到100.0mg/kg。通常，人们希望这样的制剂得到的血清浓度近似或高于在少于10天之内降低或消除任何感染所需要的循环水平。给予70kg的人时，该剂量范围是每天约50mg到3.5g，优选每天约100mg到2g，最优选每天约200mg到1g。制剂给药的量当然取决于对象和痛苦的严重性、给药的方式和时间表，以及开药方的医师的判断。
采用制剂治疗感染时，可以使用任何药学上可接受的给药方式。该制剂可以单独给药，或者与其它药物可接受的赋形剂混合，包括固体、半固体、液体或气溶胶剂型的，例如片剂、胶囊剂、粉末剂、液体剂、凝胶剂、悬液剂、栓剂、气溶胶剂等等。该制剂也可以以持续或可控释放的剂型给药(例如采用缓释可生物侵蚀输送系统)，包括储存注射(depot injection)、渗透泵、药丸、经过皮肤的和皮下的(包括电迁移)小块(patches)等，以延长预定速率的给药，优选适于精确剂量的单次给药，或者如下文所讨论的涂覆在待插入体内的器械上的单位剂型。
组合物一般包括传统的药物载体或赋形剂，和本发明的制剂。另外，这些组合物可以包括其它活性制剂、载体、佐剂等。通常，取决于计划采用的给药方式，药物可接受的组合物包含约0.1wt.％到90wt.％的活性化合物，优选约0.5wt.％到50wt.％，其它合适的药物赋形剂、载体等。这样的剂型的实际制备方法对本领域普通技术人员来说是公知的或显而易见的。例如，参见Remington’s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，第15版，1975。
肠胃外给药的特征通常是通过注射，皮下、真皮内、肌肉或静脉注射，优选皮下注射。注射剂可以以传统形式制备，制备为液体溶液或悬液、适于在注射前的液体中溶解或悬浮的固体形式，或制备为乳剂。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外，如果期望的话，待给药的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、增溶剂等，例如诸如醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺盐、环糊精等。
包含在这样的肠胃外组合物中的活性成分的百分比主要取决于它的具体性质，以及受试者的需求。然而，溶液中活性成分的百分比可以是0.01％到10％，如果组合物是将要随后稀释到上述百分比的固体，活性成分的百分比可以更高。优选地，该组合物在溶液中包括0.2-2％的活性成分。
最近刚刚发明的肠胃外给药的方法采用了缓释或持续释放系统的植入，这样便维持了恒定的剂量水平。各种控制持续释放和活性制剂逐渐释放速率的基质(matrices)(如聚合物、亲水凝胶等)在本领域中是公知的。参见美国专利3,845,770号(描述了基础渗透泵)；3,995,651号、4,034,756号和4,111,202号(描述了微型渗透泵)；4,320,759号和4,449,983号(描述了称为推拉式(push-pull)和推融式(push-melt)渗透泵的多室渗透系统)；和5,023,088号(描述了用于不同剂量单位顺序定时渗透模式的渗透泵)。
活性成分的制剂也可以作为鼻或肺吸入气溶胶或用于喷雾器的溶液，或作为吸入的极细粉末的呼吸道给药，可以单独给药或者与例如乳糖的惰性载体或与其它药物可接受的赋形剂联合给药。在这种情况下，制剂颗粒的直径可以倾向于小于50微米，优选小于10微米。参见例如美国专利5,364,838号，它公开了一种胰岛素的给药方法，这种方法可以适用于本发明的制剂的给药。
疫苗接种本发明提供了通过将RAP、TRAP，或者RAP或TRAP的抗原有效部分在药物可接受的载体中给药，作为某种细菌易感(如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的人或动物接种的疫苗，其可以任选地包含佐剂。适于引起免疫反应的制剂在本领域中是公知的。通常，使宿主与例如RAP或TRAP的抗原接触，它扰乱了宿主的免疫系统并导致了对抗原的免疫反应。佐剂可以与抗原一起加入以增加对抗原的免疫反应。给予的多肽的量应足以引起宿主中的保护性免疫反应。确定这种合适的量的方法在本领域中是常规的和公知的。例如，RAP、TRAP和/或其抗原有效部分可以用来为葡萄球菌感染的动物模型的接种疫苗。在这样的动物模型中的有效量可以外推到其它宿主(如家畜、人等)上以提供疫苗接种的有效量。
为动物接种重组RAP(rL2)疫苗4周大的雌性Balb/C小鼠(每组10只小鼠)在第0、7、21天皮下注射50μg rL2(50μg/μl PBS)，第一次注射时与50μl弗式完全佐剂一起注射，第二次和第三次注射时与弗式不完全佐剂一起注射。对照动物仅注射佐剂/PBS。第35天时用如下所述制备的2×109SmithDiffuse金黄色葡萄球菌(SD)进行免疫性实验。每天观察动物的死亡率、整体健康和损伤的产生。测量损伤的大小(面积＝0.5n(长)(宽)。
免疫性实验细菌的制备将Smith Diffuse金黄色葡萄球菌在37℃下在血液琼脂板上生长过夜。细菌以2×1010细胞/ml悬浮在PBS中。将2×109(100μl)细胞与1mg cytodex小珠一起皮下注射入接种疫苗的动物和对照动物中，以诱导局部感染。
通过ELISA测定的抗体水平。在第一次接种之前和第三此接种后10天从尾尖收集一滴血液。将ELISA板用50μl，25μg/ml的抗原涂覆过夜，或用3％BSA涂覆过夜以作为对照。将孔在室温下用3％BSA染色3小时，并在室温下应用50μl血清(在PBS中1∶1000稀释)2.5小时。除去未结合的抗体并用PBS和0.05％Tween 20洗涤孔5次，每次2分钟。应用50μl用PBS/Tween以1∶2000稀释的结合过氧化物酶的抗小鼠抗体(Sigma)在37℃下1小时。去除未结合的抗体，将孔如上述洗涤，根据制造商提供的说明书通过ABTS(Sigma)对结合的抗体进行检测。
疫苗接种实验的结果对应抗原的抗体的产生所有接种的动物中产生了对注射的抗原的抗体滴定度(＞1000)。对照动物中没有一只具有对注射的抗原的可检测的抗体水平。
免疫性实验后的死亡如图4所示，10只仅接种了佐剂的对照动物中，3只动物在免疫性实验后第一天死亡，其它小鼠在第二天死亡。20只接种了rL2的动物中，第一天之内没有死亡，第二天一只死亡，第三天另一只死亡。
损伤所有存活的动物产生了损伤，损伤的大小在免疫性实验后第五天测定。如图5所示，对照动物的平均损伤大小为7cm2，而接种了rL2的动物的平均损伤大小仅为2.5cm2。
结论接种了rL2的动物延迟了死亡，死亡率降低了50％，损伤大小降低了65％。这些结果表明rL2能够带来针对金黄色葡萄球菌感染的保护。值得注意的是用于免疫性实验的细菌的数目格外地高，可以看出如果存在的细菌数目较低，则对感染的保护水平将更高。
结论RAP(天然的或重组的)抑制了RNAIII的体外合成，并保护动物不受金黄色葡萄球菌的体内感染。由于RAP是L2的同源体，其可在所有的细菌中找到，RAP可以作为除金黄色葡萄球菌以外的各种细菌感染的治疗靶点。
涂覆的器械本发明提供了表面涂有含有可有效抑制葡萄球菌或其它表达RAP、TRAP或类RAP或类TRAP分子的细菌形成生物薄层的RAP抑制剂(例如抗RAP或抗TRAP抗体、抑制肽、RIP肽或RIP肽衍生物)的组合物的器械。涂覆的器械可以是任何与葡萄球菌或其它细菌的感染风险有关的，或与宿主(例如外科手术患者、生理期女性等)在葡萄球菌毒力因子中的接触有关的器械。
本发明涂覆的器械包括但不限于导管、针、外科手术器械(如手术刀、海绵、牵开器等)、绷带和绷带材料(如纱布、敷料等)、人造关节、心脏瓣膜、棉塞或其它医疗器械。这样的器械具有与宿主接触带来葡萄球菌或其它细菌的倾向，或者吸引葡萄球菌细菌的定居(如棉塞)的倾向，在这种情况下，涂覆的器械可以预防或降低葡萄球菌或其它细菌的感染，或者预防或降低与例如在葡萄球菌毒力因子中的接触有关的严重症状的发展。
尽管本发明参考具体的实施方式进行了描述，但是本领域的普通技术人员应当理解本发明可以进行各种变化和等同替换，这是不偏离本发明的实质和范围的。另外，可以进行许多修改，使本发明的目的、精神和范围适用于特定的情形、材料、物质组成、方法、方法步骤或多个步骤。所有这样的修改均是落在本文所附的权利要求书的范围之内的。
权利要求
1.一种预防或治疗任何细菌感染导致的感染的方法，所述细菌感染由发病机理中RAP发挥作用的任何细菌物种产生，包括给予受试者在其体内有效引起抗体反应量的RAP型多肽，以预防或治疗在发病机理中RAP型分子发挥作用的细菌物种导致的细菌感染。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是表皮葡萄球菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是酿脓链球菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是单核细胞增生利斯特氏菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是乳酸乳球菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是粪肠球菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是大肠埃希氏菌。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是丙酮丁醇梭菌。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是枯草芽孢杆菌。
10.一种预防或治疗任何细菌感染导致的感染的方法，所述细菌感染由发病机理中RAP发挥作用的任何细菌物种产生，包括给予有效治疗或预防细菌感染量的RIP或RIP衍生物给予受试者，所述受试者患有在发病机理中RAP型分子发挥作用的细菌导致的细菌感染或对所述感染易感。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的物种是葡萄球菌的任何物种。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于进一步包括用所述的RIP或RIP衍生物涂覆器械的步骤。
13.一种预防或治疗任何细菌感染导致的感染的方法，所述细菌感染由发病机理中TRAP发挥作用的任何细菌物种产生，包括给予受试者在其体内有效引起抗体反应量的TRAP型多肽，以预防或治疗在发病机理中TRAP型分子发挥作用的细菌物种导致的细菌感染。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述的TRAP型分子是YhgC。
全文摘要
本发明的特征在于治疗或预防某些细菌物种的感染导致的感染或疾病的方法和组合物，所述细菌物种具体包括在发病机理中RAP型和/或TRAP型分子发挥作用的细菌。这包括葡萄球菌物种。
文档编号A61K38/16GK1771052SQ200480009301
公开日2006年5月10日 申请日期2004年1月30日 优先权日2003年2月3日
发明者N·巴拉班 申请人:N·巴拉班