突变型Bik的抗肿瘤效果的制作方法

专利名称：突变型Bik的抗肿瘤效果的制作方法
技术领域：
本发明所属的领域是细胞生物学、分子生物学、肿瘤生物学和医学。本发明更具体地涉及不同形式的Bik，其包含对肿瘤治疗有效的抗细胞增殖和/或促凋亡活性。
背景技术：
Bik，也称nbk，是促凋亡的仅含BH3(BH3-only)的蛋白质中的一种，它只具有一个Bcl-2同源区——BH3结构域，并在最近被认识到是凋亡所必需的起始因子(Han等，1996；Boyd等，1995)。在Bik基因所处的染色体22q上，信息等位基因的缺失可能与人类乳腺癌和结肠直肠癌的发展有关(Daniel等，1999)。该18-kDa的Bik蛋白与E1B 19K相互作用，并与不同的抗凋亡蛋白形成异二聚体，如Bcl-2和Bcl-XL，这一结合阻滞了抗凋亡蛋白的功能(Han等，1996)。Bik介导的凋亡需要BAX参与(Theodorakis等，2002)，而不依赖于p53(Han等，1996)。在应答生理性的由E1A引起的p53介导的死亡刺激时，Bik也是p53的下游凋亡效应因子(Bartke等，2001)。上调的Bcl-2在p53和Bik诱导的下游发挥功能，从而抑制E1A死亡途径，而E1A表达细胞的死亡或生存则由该细胞中抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bik的比例决定(Mathai等，2002)。此外，Bik能使肿瘤细胞对某些化疗药物敏化(Daniel等，1999)，且诱导凋亡的化疗药物中的一种--阿霉素(doxorubicin)是由Bik基因介导的(Panaretakis等，2002)。所有这些研究表明Bik是一种以人类癌症为靶向的有效治疗基因。
仅含BH3的蛋白质在它们的表达模式和活化模式上有所区别，许多仅含BH3的蛋白质的活化需要翻译后修饰(Puthalakath和Strasse，2002)。Bik是活性可被磷酸化作用调控的仅含BH3的蛋白质中的一种(Verma等，2000)。Verma等证实Bik是以磷蛋白的形式存在，并在苏氨酸33和丝氨酸35残基处被磷酸化，它们所决定的是全部实现Bik的凋亡活性所需的，这一活性可能是通过酪蛋白激酶II相关酶实现的。即，Verma等将苏氨酸和丝氨酸残基磷酸化位点突变成为丙氨酸残基，结果导致了Bik凋亡活性的下降。他们由此断定Bik的促凋亡能力需要磷酸化过程，而该磷酸化是通过并不显著影响其与Bcl-2的亲和的目前尚未知的机制进行。
发明概况本发明提供新颖的治疗性的Bik突变体组合物和方法，具体而言是治疗癌症，且熟练的技术人员公认在对抗癌症的方法库中添加任何一种方法都是有益于公众健康的。
本发明涉及与Bik突变体相关的系统和方法，且具体涉及其抗肿瘤效果。Bik是Bcl-2蛋白质家族中的一个促凋亡成员。在本发明中，发明人证实其新发现非野生型形式的Bik，例如突变型，无论在体内或体外都显示出强大的抗肿瘤活性。与Verma等的解释相比(2000)，去除了Bik上磷酸化位点的本文所述的模拟Bik突变体的多肽，仍然具有有效的抗肿瘤、抗细胞增殖和/或促凋亡活性，且在某些实施方案中，比野生型Bik更有效。也即，本发明所列的实施例显示通过编码突变bik多肽的多聚核苷酸的转染，可在不同人类癌症中诱导凋亡。这就提供了同样使用本发明的组合物(如治疗用)和方法，如将突变型Bik多聚核苷酸用于癌症的基因治疗，如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。
因此，本发明总体上涉及抑制癌症细胞和/或肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括将所述细胞与有效量的抑制增殖的突变型Bik多肽相接触。本文所指的突变型Bik多肽为一种具有抗细胞增殖、促凋亡和/或抗肿瘤活性的突变形式。增殖的抑制在代表性的实施方式中可以以下指标显示，如对某一细胞的凋亡诱导，如举例来说在细胞培养中对癌症细胞株的生长抑制、对肿瘤体积的减小和/或存活能力的提高。更佳的是，在某些实施方案中要抑制其增殖的细胞是有生命的生物体(例如人类)的细胞。这种转化的抑制在预防和/或治疗此类转化驱动的现象如癌症、肿瘤发生和/或转移中，具有很大的实用性。
突变型Bik多肽可通过许多为熟练技术人员所知的方式中的任何一种方式与细胞接触或导入细胞。突变型Bik多肽可通过直接导入突变型Bik多肽方式导入细胞。在这种情况下，该突变型Bik多肽可通过本领域所知的任何方法获得，虽然如所期望的，在体外将突变型Bik多肽导入细胞(例如在细胞培养体系中)可为获得突变Bik的较佳方法。
突变型Bik也同样可通过在细胞中导入编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸的方式导入细胞。例如，RNA或DNA编码的Bik可通过本领域所知的任何方式导入细胞。在某些较佳实施方式中，突变型Bik通过导入编码突变Bik的DNA片断的方式导入细胞。在某些这样的实施方式中，设想在该DNA片断中进一步将突变型Bik基因(或突变型Bik多聚核苷酸)与其相关的调控序列有效连接。例如，该Bik基因可与合适的启动子和合适的终止子序列有效连接。该基因/调控序列DNA构造的构建在本领域中众所周知。在具体实施方式
中，启动子选自下组CMV、端粒酶、TCF-4或VEGF。然而，在具体实施方式
中，其构造所包含的启动子是组织特异性的，如举例而言，对癌症的组织特异性，包括典型的乳腺癌、前列腺癌或胰腺癌。
在进行导入的某些实施方式中，该DNA片断可位于载体上，例如质粒载体或病毒载体。所述病毒载体可以是，例如，选自下组逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒和腺相关病毒。如此的DNA片断可用于本发明相关的不同方法。在本发明的一个基因治疗实施方式中，该载体可用于将突变型Bik基因传递到细胞中。同样，该载体也可用于转化培养的细胞，而此类培养的细胞可用于，特别是，突变型Bik在体外的表达。
本发明对各种类型的癌症均有效，这是由于如本文的代表性实施方式中，突变型Bik能不受癌细胞存活策略的影响而杀死它们，这些存活策略为许多癌细胞所采用，如生长因子受体和AKT途径。在某一具体实施方式
中，突变型Bik对实体瘤有效，如举例来说，肉瘤、肺、脑、前列腺、乳腺、卵巢、胰腺、肝、膀胱、肠胃的癌症，以及恶性的血液肿瘤，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在代表性实施方式中，本发明对具以下特征的癌症有效雌激素受体阳性、EGF受体过表达、Her2/neu过表达、Her-2/neu非过表达、Akt过表达、雄性激素依赖或非雄性激素依赖。即，突变型Bik对癌细胞有效，且不受癌细胞的癌基因过表达状态的影响，如Her-2/neu、EGFR、AKT，或不受癌细胞的生长是否激素依赖的影响(例如，MCF-7依赖或非PC3依赖)。
例如，在本文中包含显示突变型Bik抗细胞株试验结果的具体数据，该试验至少由六种代表类型的癌细胞或血管生成(angiogenic)细胞，包括1)乳腺癌，如MCF-7(雌激素受体阳性)、MDA-MB-468(EGF受体过表达)和MDA-MB-231；2)内皮细胞，如人脐带血管内皮细胞(Human Umbilical Vascular Endothelials，HUVEC)，其显示突变型Bik的抗血管生成效果；3)头颈癌，如TU138和TU167；4)黑色素瘤，如B16F10；5)卵巢癌，如SKOV-ipl(Her-2/neu过表达)、SKOV(非Her-2/neu过表达)和2774(Akt过表达)；以及6)前列腺癌，如PC3(非雄性激素依赖性生长)。
在
具体实施例方式
中，突变型Bik所导入的细胞为人类细胞。在许多实施方式中所述的细胞为肿瘤细胞。在某些目前较佳的实施方式中，所述的肿瘤细胞为乳腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞或胰腺肿瘤细胞。然而，突变型Bik可导入其它细胞，包括但不限于膀胱癌细胞、睾丸癌细胞、结肠癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞、脑癌细胞、白血病细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、或头颈癌细胞。在某些实施方式中，所述突变型Bik组合物通过注射导入。在具体实施方式
中，所述突变型Bik组合物包含于脂质体中。
在本发明的某些实施方式中，发明人发现能抑制增殖的Bik突变体，可与其它抗转化/抗癌治疗联合使用。这些治疗可为在进行本申请时就已知的方法，或可为在本申请之后形成的方法。Bik突变体可与如下的其它治疗联合使用如治疗用多肽、编码其它治疗用多肽的多聚核苷酸、化疗药物、手术方法或放疗。例如，突变型Bik可与其它已知的多肽联合使用，如TNFα或p53。其它多肽凋亡诱导物也可与Bik联合使用，包括但不限于，p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad和ICE-CED3蛋白酶。
突变型Bik可与任何适合的化疗药物联合使用。在某一代表性的实施方式中，所述化疗药物为紫杉酚(taxol)。突变型Bik也可与放疗相结合。构成化疗的电离辐射的类型可选自下组x-射线、γ-射线和微波。在某些实施方式中，所述电离辐射可通过外束辐射或给予放射性核素进行递送。突变型Bik同样也可与其它基因治疗方式相结合。在具体实施方式
中，所述的突变型Bik被导入肿瘤中。所述肿瘤可以是在动物中的，具体的是在人体中。
本发明的Bik突变体基因产品和多聚核苷酸可同样以合适的方法导入。导入的“合适方法”指将突变型Bik基因产品置于一定部位以降低肿瘤细胞增殖的方法。例如，可用注射、口服和喷雾方法，由在给定条件下能够确定适宜导入方法的熟练技术人员实施。在某些采用注射方法的实施方式中，所述的注射可以为静脉内、腹腔内、肌内、皮下、肿瘤内、胸膜内注射，或其它任何适宜的形式。
在本发明的某些其它方面中，提供了具有合适容器的治疗药盒，其包括突变型Bik基因产品或编码突变型Bik基因产品的多聚核苷酸的药学制剂。该药盒还可包括治疗用多肽、编码治疗用多肽的多聚核苷酸和/或化疗药物的药学制剂。
本文中所用的术语“突变型Bik”指来源于任何生物体的Bik多聚核苷酸或多肽，包括诸多的突变型Bik，其具有抗肿瘤活性、抗细胞增殖活性和/或促凋亡活性，其中的突变型Bik与天然Bik相比，至少含有一个改变了的氨基酸或的编码这些氨基酸的相应多聚核苷酸。该替代可包含经修饰的氨基酸，如含有附加的乙酰基的氨基酸，例如，或该改变可在至少一个具体的氨基酸位点上包含至少一个替代氨基酸。在具体实施方式
中，所述突变型Bik在至少一个氨基酸上包含至少一个替代，但仍保留抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的结合效果，从而有效达到本文所述的目的。在某些情况下，突变型Bik较天然Bik显示出更佳的抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的结合效果。在其它条件下，突变型Bik可具有与天然Bik类似的抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的结合效果。在其它情况下，突变型Bik较天然Bik具有降低的抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的结合效果。当然，一个或多个相关活性大大低于天然Bik或其它突变型Biks相应的相关活性的大部分突变体，在本发明的所有实施方式中将不被采用。然而，本领域中的熟练技术人员，由于其学习了本领域的技术条件和专业知识，能够选择出对于本发明的某些具体实施方式
具实用性的突变体。
所述抗肿瘤活性、抗细胞增殖活性和/或促凋亡活性可对除获得该突变型Bik的生物体以外的其它生物体有效。例如，在本文中的代表性实施方式中使用了人Bik，而鼠的Bik也可在人类治疗中替代使用或补充使用。从任何生物体中获得的突变型Bik可在任何氨基酸位点替代。此外，人Bik可在具体残基处发生突变并被发现治疗有效，而具有相似残基替代的鼠突变型Bik也可有效。在某一具体实施方式
中，鼠Bik多肽包含至少一个磷酸化位点的变化，而基于本文提供的对人Bik的相关说明，本领域的熟练技术人员可知晓如何在鼠Bik中引起类似的变化。在另一具体的实施方式中，突变型鼠Bik在其丝氨酸27、苏氨酸29、丝氨酸31和/或这些位点的组合位点上发生替代。
当然，Bik可由于其它任何原因发生突变，而本领域的熟练技术人员也都知道到在Bik多肽或编码Bik多肽的多聚核苷酸中，除了以改变磷酸化位点为目的和/或影响或保持抗肿瘤活性、抗细胞增殖活性和/或促凋亡活性为目的所需产生突变之外，还可出于的其它目的产生突变。例如，可为使得Bik多聚核苷酸和/或多肽更适合于治疗目的而进行突变。例如，可进行如下目的的修饰降低多肽的抗原性、去除部分多肽区域、增强多肽的核定位性、延长多肽的半衰期等。
本文至少在实施例中描述了至少一种用以比较具体突变体和野生型效果的测定试验，也可采用其它本领域的试验。在具体实施方式
中，至少有一种活性大大低于天然Bik的突变体不是所需要的，并不包含在本发明的范围中。
具体地说，本发明涉及与Bik具体突变形式相关的方法和组合物，该Bik具体突变形式与细胞生长、存活或增殖的调控相关。在具体的实施方式中，细胞生长的调控有助于癌症或再狭窄的治疗。具体而言，本发明教导熟练的技术人员由于突变型Bik多肽含有一或多个氨基酸替代，致使其多肽链不能被磷酸化或以低水平被磷酸化，此类突变型Bik多肽在抗肿瘤应用中有效。在具体实施方式
中，发明人已表明突变型Bik能降低或废除磷酸化，从而导致用该突变型Bik处理过的转化细胞的生长受到抑制。在具体实施方式
中，例如，以Asp或Glu替代，致使该多肽在那些位点不能磷酸化，并导致用该突变型Bik处理过的转化细胞的生长受到抑制。当然，本发明不局限于替代氨基酸为Asp或Glu的实施方式。而是，可以抑制Bik磷酸化的以任意氨基酸替代任一氨基酸的替代都在本发明的考虑范围内。在某一实施方式中，用于替代Thr33和/或Ser35的氨基酸不为丙氨酸。在另一实施方式中，至少一个替代氨基酸具有至少一个酸性性质，例如，该氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。因此，本发明的一个目的涉及Bik多肽上的至少一种修饰，该修饰使得该多肽不能被磷酸化，并且优选地是所得的Bik突变体具有抗细胞增殖能力、抗肿瘤能力、促凋亡能力或这些能力的组合。
本领域的技术人员可认识到在类似的氨基酸或非类似氨基酸上的突变，可以发生在Bik的其它位点上，且这些突变体中的某一些将具有如本文提供的代表性实施方式中所述的相同活性。例如，Bik中任何位点上的苏氨酸、丝氨酸或其他适当的氨基酸均可被替代，如用代表性的天冬氨酸或谷氨酸加以替代。熟练的技术人员知道公众可获得的提供Bik序列(用以改造使其不同于天然Bik)的数据库，如国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的GenBank数据库或商业数据库如Celera Genomics公司(Rockville，MD)的数据库。代表性的多肽Bik序列包括(以其GenBank编号表示)SEQ ID NO3(AAC50413、NP~001188、AAF01156、AAC79124、CAA62013和S58214)以及SEQ ID NO4(AAC40079和Nu031572)。代表性的多聚核苷酸Bik序列包括(以其GenBank编号表示)SEQ ID NO5(AY245248)和SEQ ID NO6(NM~001197)。
因此，本发明提供了有关在Bik中形成不同突变的指导，因此，本发明涉及一种关于细胞生长调控整个领域的新进展，该领域包括细胞增殖的抑制和/或细胞死亡的易化。在某一实施方式中，所述细胞增殖的抑制包括其增殖率的延迟、增殖总细胞数的延迟或包括上述两者。
熟练的技术人员可认识到Bik多肽内的任何位点都可被修饰，从而产生如本文所述的这些组合物，且更进一步的是可进行多位点修饰。熟练的技术人员可认识到在约160个氨基酸的Bik多肽(取决于组织)上，只存在有限数量的可修饰位点。此外，熟练的技术人员可认识到仅可对其中的20种标准氨基酸进行修饰，而本文所提供的指导即涉及实现这些修饰的方法。进一步而言，基于本文所提供的指导和本领域的其他方法，受本发明指导的熟练的技术人员可以知道如何测试抗肿瘤、抗细胞生长和/或促凋亡效果，并从而使本领域的熟练技术人员不会采用不恰当的试验方法测试某一具体的修饰。
因此，基于本文所提供的指导，本发明涉及引起细胞增殖抑制或细胞存活提高抑制的Bik突变多肽。在具体实施方式
中，本发明涉及的突变体包括，例如，Bik T33D、S35D和T33DS35D双突变。
依照本发明的目标，本发明包含一种含突变型Bik多肽的组合物。例如，含有一个氨基酸替代的组合物。在某一实施方式中，在本应造成未替代Bik多肽磷酸化的条件下，该替代阻碍Bik多肽的磷酸化。在其它具体实施方式
中，该替代为Thr33置换为Asp33或Ser35置换为Asp35，或两者皆是。在其它具体实施方式
中，该组合物进一步被定义为含有分散于药学可接受的赋形剂中的Bik多肽的组合物。在附加的具体实施方式
中，该组合物被置于药盒的合适包装中。
在本发明的另一目的中，本发明包含一种防止个体中细胞生长的方法，该方法包括给该个体施用突变型Bik多肽这一步骤。在另一具体实施方式
中，该多肽的给药是通过脂质体进行的。在某一附加的具体实施方式
中，该多肽进一步含有蛋白质转导域，如HIV Tat或穿透因子(penetratin)。
在本发明的另一目的中，本发明包含一种防止个体中细胞生长的方法，该方法包含给该个体施用编码突变型Bik多肽的核酸这一步骤。在另一具体实施方式
中，该核酸的给药是通过选自下组的载体进行的质粒、反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、脂质体以及它们的组合。
在本发明的其它目的中，本发明包含一种使用突变型Bik多肽组合物的方法，其中该Bik多肽组合物分散于药学上可接受的赋形剂中，且其中该组合物施用给患有增殖细胞失调的动物。
在本发明的另一目的中，本发明包含一种治疗增殖细胞失调个体的方法，其中包括给该个体施用突变型Bik多肽这一步骤。在另一具体实施方式
中，所述的增殖细胞失调指癌症。在更具体的实施方式中，所述增殖细胞失调指再狭窄。在更具体的实施方式中，所述癌症指乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
在本发明的其它目的中，本发明包含一种处理细胞的方法，其中包含将该细胞与突变型Bik多肽接触。在某一具体实施方式
中，所述细胞是人类细胞。在另一具体实施方式
中，所述细胞包含于某种动物体内。在更具体的实施方式中，所述动物为人类。在更具体的实施方式中，所述人类具有增殖细胞失调。在一附加的具体实施方式
中，所述增殖细胞失调指癌症。在进一步具体的实施方式中，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌。在另一具体实施方式
中，所述增殖细胞失调指再狭窄。
在本发明进一步的目的中，编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸是由组织特异性启动子调控的，如靶向癌组织的启动子。虽然任何启动子对癌组织的靶向性均优于非癌组织，在某一具体实施方式
中所述的癌特异性启动子是，例如，乳腺癌特异性的启动子、前列腺癌特异性启动子、或胰腺特异性启动子。
在某一
具体实施例方式
中，乳腺癌特异性启动子包含乳腺癌特异性序列，而在进一步的实施方式中，包含一段能提高该组织特异性序列表达(如表达水平)的增强子序列。在某一具体实施方式
中，将CMV启动子增强子序列与乳腺癌特异性片段相连，该片段来自于代表性的拓扑异构酶IIα(topoisomerase IIα，topoIIα)启动子或代表性的转铁蛋白受体启动子。它们对基因靶向有效，能够靶向并治疗原发性和转移性的乳腺癌，而对正常组织的毒性较低。
在另一实施方式中，编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸的表达由胰腺癌特异性启动子调控。在某一具体实施方式
中，采用了一种新颖的胰腺癌特异性启动子，如本文中的一个称为CTP的启动子，其至少含有最小的胰酶分泌素A受体(Cholecystokinin A receptor，CCKAR，-726至+1核苷酸)、两步转录系统序列和土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus，WPRE)的翻译后调控元件。这一工程化的构建体具有强启动子活性，并在体内、外显示对胰腺癌细胞表达突变型Bik的特异性。
在本发明的另一具体实施方式
中，前列腺癌特异性启动子调控编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸的表达。在具体实施方式
中，本发明采用了一种新颖的前列腺癌特异性启动子，如本文称为ATTP的启动子，其至少含有最小的人端粒酶反转录酶启动子(hTert)、土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的翻译后调控元件和ARR2控制序列，其可响应雄性激素的刺激。这一工程化的构建体具有强启动子活性，并在体外对雄性激素依赖和非雄性激素依赖的前列腺癌细胞显示出特异性。这一启动子能用于特异性地驱动体内前列腺癌细胞中突变型Bik的基因表达。
上文已列出了十分广泛的本发明的特征和技术优势，以使下述本发明的详细说明能被更好地理解。本发明的其它特征和优点将在下文中阐述，其构成了本发明权利要求的主题。本领域的熟练技术人员应当理解，本文所揭示的概念和具体实施方式
，可方便地用作修饰或设计其它结构的基础，而与本发明达到相同的目的。本领域的技术人员还应意识到这些等价的构建体并不脱离如所附权利要求列出的本发明的精神和范围。认为是本发明特性的新颖性特征(有关其组成和实施方法)与进一步的目的和优点将从下面的阐述并结合附图，得到更好的理解。然而，应该清楚地理解到各附图是仅出于阐明和说明的目的给出，而并不试图定义本发明的限制范围。
附图简要说明为了更全面地理解本发明，在下文结合附图进行参考说明。


图1A到1F表明Bik突变体的表达在不同的人类癌细胞系中显示出更强的生长抑制效果。
图2表明Bik突变体在不同的人类癌细胞系中显示出更强的细胞杀伤效果。
图3表明Bik突变体在不同的人类癌细胞系中显示出很强的细胞杀伤。
图4A到4B表明了Bik突变体在离体试验中表现出更强的肿瘤抑制效果。
图5A到5B证明SN递送的突变型Bik基因显著抑制人类肿瘤在小鼠体内的生长。
图6A和6B显示代表性的Bik突变体(BikDD)多聚核苷酸出对肿瘤生长显示出明显的抑制作用并在乳腺癌原位模型中提高存活率。在图6A中，每周测量并记录肿瘤体积。图6B显示BikDD提高了MDA-MB-231原位肿瘤的荷瘤小鼠的存活率。
图7A和7B表明Bik突变体(BikDD)基因对肿瘤生长表现出明显的抑制作用，并可提高乳腺癌原位模型的存活率。图7A显示每周测量并记录肿瘤体积。图7B表明BikDD可以提高MDA-MB-231原位肿瘤荷瘤小鼠的存活率。
图8表明用Bik突变体(BikDD)进行基因治疗可以提高卵巢癌原位模型中小鼠的存活率。
图9说明用Bik突变体(BikDD)进行基因治疗可以提高胰腺癌原位模型中小鼠的存活率。
图10显示CT90BikDD和CMV-BikDD在不同细胞系中的体外杀伤实验。Y轴数值表示处理后有活力细胞的百分比。
图11显示CT90-BikDD基因治疗的体内抗肿瘤效果。每只小鼠接种2.5×106个乳腺癌细胞系MDA-MB-231，并每周用脂质体复合的CTO-BikDD、CMV-BikDD、空白载体pGL3处理一次，右旋糖缓冲液D5W作为未处理对照。处理期间每周2次测量肿瘤大小(Y轴数值)，列于图中。X轴表示处理日期。
图12A-12E显示CT90-BikDD乳腺癌靶向性基因治疗在代表性原位小鼠模型中的治疗效果。图12A表明脂质体复合的CT90-BikDD在原位小鼠模型中靶向到乳腺癌细胞系中。图12B和12D中显示了基因治疗处理过程中的肿瘤大小记录，其中小鼠每周接受一次治疗(QW，图12B)或每周接受两次治疗(BIW，图12D)。
图13说明Bik-DD在MDA-MB-468异种移植小鼠中的基因治疗。
发明详述如本说明书中所用，“一(a)”或“一个(an)”可意为一个或者多个。如本发明的权利要求中所用，当与“包含(comprising)”连用时，“一”或“一个”可意为一个或者多于一个。如本文所用，“另一(another)”可意为至少第二个或者更多。
本发明涉及突变型Bik多肽及其编码核酸，并涉及突变型Bik的使用方法。因此，在代表性的实施方式中，本发明者将苏氨酸33和丝氨酸35残基改变为天冬氨酸，构成潜在的组成型活性形式，这些Bik突变体作为治疗药物用于癌症的基因治疗中。尽管先前的发明者们已论证了系统化给药的非病毒基因递送系统(SN)-Bik显著地抑制了移植到裸鼠体内的人乳腺癌细胞的生长和扩散，并延长了受试动物的寿限(Zou等，2002)，如本文所述，与野生型Bik相比，Bik突变体同样可在体外和体内模型中增强Bik基因产物的抗肿瘤功能。
本发明涉及促凋亡Bik多聚核苷酸的变异形式，其作为肿瘤抑制基因用于治疗人类卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌及其它癌症。在某些实施方式中，采用了如病毒或者非病毒的递送系统将其导入合适的受体动物以抑制肿瘤生长和发展。在本发明的一个代表性实施方式中，递送的Bik突变体通过凋亡机制抑制肿瘤生长和发展。由此，本文中发明者阐明了Bik变异体发挥很强的抗肿瘤活性，且作用方式类似于典型的肿瘤抑制物。
Bik最初被鉴定为是一种与EiB 19K和Bcl-2相互作用的、仅有BH-3域的蛋白质。在人乳腺癌的裸鼠模型中，系统化地施用Bik可显著抑制肿瘤生长和扩散。近来，报道了翻译后磷酸化可调节Bik的促凋亡能力。在此，本发明者阐明在多种人类癌症细胞中，Bik突变体较野生型(wt)Bik具有更强的抑制细胞增殖和增强凋亡诱导的效果。本发明者也阐明了在小鼠体外模型中，Bik突变体能抑制肿瘤生成和降低肿瘤形成速率。最后，发明者阐明了在小鼠体内模型中，Bik突变体-SN脂质体能抑制小鼠体内的肿瘤生长并延长其寿限。由此，本发明提供了突变型Bik基因产物以及编码其的多聚核苷酸，它们较野生型Bik对诱导细胞死亡更有效。
生成了代表性的Bik突变体，Bik-T33D(苏氨酸33替代为天冬氨酸)、Bik-S35D(丝氨酸35替代为天冬氨酸)和Bik-T33DS35D(苏氨酸33和丝氨酸35均替代为天冬氨酸)。在本发明的优选实施方式中，这些突变体选择性地抑制癌细胞生长，且同时较佳地为比野生型Bik具有更好的抗癌效果的制剂。在其它实施方式中，突变型Bik抑制其它细胞增殖，并对治疗再狭窄或抑制血管生成有作用。本领域的熟练技术人员在本说明书的指导下，可生成其它代表性的Bik多肽突变体。
熟练的技术人员认识到许多Bik核酸和多肽序列可用于本发明。熟练的技术人员明白现有公开的数据库可以提供这些序列，如国家生物技术信息中心的GenBank数据库，或现有商业数据库如来自Celera基因组公司。(Rockville，MD)。代表性的多肽序列包括(以其GenBank编号表示)SEQ ID NO3(AAC50413、NP_001188、AAF01156、AAC79124、CAA62013和S58214)和SEQ IDNO4(AAC40079)。代表性的多聚核苷酸序列包括(以其GenBank编号表示)SEQID NO5(AY245248)和SEQ ID NO6(NM_001197)。
在
具体实施例方式
中，Bik多肽包含至少下列域之一BH3域(例如，ALRLACIGDEMD；SEQ ID NO10)、至少一个E1B 19K作用域(例如，LRLACIGDEMDV；SEQ ID NO11)、至少一个Bcl-2作用域(例如，ALALRLACIGDEMPVSLR；SEQ ID NO12)和/或至少一个异二聚化域(例如，LALRLACIGDEMDVSLRA；SEQ ID NO13)，如与不同抗凋亡蛋白质例如Bcl-2和Bcl-XL形成异二聚、和/或一个跨膜域(例如，EQVLLALLLLLALLLPLLSGGLHLLLK；SEQID NO14)，且至少某些域可以重叠。尽管在选择性实施方式中Bik可包含一个或者多个功能磷酸化位点，在具体实施方式
中，Bik多肽包含在特定氨基酸上不含有实质功能的的磷酸化位点。如本文所用的术语“不含有实质功能的磷酸化位点”意为多数Bik分子在一个或多个可被磷酸化的特定氨基酸上失去磷酸化能力。在具体实施方式
中，所讨论的磷酸化位点包括Thr33和Ser35。熟练的技术人员知道如何测定磷酸化能力，如提供针对所讨论的磷酸化或者非磷酸化形式的Bik的特异性抗体。在一些实施方式中，熟练的技术人员也可以用双向凝胶电泳或者质谱来确定这些残基的磷酸化。
熟练的技术人员应当知道Bik的突变体，如代表性的BikT33D(苏氨酸33改变为天冬氨酸)(SEQ ID NO7)、BikS35D(丝氨酸35改变为天冬氨酸)(SEQ IDNO8)和Bik T33DS35D(苏氨酸33和丝氨酸35均改变为天冬氨酸)(SEQ IDNO9)，可以通过多种方式生成。在具体的实施方式中，对一段如上所述的核酸序列例如，SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6，至少在其编码需要改变的特定氨基酸的密码子处产生突变，如编码第33个残基苏氨酸突变成编码天冬氨酸等等。表1列举了所有标准氨基酸的密码子，熟练的技术人员应当很清楚如何对初始核酸进行操作以生成所需要的突变体，例如采用标准的定点诱变技术。
在本发明的实施方式中，Bik野生型基因产物在自然条件下被磷酸化。发明者特别在本文中显示，突变型Bik例如一个或者多个包含编码T33残基和/或S35残基的突变，尽管失去了磷酸化能力，该突变型Bik基因产物同样具有抑制细胞生长和/或促凋亡活性。熟练的技术人员知道可以改变T33和/或S35残基以阻止磷酸化。例如可以通过改变编码它的核酸密码子来改变T33氨基酸残基，如采用定点突变。或者，T33和/或S35氨基酸也可用至少一种阻止磷酸化的化合物进行封闭，例如采用封闭剂诸如甲二酰胺(carbodiamide)和/或在三氟乙酸中用乙酰氯对残基进行乙酰化。
熟练的技术人员知道Thr33和/或Ser35的替代可阻止Bik多肽在非取代Bik多肽发生磷酸化的条件下被磷酸化，此外也知道本领域中确定这些条件的标准方法。
在本发明的一个方面，至少含有一个缺陷的磷酸化位点的突变型Bik多肽以组织特异性调控的多聚核苷酸方式给药。具体地，突变型Bik可以特异性地靶向到，例如，乳腺癌、胰腺癌或前列腺癌中表达。在本发明的某些方面，乳腺癌特异性启动子控制突变型Bik的表达。尽管发明者考虑到任何乳腺癌特异性控制序列，但在具体的实施方式中，突变型Bik的表达受到复合(嵌合)启动子的控制。可以使用的乳腺癌特异性启动子含有CMV启动子增强子序列，该序列与在拓扑异构酶IIα启动子(命名为CT90)或者转铁蛋白启动子(命名为CTR116)中的乳腺癌特异性片段相连。这两个嵌合启动子在乳腺癌细胞中选择性地驱动基因表达并且具有与CMV启动子相当的活性水平。在基因转移中使用CT90或CTR116嵌合启动子构建的突变型Bik来靶向并治疗原发和转移的乳腺癌，而对正常组织毒性较低，较好地选择性杀死乳腺癌细胞和/或显著降低乳腺肿瘤的生长和/或生长率。
在本发明的其它方面，前列腺癌特异性或胰腺癌特异性启动子控制突变型Bik的表达。虽然发明人考虑了任何相应的前列腺癌特异性或胰腺癌特异性启动子，在某一具体实施方式
中，分别采用了复合的前列腺前列腺癌特异性或胰腺癌特异性启动子。例如，该前列腺癌特异性启动子可包含一个ARR2调控序列，而胰腺癌特异性启动子可包含一个CCKAR调控序列。
用于调控编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸表达的任何启动子或调控序列可用作如增强表达和/或转录后加工的特定调控序列。特定的但具有代表性的序列包括增强子、两步转录放大系统、调控RNA聚腺苷酸化、半衰期以及诸如此类的调控元件，如WPRE，以及本领域中的其它序列。
在本发明的其它实施方式中有防止个体中细胞生长的方法，其包含给个体施用突变型Bik多肽。在具体实施方式
中，该多肽在脂质体中施用和/或该多肽进一步含有蛋白质转导域(Schwarze等，1999)，如HIV Tat或穿透因子(penetratin)。在另一实施方式中，突变型Bik以多聚核苷酸的形式给药，其中该多聚核苷酸含有在氨基酸水平产生修饰的改变，如通过定点诱变产生的改变。该修饰的Bik多聚核苷酸通过载体给药，如质粒、反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、脂质体或它们的组合。
在本发明的实施方式中也有处理细胞的方法，该方法包括将细胞与突变型Bik多肽接触。在具体实施方式
中，该细胞为人类细胞，该细胞包含于动物中和/或所述动物为人类。
本文考虑到本发明的组合物较佳地具有与细胞中的天然Bik多肽相似的活性，而该组合物可与天然Bik具有大致相同或比其更有效的抗癌症细胞效果。即，在某些实施方式中，本发明的范围涉及改变天然Bik多肽，并以与野生型Bik多肽相似的形式使用。在另一实施方式中，突变型Bik的形式(如区别于野生型序列)包含与天然Bik多肽的活性差异。
I.影响Bik基因产物和基因的定义和技术A.Bik基因产物和基因本文中使用的术语“突变Bik基因产物”和“突变型Bik”指氨基酸序列不同于天然Bik，但具有生物活性的蛋白质，即其能履行与天然Bik类似的活性。例如，它们较佳地具有促凋亡活性、抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性和/或因抗Bik而起的与抗Bik抗体的交叉反应性抗体活性。术语“Bik基因产物”包括Bik分子的类似物，其显示出与天然Bik至少一些相同的生物活性。此外，诱变领域的技术人员可了解到其它还未揭示或发明的类似物也可用于构建Bik类似物。
术语“Bik的突变形式”指与编码上述定义的Bik基因产物的DNA序列基本相同的任何DNA序列。该术语也指与该DNA序列一致的RNA或反义序列。“Bik基因”也可包括任何带有结合的控制序列的组合物。
在用于定义Bik氨基酸序列或Bik核酸序列时，术语“基本相同”表示具体的对象序列，例如，突变序列，其通过如以下的方式不同于天然Bik序列一或多个取代、缺失、增加及其组合，其网络效应是保留Bik蛋白的至少某些生物活性。或者，如果(a)该DNA相似序列来源于天然Bik基因的编码区；或(b)该DNA相似序列能在适度严格的条件下与(a)DNA序列杂交，且其编码具有生物活性的Bik；或(c)由于(a)或(b)所定义的DNA相似序列的遗传密码的简并而产生的DNA序列；那么，这样的DNA相似序列与本文所揭示的特定DNA序列“基本相同”。基本相同的相似蛋白质会与天然蛋白质对应序列的相似性超过80％。具有较低相似性但具有相当生物活性的序列，也被认为是等价物。为确定核酸序列，所有可编码基本相似的氨基酸序列的对象核酸序列均被认为是与参照核酸序列基本相似的，而不去考虑密码子序列的差异。
B.相似性百分比相似性百分比可通过例如下述的方式测定用GAP计算机程序比对序列信息(由威斯康星大学遗传学家计算机组，University of Wisconsin GeneticistComputer Group提供)。GAP程序采用了1970年由Needleman等提出，1981由Smith等改良的比对方法。概括地说，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)数除以两段序列中较短序列的总符号数。GAP程序的优选默认参数包括(1)核苷酸的统一比较矩阵(包括相同值为1，不相同值为0)，和Gribskov等，1986的加权比较矩阵，描述于Schwartz等，1979；(2)每个空格罚分3.0，和每个符号和每个空格额外罚分0.01；以及(3)未端空格不罚分。
II.核酸序列在某些实施方式中，本发明涉及到突变型Bik核酸、基因和基因产物的用途，如包含不同于已知Bik基因的序列的突变型Bik或与之相应的蛋白质。术语“基本上相同于Bik的序列”指该序列基本上对应于Bik基因的一部分，但有相对较少的碱基或氨基酸(不论是DNA或蛋白质)与Bik(或当所指为蛋白质时，其生物功能等价物)的有所不同。术语“生物功能等价物”是本领域熟知的，本文进一步有详细定义。因此，“基本上相同的”序列指具有约70％--80％、或更优地约81％--约90％、或甚至更优地约91％--约99％之间的氨基酸与Bik的氨基酸相同或功能上等价的序列。
本发明覆盖含功能上相等的密码子的突变型bik核酸。术语“功能上相等的密码子”在本文用于指编码相同氨基酸的密码子，如编码精氨酸或丝氨酸的6个密码子，也指编码生物学上相等的氨基酸的密码子(表1)。
也可理解到氨基酸和核酸序列可包含额外的残基，如额外的N-或C-末端氨基酸或5’或3’序列，只要该序列符合上述的标准(包括考虑到蛋白质表达时，其保留了该蛋白质的生物活性)，其仍然基本上是如本文所揭示的所述的一种序列。特别加到核酸序列上的末端序列，可以例如，包含编码区5’或3’部分两侧的各种非编码序列，或包含已知存在于基因内部的各种内部序列，即内含子。
本发明还包括与本说明书所述序列互补或基本互补的DNA片段的用途。“互补的”核酸序列是按照标准的Watson-Crick互补法则进行碱基配对的那些序列。在本文中，术语“互补序列”指，基本上互补的核酸序列，其可通过与上文所述相同的核酸比较进行评估，或可定义为如上所述的相对严格条件下能与所述核酸片段进行杂交的核酸序列。
C.生物功能等价物如上所述，可对Bik结构进行修饰或变化，且仍可获得具有相似或所需特性的分子。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可被其它氨基酸所替代，而该替代并不造成与其它结构互作结合能力的明显丧失，例如与EIB 19K或Bcl-2的互作结合。由于在许多实施方式中，相互作用能力和蛋白质的性质决定了蛋白质的生物功能活性，可在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列的替代(或者当然，编码其的表1 功能上相等的密码子

DNA序列的改变)，而获得了具有相似或甚至相反性质的蛋白质(如，拮抗相对于促进)。因此，发明人考虑可在突变型Bik蛋白质或多肽(或编码其的DNA)序列中进行各种改变，而不会导致它们的所需生物用途或活性的明显丧失。
本领域技术人员同样熟知的是，生物功能等价蛋白质或肽定义的本质是如下的概念即在该分子限定部分可进行有限数目的变化，而使所得的分子仍能具有可接受水平的等价生物活性。因此，本文中将生物功能等价的肽定义为那些其中某些氨基酸被替代而非大多数或所有氨基酸被替代的肽。根据本发明，可以十分简便地制备和使用多种含有不同替代的不同蛋白质/肽。
同样众所周知的是，某些残基对蛋白质或肽的生物或结构性能显得特别重要，如活性位点的残基，这类残基通常是不能互换的。
氨基酸替代，例如那些可用于修饰Bik的替代，通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性进行的，例如它们的疏水性、亲水性、所带电荷、大小等。氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型分析显示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有大致相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，在本文中定义为生物功能等价物。
在制造这类变化时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。根据各氨基酸的疏水性和电荷性质，对每种氨基酸均指定其亲水指数，分别为异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)、和精氨酸(-4.5)。
氨基酸亲水指数在赋予蛋白质相互反应生物功能中的重要性，在本领域中是普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982，纳入本文作参考)。已知某些氨基酸可替代具有相似亲水指数或分值的其它氨基酸，并仍能保留相似的生物活性。根据亲水性指数进行改变时，优选亲水指数在±2内的氨基酸进行替代，尤为优选那些在±1内的氨基酸进行替代，更尤为优选的是那些在±0.5内的氨基酸进行替代。
本领域中同样已知，可根据亲水性有效进行相似氨基酸的取代。纳入本文为参考的美国专利第4,554,101号阐明了，蛋白质的最大局部平均亲水性(受其毗邻氨基酸亲水性的支配)，与其免疫原性和抗原性相关，即蛋白质的生物性能。已知，一个氨基酸可取代另一个具有相似亲水值的氨基酸，且仍能获得生物学上等价的蛋白质。
如美国专利第4,554,101号中所详述，为氨基酸残基指定如下亲水性值精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0.+-0.1)、谷氨酸(+3.0±0.1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±0.1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。
根据相似亲水性值进行改变时，优选亲水性值在±2内的氨基酸进行替代，尤为优选那些在±1内的氨基酸进行替代，更尤为优选的是那些在±0.5内的氨基酸进行替代。
虽然讨论集中在因氨基酸变化而产生的功能上等价的多肽，可理解这些变化可以通过编码DNA的变化而实现；还要考虑到遗传密码子的简并性，及二个或多个密码子可编码同一个氨基酸。
III.基于核酸的表达系统本发明在某些实施方式中，采用了表达包含突变型Bik多聚核苷酸的系统。本文阐述了这些多聚核苷酸的具体代表性方面。
A.载体术语“载体”指用于运载的核酸分子，可将核酸序列插入该运载分子中，而将该核酸序列导入细胞，且该运载分子能在细胞中复制。核酸序列可以是“外源性的”，意味着它相对于载体所导入的细胞是异物，或者此核酸序列与细胞中某序列同源但其在宿主细胞核酸中的某一位置上是通常是没有的。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人造染色体(如YAC)。本领域技术人员能通过标准的重组技术(见Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，两者均作为参考纳入本文)熟练地构建载体。
术语“表达载体”指含有编码能被转录的基因产物至少一部分的核酸序列的载体。在某些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多肽或肽。而在其它情况下，这些序列不被翻译，例如在产生反义分子或核酶的情况下。表达载体可含有各种“调控序列”，指在特定宿主生物体中，对与之操作性连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的调控序列外，载体和表达载体可包含还具有其它功能的核酸序列，描述如下。
1.启动子和增强子“启动子”是一种调控序列，它是一种控制转录启动和转录速度的核酸序列区域。在某一具体实施例中，调控序列(如启动子)，调控表达该核酸序列的组织的组织特异性。启动子或调控序列可含有可以与调控蛋白和分子相结合的遗传元件，如结合RNA聚合酶和其它转录因子。短语“操作性位于(operativelypositioned)”、“操作性连接于(operatively linked)”、“在控制下(undercontrol)”和“在转录控制下(under transcriptional control)”指处在相对于核酸序列的正确功能位置和/或方向，以控制该核酸序列转录的启动和/或表达的启动子或其它调控序列。启动子可与或可不与“增强子”连接，增强子指参与核酸序列转录活化的顺式作用调控序列。
启动子可以天然地与某基因或序列相连，如可以通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5’非编码序列而得到。这种启动子可称为“内源性的”。相似地，增强子可以天然地与某核酸序列相连，位于该序列下游或上游。或者，可通过将编码核酸片段置于重组或异源性启动子的控制下而获益，重组或异源启动子指在天然情况下通常不与该核酸序列相连的启动子。重组或异源增强子也指在其天然情况下通常不与该核酸序列相连的增强子。这类启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，和从其它原核细胞、病毒或真核细胞分离得到的启动子或增强子；以及“天然不产生的”启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件和/或含有改变表达的突变。除了用合成方法产生启动子和增强子的核酸序列外，也可采用重组克隆技术和/或核酸扩增技术，包括PCRTM，与本文所述组合物结合(见美国专利4,683,202、5,928,906，分别纳入本文作参考)。另外，考虑也可采用能指导序列在核外细胞器，如线粒体、叶绿体等中转录和/或表达的调控序列。
当然，重要的是采用能有效指导DNA片段在被选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道蛋白质表达所用的启动子、增强子和细胞类型组合，例如，参见Sambrook等(1989)，纳入本文参考文献。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的、和/或能在适当条件下用于指导导入DNA片段高水平表达的，这样，在大规模生产重组蛋白和/或肽时具有优越性。该启动子可以是异源的或内源的。
表2列出了在本发明的背景中可以采用的几种元件/启动子，可用于调控基因表达。这一列表并不意味着涵盖了参与表达启动的所有可能元件，而仅是列出其中代表性的部分。表3提供了可诱导元件的例子，即是可响应特定刺激而活化的核酸序列区域。
表2 启动子和/或增强子



表3 可诱导元件


组织特异性启动子或元件的鉴定及其活性特征的表征试验，为本领域技术人员所熟知。此类区域的例子包括如人LIMK2基因(Nomoto等1999)、促生长素抑制素受体2基因(Kraus等，1998)、小鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠α2(XI)胶原(Tsumaki等，1998)、DIA多巴胺受体基因(Lee等，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等，1997)、或人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等，1996)。
用于调控突变型Bik表达的靶向和/或水平的组织特异性启动子可为内源性的野生型启动子、突变的启动子或合成的启动子，只要突变型Bik的表达能优选地保留在一或多个目的组织中(相对不是所需靶组织而言)。合成启动子可进一步定义为复合启动子，在本文中指至少由两个来源于不同内源和/或合成启动子的独立区域所组成的启动子，这两个独立区域操作性连接以调控突变型Bik的表达。在某一具体实施方式
中，该组织特异性指针对癌组织的特异性，而与之相反的是非癌组织。本文中的术语“癌组织”指至少含有一个癌细胞的组织。
a.乳腺癌症组织特异性启动子目前，在癌症基因治疗中所用的大部分启动子具有很强但对正常和肿瘤细胞无选择性的活性(如CMV和β-肌动蛋白启动子)。因此，在本发明的某些方面，将乳腺组织特异性启动子用于本发明，如用于调控Bik突变形式的表达，包括代表性的BikT33D、BikS35D和Bik T33DS35D突变体。在一具体的方面中，该乳腺组织特异性启动子为乳腺癌组织特异性启动子。这样，这一实施方式中所需的启动子特异性地在乳腺癌组织中靶向表达。
任何乳腺癌组织特异性启动子均可用于本发明，只要其优选地指导突变型Bik在乳腺癌组织中表达。能够指导突变型Bik在乳腺癌组织中表达的乳腺癌组织特异性启动子实例至少包括hALA、GLG、HK-II和HER2启动子(Anderson等，2000；Katabi等，1999；Lu等，2002；Maeda等，2001)。
在本发明的某一具体实施方式
中，使用了复合启动子，该复合启动子采用了拓朴异构酶IIα(topoIIα)或转铁蛋白受体(TfR)乳腺癌特异性调控序列。用例如SAGE分析和cDNA微阵列法确定该拓朴异构酶IIα(topoIIα)和转铁蛋白受体(TfR)的水平在乳腺癌中有所提高。本发明的发明人鉴别出了分别位于topollα和TfR启动子5’端的90碱基对的片段(SEQ ID NO26)和116碱基对的片段(SEQID NO27)，作为最小的乳腺癌特异性调控所需的序列。在具体实施方式
中，通过将这两段短启动子与一个增强子序列操作性连接，增强了启动子的活性，增强子为如巨细胞病毒(CMV)启动子增强子序列(SEQ ID NO25)；这些嵌合的启动子在本文中分别称为CT90和CTR116。全长的CT90启动子包含于SEQ ID NO37中，而全长CTR116启动子包含于SEQ ID NO38中。这些启动子在本文中有所阐述，而在题为《癌症特异性启动子》的美国临时专利申请第60/_＿＿＿号中有详细的特征描述(“Cancer-Specific Promoters”，其作者为Mien-ChieHung，Yan Li，Yong Wen，Chi-Ping Day，Kun-Ming Rau，Xiaoming Xie，ZhengLi等)，与本发明同时提交并全文引入本文作为参考。为了证明其在癌症基因治疗中的用途，本发明的发明人用CT90构建了DNA构建体，以驱动突变型Bik的表达。将这一构建体转染入细胞系后，其可选择性地杀死乳腺癌细胞。此外，本发明的发明人证明用代表性的非病毒递送系统通过静脉注射的方式给小鼠施用该构建体，其对小鼠内的乳腺癌肿瘤异种移植物具有抗肿瘤效果。这就表明CT90和CTR116可驱动治疗基因(如突变型Bik)在乳腺癌细胞中的选择性表达。
因此，本发明包含出于治疗目的，将乳腺癌特异性启动子用于调控突变型Bik靶向乳腺癌细胞的表达，其对正常细胞具有低毒性或无毒性。
b.胰腺癌组织特异性启动子胰腺特异性启动子可用于靶向突变型Bik的表达，包括代表性的BikT33D、BikS35D和Bik T33DS35D突变体。任何乳腺癌组织特异性启动子均可用于本发明，只要其优选地指导突变型Bik在胰腺癌组织中表达。指导突变型Bik在胰腺癌组织中表达的胰腺癌组织特异性启动子的例子包括胰岛素启动子，如大鼠胰岛素启动子(Wang等，2004)、中期因子(midkine)和环加氧酶-2启动子(Wesseling等，2001)以及癌胚抗原(CEA)启动子(Takeuchi等，2000)。
本发明的发明人开发了一种胰腺癌特异性启动子，在本文中对其有所阐述，而在题为《癌症特异性启动子》的美国临时专利申请第60/＿＿＿＿号中有详细的特征描述(“Cancer-Specific Promoters”，其作者为Mien-Chie Hung，YanLi，Yong Wen，Chi-Ping Day，Kun-Ming Rau，Xiaoming Xie，Zheng Li等)，与本发明同时提交并全文引入本文作为参考。该启动子含有胰酶分泌素A受体(CCKAR)启动子序列，具体地是将CCKAR启动子的nt-726到+1(SEQ ID NO28)区域与一个增强子(如CMV增强子)操作性地连接。然后将该CCKAR-CMV复合物用特定的两步转录放大(TSTA)系统改造(Iyer等，2001；Zhang等，2002；Sato等，2003以及其中所应用的文献)，如用代表性的GAL4-VP16或GAL4-VP2融合蛋白，以增强转录活性，且它也可与土拨鼠肝炎病毒后转录调控元件(WPRE)(SEQIDNO29)操作性地连接，以改变RNA多聚腺苷化信号、RNA出核和/或RNA翻译。熟练的技术人员可认识到术语“两步转录放大(TSTA)系统”也同样可称作“两步转录活化(TSTA)系统”或“重组转录活化途径”(Nettelbeck等，2000)。该CCAKAR-TSTA-WPRE(CTP)启动子被应用于某一具体的方面，而这种复合启动子的一个例子包含于SEQ ID NO34中。因此，该分子工程化的CTP启动子应用于用突变型Bik进行胰腺癌的基因治疗有效的治疗药征中。
c.前列腺癌组织特异性启动子前列腺癌组织特异性启动子可用于调控编码突变型Bik多聚核苷酸的表达。例如最近已开发出如PSA、probasin和hK2等前列腺特异性启动子。这些启动子的活化是雄性激素依赖性的。在多种疾病阶段中，患者是雄性激素依赖性(ADPC)的，这样就能采用雄性激素响应载体来指导治疗基因在前列腺组织中的表达。虽然本发明的发明者(Xie等，Cancer Res 2001)和其它组(Zhang等，MolEndocrinol 2000)已经开发出了响应雄性激素受体的强前列腺特异性启动子，然而在经过前列腺癌进行性治疗的主要药征——阉割治疗或雄性激素切除治疗后，这些雄性激素依赖性启动子的活性会降低。用含有这些启动子的组合物进行治疗的这些患者会对这种治疗不产生反应并死于复发的非雄性激素依赖性前列腺癌(AIPC)。
本发明人已开发了一类前列腺癌特异性启动子，预计其对ADPC和非雄性激素依赖性前列腺癌(AIPC)均有效，用以治疗转移性的和复发的激素不应性前列腺癌，具体地是调控突变型Bik的表达。该启动子在本文中有所阐述，而在题为《癌症特异性启动子》的美国临时专利申请第60/__＿＿＿号中有详细的特征描述(“Cancer-Specific Promoters”，其作者为，Mien-Chie Hung，Yan Li，Yong Wen，Chi-Ping Day，Kun-Ming Rau，Xiaoming Xie，Zheng Li等)，与本发明同时提交并全文引入本文作为参考。该启动子，在本文中称为ATTP，至少含有人端粒酶反转录酶(hTERT)(SEQ ID NO32)的最小启动子片段(hTERTp)以及与其操作性连接的两步转录放大(TSTA)系统，如代表性的GAL4-VP16或GAL4-VP2(GAL4-VP2的两个例子为SEQ ID NO30或SEQ ID NO33)融合蛋白编码序列，且其同样操作性地连接于土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)上，以改变RNA多聚腺苷化信号、RNA输出和/或RNA翻译。这些调控序列在ADPC和AIPC细胞系中均有效。已知在大多数情况下，复发的前列腺癌的AR基因发生扩增和/或AR过表达，该特定启动子大大提高了实施方式中的效果指数，其中该系统的活性是由雄性激素激发的。在优选的实施方式中，组织特异性区域至少含有，例如，来源于ARR2基因的ARR2调控元件(SEQ ID NO31)。在本发明的一个具体方面中，TSTA-hTERT-ARR2和WPRE元件用作前列腺癌特异性调控元件，其在具体实施方式
中包含于SEQ ID NO35中。因此，本发明的发明人已开发了新颖的前列腺癌特异性调控系统，其不仅能使突变型Bik靶向ADPC，还能使其靶向AIPC。
2.启动信号和内部核糖体结合位点编码序列的有效翻译还可能需要特异性启动信号。这些信号包括ATG启动密码子或毗连序列。可能需要提供外源性翻译调控信号包括ATG启动密码子。本领域普通技术人员不难确定这一点并提供必须的信号。已充分查明启动密码子必须是“框内”，即与所需编码序列同处读框内以保证整个插入物的翻译。外源性翻译控制信号和启动密码子可以是天然的或合成的。加入合适的转录增强子元件可提高表达率。
在本发明某些实施方式中，采用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多个基因或多顺反子信使。IRES元件能绕过5’甲基化加帽(Cap)依赖性翻译的核糖体扫描模式，在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已报道了小RNA病毒家族二成员(脊髓灰质炎和脑脊髓炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，及哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可将IRES元件连接到异源性开放读框内。可一起转录各自被IRES分开的多个开放读框，产生多顺反子信使。借助IRES元件各开放读框能进入核糖体得到有效翻译。采用一个启动子/增强子转录一个信使，能有效表达多个基因(见美国专利5,925,565和5,935,819，纳入本文作参考)。
3.多克隆位点载体可含有多个克隆位点(MCS)，该位点是含有多个限制性酶切位点的核酸区域，可采用任一区域与标准重组技术结合来消化该载体(见Carbonelli等，1999；Levenson等，1998；Cocea，1997，纳入本文作参考)。“限制性酶消化”指采用只在核酸分子特定位置起作用的酶催化切割核酸分子。可从市场上购买到许多这些限制性酶。这类酶的用途广为本领域技术人员所知。通常，采用能在MCS内切割的限制性酶使载体线性化或片段化，以保证外源序列连接入该载体。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键，二片段彼此可毗连或不毗连。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员所熟知的。
4.剪接位点大多数转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以去除原初转录物中的内含子。含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点，以确保转录物的正确加工而表达蛋白质(见Chandler等，1997纳入本文作参考)。
5.聚腺苷酸信号表达时，通常要有一聚腺苷酸信号来行使转录物的正确聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸信号的性质对成功实施本发明是关键性的，和/或可采用任何这类序列。优选例包括SV40聚腺苷酸信号和/或牛生长激素聚腺苷酸信号，能方便地和/或已知能在各种靶细胞中很好发挥功能的聚腺苷酸信号。还考虑可采用转录终止位点作为表达盒中的元件。这些元件的作用是提高信使水平和/或尽量减少从盒中通读到其它序列中。
6.复制起始位点为了在宿主细胞中扩增载体，其可含有一个或多个复制起始位点(常称为“ori”)，此位点是一种能启动复制的特定核酸序列。此外，如果宿主细胞是酵母菌，可采用自主复制序列(ARS)。
7.可选择性和可筛选性标记本发明某些实施方式中，可通过在表达载体中含有一标记，而在体外或体内鉴定含有本发明核酸结构的细胞。这种标记可赋予细胞一种可鉴定的变化，有易于鉴定含有该表达载体的细胞。通常，可选择标记是可使其被选择出来的标记。阳性选择标记是存在此标记时而得以选出的标记，而阴性可选择标记是该标记存在时阻止其选择的标记。阳性可选择标记的一个例子是抗药性标记。
通常包含药物选择性标记有助于转化子的克隆和鉴定，例如，能赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和组氨醇抗性的基因可用作可选择标记。除了能赋予表型而得以区分实施本发明而建立的转化子的标记外，也考虑其它类型的标记，包括诸如基于比色分析的GFP等可筛选标记。或者，可采用可筛选酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道可能在FACS分析时如何利用免疫标记。不认为所用标记很重要，只要其能与编码基因产物的核酸同时被表达。可选择和可筛选标记的其它例子是该领域技术人员熟知的。
B.宿主细胞术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”本文中可互换使用。所有这些术语也包括其子代，即任何和所有的后代。可理解所有子代由于故意或非故意的突变而不可能相同。在表达异源性核酸序列的段落中，“宿主细胞”指原核或真核细胞，包括能复制载体，和/或表达载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可以和已经被用作载体的受体。宿主细胞可被“转染”或“转化”，指外源性核酸转移到或导入到宿主细胞中的过程。转化细胞包括原代目标细胞及其子代。
宿主细胞可衍生自原核或真核细胞，取决于所需结果是该载体的复制，还是部分或全部表达载体编码的核酸序列。可购得许多细胞系和培养物用作宿主细胞，可从美国典型培养物收藏中心(ATCC)获得它们，ATCC是活培养物和基因材料档案保管服务机构(www.atcc.org)。本领域技术人员能根据载体的骨架和需要的结果确定合适的宿主。例如，可将质粒或粘粒导入原核宿主细胞复制出许多载体。可用作宿主细胞进行载体复制和/或表达的细菌细胞包括DH5α，JM109和KC8，以及许多可从市场购买到的细菌宿主，如SURE感受态细胞和SolopackTMGold细胞(Stratagene，La Jolla)。另外，细菌细胞如大肠杆菌LE392可用作噬菌体病毒的宿主细胞。
用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。本领域技术人员可购得和知道各种细胞类型的许多宿主细胞。相似地，病毒载体可用于真核或原核宿主细胞，特别是允许载体复制或表达的那些细胞。
某些载体可采用使其能在原核和真核二种细胞中均能复制和/或表达的调控序列。本领域技术人员还知道培养上述宿主细胞维持它们并使载体复制的条件。也了解和知道大规模生产载体及生产载体编码的核酸和它们的同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。
C.表达系统已存在含有上述至少部分或所有组成的许多表达系统。原核和/或真核系统可用于本发明来产生核酸序列，或它们的同源多肽、蛋白质和肽。许多这类系统可从市场和广泛来源购得。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生高水平异源核酸区段的蛋白质表达，见美国专利No.5,871,986；4,879,236所述，二者纳入本文参考，可从Invitrogen和BacPackTMBaculovirus Expression System From Clontech，以MaxBac2.0名称买到。
表达系统的其它例子包括Stratagene’s complete ControlTM的可诱导哺乳动物表达系统，其包括合成的蜕皮激素-可诱导受体，或其pET表达系统，一种大肠杆菌表达系统。可诱导表达系统的另一个例子可从Invitrogen购买到，它携带有T-RexTM(四环素调节的表达)系统，一种采用全长CMV启动子的可诱导哺乳动物表达系统。Invitrogen也提供酵母菌表达系统，称为毕赤嗜甲醇表达系统，设计用于在嗜甲醇毕赤酵母菌中高水平生产重组蛋白质。本领域技术人员知道怎样表达载体，如表达构建物来生产核酸序列或其同源的多肽、蛋白质或肽。
IV.核酸递送本发明诸方面的总体方法涉及上述组合物和/或治疗剂，其提供含有编码特定的和/或所需突变型Bik蛋白、多肽和肽的基因构建物，从而允许这些蛋白质、多肽或肽发挥所需要的活性。虽然认为该基因构建物和/或蛋白质可被直接输送，但优选实施方式包括向细胞提供特定和所需蛋白质、多肽和肽的编码核酸。这样提供后，细胞的转录和翻译机制能合成蛋白性组合物，及该表达构建物可提供的任何组分。提供反义物、核酶和其它抑制剂时，优选的方式也是向细胞提供编码该构建物的核酸。
在本发明某些实施方式中，可将编码该基因的核酸稳定整合入细胞的基因组中。其它实施方式中，此核酸可作为DNA的分离的游离体区段稳定维持在细胞中。这类核酸区段和“游离体”编码的序列在宿主细胞周期同步过程中，能充分保留和独立复制。表达构建物如何被输送给细胞，和/或在细胞中核酸如何保留取决于所用的表达构建物的类型。
A.利用病毒载体输送DNA某些病毒能感染细胞并通过受体介导的内吞机制进入细胞整合到宿主细胞基因组中，和/或稳定和/或有效地表达病毒基因，从而使它们成为外源基因转移到哺乳动物的有吸引力的候选者。本发明优选的基因治疗载体通常是病毒载体。
虽然某些病毒能接受异种遗传物质，但受到它们可容纳的核苷酸数量的限制，和/或它们可感染的细胞范围限制，已证明这些病毒成功地进行了基因表达。然而，腺病毒不能将其遗传物质整合入宿主基因组中，和/或因而基因表达不需要宿主复制机制，使其非常适合快速有效的异源基因表达。制备复制缺陷性感染病毒的技术是本领域熟知的。
当然，采用病毒输送系统，需要充分纯化病毒粒子，使其基本上没有不良污染物，如缺陷性干扰性病毒颗粒、内毒素和其它热原质，从而不会在接受该载体构建物的细胞、动物和个体中引起任何不良反应。纯化载体的优选方法包括采用浮力密度梯度离心，如氯化铯梯度离心。
1.腺病毒载体输送表达构建物的具体方法包括利用腺病毒表达载体。虽然已知腺病毒载体整合入基因组DNA的能力低，但这些载体赋予的高效基因转移抵消了此缺点。“腺病毒表达载体”意味着包括含有腺病毒序列的那些构建物，能(a)支持该构建物的包装和/或(b)能最终克隆到其中的组织和/或细胞特异性结构中表达。
该表达载体含有经基因工程改造形式的腺病毒。已知腺病毒的基因组成是36kb的线性双链DNA病毒，允许用长达7kb的外源序列置换腺病毒DNA的大片段(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，腺病毒感染宿主细胞不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以游离体方式复制而无潜在的基因毒性。还有，腺病毒结构上稳定，和/或大量扩增后未测到基因组重排。
腺病毒特别适合用作基因转运载体，因为其基因组大小适中，易操作，效价高，靶细胞范围广泛和/或感染力高。该病毒基因组二端含有100-200个碱基对的反向重复序列(ITR)，它们是病毒DNA复制和/或包装所必须的顺式元件。其基因组的早期(E)和/或晚期(L)区域含有受病毒DNA复制驱动的不同转录单位。其E1区(E1A和/或E1B)编码负责调节病毒基因组和/或几种细胞基因转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)表达导致合成病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质参与DNA复制、后期基因表达和/或宿主细胞关闭(Renan，1990)。后期基因的产物包括大多数病毒衣壳蛋白，只是在主要后期启动子(MLP)产生的一个原代转录物经过有效加工后才表达。在感染后期此MLP(位于16.8m.u.)特别有效，和/或此启动子产生的所有mRNA含有5’-三联前导(TPL)序列，使它们能优先翻译mRNA。
在此系统中，通过穿梭载体和前病毒载体之间的同源重组产生重组腺病毒。由于二个前病毒载体之间有可能重组，因此可产生野生型腺病毒。故从单一空斑分离单克隆病毒和/或检测其基因组结构很是重要。
产生和/或增殖复制缺陷性的此种腺病毒载体依赖于独特的辅助细胞系，称为293细胞系，产生自身Ad5 DNA片段转化的人胚肾细胞，能组成性表达E1蛋白质(E1A和/或E1B；Graham等，1977)。由于E3区不一定来自腺病毒基因组(Jones和Shenk，1978)，此腺病毒载体在293细胞帮助下能在E1区、D3区和二区中携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。最近已报道了在E4区中含有缺失的腺病毒载体(美国专利5,670,488，纳入本文作参考)。
实际上腺病毒可包装大约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等，1987)提供额外的大约2kbDNA容量。加上E1和/或E3区中可替代的大约5.5kbDNA，此腺病毒载体的最大容量在7.5kb，和/或该载体总长的大约15％。该载体骨架中保留了80％以上的腺病毒基因组。
辅助细胞系可衍生自人细胞，如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞和其它人胚胎间充质和上皮细胞。或者，辅助细胞可衍生自其它种类哺乳动物的允许人腺病毒(生长)的细胞。这类细胞包括，如Vero细胞和其它猴胚胎间充质和/或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。
最近，Racher等，(1995)公开了培养293细胞和/或增殖腺病毒3的改进方法。一种方式中，通过在含100-200ml培养液的1升硅化旋转瓶(Techne，Cambridge，UK)中接种单个细胞培养成天然细胞集落。以40rpm搅拌后用台酚兰估计细胞活力。另一方式中，如下采用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。细胞接种重悬于5ml培养液中，加入到250ml Erlenmeyer瓶的载体(50ml)中，和/或静置1-4小时，偶而搅动。用50ml新鲜培养液替换原培养液和/或摇动。为产生病毒，让细胞生长至80％汇合，然后更换培养液(至25％最终体积)和/或加入0.05 MOI的腺病毒。培养物静置过夜，然后体积增加到100％和/或再开始摇动72小时。
除了要求腺病毒载体是复制缺陷型和至少是条件缺陷型的之外，不认为腺病毒载体的性质对成功实施本发明是关键性的。腺病毒可以是已知的42种不同血清型和A-F亚组中的任何一种。优选亚组C的5型腺病毒作为起始材料，以获得用于本发明的条件性复制缺陷型腺病毒载体。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，已知道其大量的生化和遗传信息，并且历史上已被用于采用腺病毒作载体的大多数构建物中。
如上所述，本发明典型的载体是复制缺陷型的、不含有腺病毒的E1区。因此最方便的是在E1编码序列已被去除的部位导入转化结构。然而，该结构插入腺病毒序列中的部位对本发明不是关键的。可如Karlsson等，(1986)所述，将编码感兴趣基因的聚核苷酸插入E3取代载体中E3缺失区位置，辅助细胞系和辅助病毒则互补了E4缺失的E4区。
腺病毒的培养和/或操作是该领域技术人员知道的，其显示体外和体内有着广泛的宿主范围。使病毒可获得高效价，如每毫升109-1011空斑形成单位，它们具有高感染力。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主细胞基因组中。腺病毒输送的外源基因是游离体，因此对宿主细胞基因毒性低。接种野生型腺病毒的研究未见副作用报道(Couch等，1963；Top等，1971)，证明作为体内基因转运载体它们是安全的和/或有治疗潜力。
腺病毒载体已用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。最近，动物研究提示，重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991a；(Stratford-Perricaudet等，1991b；Rich等，1993)。将重组腺病毒给予不同组织，包括气管灌注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard，1993)和/或脑内定位接种(Le Gal La Salle等，1993)。重组腺病毒和腺病毒相关病毒(见下)能感染和转导非分裂性人原代细胞。
2.AAV载体腺病毒相关病毒(AAV)是用于本发明细胞转导的一种有吸引力的载体系统，因为它整合频率高，可感染非分裂细胞，使其可将基因输送到哺乳动物细胞中，例如组织培养物中(Muzyczka，1992)和体内。AAV感染性具有广泛宿主范围(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)。关于rAAV载体产生和用途的详述见美国专利No.5,139,941和/或4,797,368，各自纳入本文作参考。
证明AAV可用于基因输送的研究包括LaFace等，(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；Walsh等(1994)。重组AAV载体已成功用于体外和/或体内转导标记基因(Kaplitt等，1994；Lebkowski等，1988；Samulski等，1989；Yoder等，1994；Zhou等1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等，1985；McLaughlin等，1988)和涉及人类疾病的基因(Flotte等，1992；Luo等，1994；Ohi等，1990；Walsh等，1994；Wei等，1994)。最近AAV载体已批准用于治疗膀胱纤维变性的I期人体试验。
AAV是一种依赖性细小病毒，需要另一种病毒(或是腺病毒或疱疹病毒家族某成员)共感染才能在培养细胞中经历产毒性感染(Muzyczka，1992)。缺少辅助病毒共感染时，野生型AAV基因组通过其两末端整合入人染色体19中，在那儿以潜伏状态作为前病毒居留(Kotin等，1990；Samulski等，1991)。然而，rAAV整合不限于染色体19，除非AAV的Rep蛋白也表达(Shelling和Smith，1994)。当携带AAV前病毒的细胞加上辅助病毒感染时，可从该染色体和从重组质粒中“拯救”AAV基因组，和/或建立正常的产毒性感染(Samulski等，1989；McLaughlin等，1988；Kotin等，1990；Muzyczka，1992)。
通常，通过共转染含有侧接二个AAV末端重复序列的感兴趣基因的质粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；各自纳入本文作参考)和/或含有野生型AAV编码序列而无末端重复序列的表达质粒，如pIM45(McCarty等，1991；纳入本文作参考)。也用腺病毒和携带AAV辅助功能所需腺病毒基因的质粒感染和转染细胞。以此种方式制备的rAAV病毒贮藏液有腺病毒污染，必须用物理方法将其与rAAV颗粒分离(例如氯化铯密度离心)。或者，可采用含AAV编码区的腺病毒载体和含AAV编码区及某些和所有腺病毒辅助基因的细胞系(Yang等，1994；Clark等，1995)。也可采用携带rAAV DNA作为整合前病毒的细胞系(Flotte等，1995)。
3.逆转录病毒载体逆转录病毒作为基因输送载体具有应用前景，因为它们能将其基因整合入宿主基因组中，而转运大量的外源性遗传物质，能感染广谱的物种和细胞类型，并被包装在特定的细胞系中(Miller，1992)。
逆转录病毒是一组单链RNA病毒，特征是能通过逆转录过程在感染细胞中将其RNA转变成双链DNA(Coffin，1990)。产生的DNA然后稳定整合入细胞染色体中成为前病毒，和/或指导病毒蛋白质的合成。整合导致在受体细胞和/或其后代中保留该病毒的基因序列。逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白质、聚合酶和包膜组分的三个基因gag，pol和/或env。Gag基因上游的序列含有将其基因组包装到病毒粒子中的信号。在病毒基因组的5’和3’末端有两个长末端重复(LTR)序列。这些病毒含有的强启动子和增强子序列也是整合入宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。
为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入病毒基因组某些病毒序列处产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，需构建含gag，pol和env基因但无LTR的包装细胞系和包装组分(Mann等，1983)。当将含cDNA的重组质粒，与逆转录病毒LTR和包装序列一起导入(例如通过磷酸钙沉淀)此细胞系中时，包装序列能使重组质粒进行RNA转录并被包装成为病毒颗粒，然后分泌到培养液中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。收集含重组逆转录病毒的培养液，任选地浓缩，用于基因转运。逆转录病毒载体能感染广泛的各种细胞类型。然而，其整合和/或稳定表达需要宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。
与采用缺陷性逆转录病毒载体有关的是可能在包装细胞中出现野生型复制活性病毒。这可能是由于gag，pol env序列上游重组病毒插入物的完整序列整合入宿主细胞基因组中所致。然而，现已有新的包装细胞系可大大减少重组的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。
已报道了采用第二代逆转录病毒载体输送基因。Kasahara等(1994)制备了莫洛尼小鼠白血病病毒的工程改造变体，通常只能感染小鼠细胞，其包膜蛋白经过修饰，使该病毒能特异性结合和感染携带有红细胞生成素(EPO)受体的人细胞。这一点是通过将EPO序列的一部分插入包膜蛋白中而产生具有新结合特性的嵌合蛋白而实现的。
4.其它病毒载体可采用其它病毒载体作为本发明中的表达构建物。可采用衍生自病毒，如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、新德比斯病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的载体。对于各种哺乳动物细胞它们可赋予几种有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
随着最近发现的缺陷型乙肝病毒，对于不同病毒序列的结构-功能关系有了新的理解。体外研究显示，该病毒尽管其基因组缺失了80％以上，仍可保留辅助-依赖性包装和逆转录能力(Horwich等，1990)。这提示，其基因组的大部分可用外源遗传物质替代。Chang等最近将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因导入鸭乙肝病毒基因组的聚合酶、表面和/或pre-表面抗原编码序列位置。将其与野生型病毒共转染入禽肝细胞瘤细胞系中。用含有高效价重组病毒的培养液感染了原代鸭肝细胞。转染后至少24天中测到CAT基因的稳定表达。
某些其它实施方式中，基因疗法的载体是HSV。使HSV成为有吸引力的载体的因素是其基因组的大小和组成。因为HSV大，与其它较小病毒系统相比，加入多个基因和表达盒不成问题。此外，可得到具有不同性能(温度、强度等)的不同病毒控制序列，使其比其它系统能在更大程度上控制表达。还有一个优点是该病毒具有较少剪接的信使，易于遗传操作。HSV也较易操纵和/或可高效价生长。因此就获得足够MOI所需体积和重复剂量需要较少而言，输送问题不大。
5.修饰的病毒本发明其它实施方式中，待输送的核酸包含在经基因工程改造能表达特异性结合配体的感染性病毒中。因而该病毒颗粒能特异性结合靶细胞的同源受体，将其组分输送给细胞。依靠在病毒包膜上化学加入乳糖残基化学修饰逆转录病毒，最近设计开发了特异性靶向逆转录病毒载体的新方法。此种修饰可使该病毒通过唾液酸糖蛋白受体而特异性感染肝细胞。
设计了使重组逆转录病毒靶向的另一种方法，是采用抗逆转录病毒包膜蛋白和/或抗特异性细胞受体的生物素化抗体。该抗体用链霉亲和素经生物素组分偶联(Roux等，1989)。采用抗主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，他们证明可体外用亲嗜性病毒感染各种带有这些表面抗原的人细胞(Roux等，1989)。
B.DNA输送的其它方法本发明的不同实施方式中，将DNA作为表达构建物输送给细胞。为了有效表达基因构建物，必须将该表达构建物输送给细胞。如上所述，优选的输送方法是通过病毒感染，将表达构建物在感染性病毒颗粒中壳体化。然而，本发明也考虑用几种非病毒方法转运表达构建物到细胞中。本发明一实施方式中，表达构建物只由裸露重组DNA和/或质粒组成。该构建物的转运可采用物理和/或化学方法透过细胞膜进行。如下所述是一些可成功用于体内和/或活体外的方法。
C.脂质体介导的转染本发明另一实施方式中，可将表达构建物包裹在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和/或内部水性介质为特征的囊泡性结构。多层脂质体具有被水性介质分隔的多层脂质层。当将磷脂悬浮在过量水溶液中时可自发性形成脂质体。在形成封闭结构和/或包裹水份和/或将溶质溶解在脂质双层间之前，脂成分经历了自身重排(Ghosh和Bachhawat，1991)。也考虑表达构建物与脂转染胺(Lipofectamine，Gibco BRL)的复合物。
脂质体介导的核酸输送和外源DNA的体外表达已非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。Wong等(1980)证明了在培养的鸡胚、HeLa和肝细胞瘤细胞中脂质体介导的外源DNA输送和/或表达的可行性。
本发明某些实施方式中，可将脂质体与血凝性病毒(HVJ)组成复合物，显示促进了与细胞膜的融合和/或促进了脂质体包裹DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。本发明其它实施方式中，将脂质体与核内非组蛋白性染色体蛋白质(HMG-1)复合和/或结合运用(Kato等，1991)。其它实施方式中，将脂质体与HVJ和HMG-1二者复合和/或结合运用。其它实施方式中，输送载体可包含配体和脂质体。当在DNA构建物中采用细菌启动子时，最好还将合适的细菌聚合酶包含在脂质体中。
本发明人考虑可将neu-抑制性基因产物用脂质体介导的基因转移导入细胞。Nabel等(1990)提出，可将这类构建物与脂质体偶联，通过导管直接导入。采用这些方法，neu-抑制性基因产物可在体内特定部位有效表达，不只是在静脉注射可抵达的肝、脾细胞中表达。因此，本发明还包含neu-抑制基因产物编码DNA构建物的组合物(配制成DNA/脂质体复合物)，和使用这种构建物的方法。
如美国专利No.5,641,484所述，脂质体特别适合治疗HER2/neu介导的癌症。
a.脂质体的制备可用Gao等(1991)的方法制备动物细胞Bik的有效转染试剂阳离子脂质体。Gao等描述了一步合成的新的阳离子胆固醇衍生物。据报道此种脂质制备的脂质体用于转染更有效，对处理细胞的毒性比用Lipofectin试剂制备的低。这些脂质是DC-Chol(“3’(N-(N’N’-二甲基胺乙烷)-氨甲酰胆固醇”)和DOPE(“二油酰磷脂酰乙醇胺”)。生产这些脂质体的步骤如下。
通过胆甾烯基氯甲酸酯和N，N-二甲基乙二胺简单的反应合成DC-Chol。将胆甾烯基氯甲酸酯溶液(2.25g，5mmol，用无水氯仿配)0℃逐滴加入到过量N，N-二甲基乙二胺的溶液(2ml，18.2mmol，溶于3ml无水氯仿)中。蒸发除去溶剂后，4℃在无水乙醇中重结晶纯化残留物，真空干燥。产品是白色DC-Chol粉末。
在氯仿中混合1.2□mol DC-Chol和8.0□mol DOPE制备阳离子脂质体。干燥该混合物，真空干燥，在试管中重悬于1ml stero 20mM Hepes缓冲液(pH7.8)中。4℃水合24小时后，将分散物超声波仪超声处理5-10分钟，形成平均直径150-200nm的脂质体。
制备脂质体/DNA复合物，发明人采用如下步骤。将待转染的DNA放在DMEM/F12培养液中，比例为15μg DNA比50μl DMEM/F12。用DMEM/F12稀释DC-Chol/DOPE脂质体混合物至50μl DMEM/F12比100μl脂质体。然后轻轻混合DNA稀释液和脂质体稀释液，37℃培育10分钟。培育后DNA/脂质体复合物备用注射。
可通过含有，例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇(Chol)、氯化N-[1-(2，3-二油酰基)丙基]-N，N-三甲胺(DOTMA)、二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)和/或者3.β-[N-(N’N’-二甲基胺乙烷)氨甲酰基胆固醇(DC-Chol)，及该技术人员所知的其它脂类组成的脂质体进行脂质体转染。该领域技术员知道有各种脂质体转染技术可用于本发明。其中有Nicolau等，1987；Nabel等，1990和Gao等，1991所述的那些技术。在一具体实施方式
中，脂质体含有DC-Chol。更具体说，在优选实施方式章节中发明人的脂质体含有按照Gao等(1991)所说制备的DC-Chol和DOPE。发明人还预备使用含DOTMA的脂质体，可从San Diego，Calif.的Vical，Inc.，以商标名LipofectinTM购买到。
可用各种方法将脂质体导入与细胞接触进行转染。细胞培养时，可简单地将脂质体-DNA复合物分散加入在细胞培养液中。体内应用时，通常注射脂质体-DNA复合物。静脉注射可使脂质体介导DNA复合物转运到例如肝和脾。为了让DNA转染进入通过静脉注射不能进入的细胞，可将脂质体-DNA复合物直接注射到动物机体中的特定部位。例如，Nabel等通过导管注射入动脉壁。其它例子中，发明人采用腹膜内注射使基因转运到小鼠中。
本发明还设想含有脂质体复合物的组合物。该脂质体复合物将含有脂质成分和编码核酸的DNA片段，该核酸编码Bik突变形式。脂质体复合物中采用的编码Bik突变形式的核酸可以是，例如，编码Bik-T145A或Bik-T145D的核酸。
制备脂质体复合物所用的脂质可以是任何上述脂质。具体说，DOTMA、DOPE和/或DC-Chol可构成脂质体复合物的全部或一部分。发明人特别成功的是用含有DC-Chol的复合物。在优选实施方式中，脂质将含有DC-Chol和DOPE。虽然预计任何比例的DC-Chol与DOPE都可用，但预计所含DC-Chol与DOPE的比例在1∶20和20∶1的脂质特别优异。本发明人发现约1∶10-1∶5比例的DC-Chol∶DOPE制备的脂质体有用。
在一
具体实施例方式
中，采用能提高Bik在细胞核中保留所需的最小区域，这样不会在接受Bik基因构建物的细胞中导入不需要的DNA。该领域技术人员熟知的技术，如限制性酶切，将能产生Bik的小区域。这些区域抑制neu的能力不难通过实施方式中所述试验测定。
本发明某些实施方式中，将脂质体与血凝性病毒(HVJ)组成复合物，显示能促进与细胞膜的融合和促进脂质体包裹的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。其它实施方式中，将脂质体与细胞核内非组蛋白性染色体蛋白质(HMG-1)复合和/或结合运用(Kato等，1991)。还有其它实施方式中，将脂质体与HVJ和HMG-1二者复合和/或结合运用。这类表达构建物已成功用于在体外和体内转运和表达核酸，它们也适合于本发明。当在DNA构建物中采用细菌启动子时，最好还将合适的细菌聚合酶包含在脂质体中。
b.通过含Bik突变体的脂质体体内治疗癌症根据以上提供的技术，本领域技术人员知道，可用至少一种Bik突变体处理任何细胞，在具体实施方式
中，任何癌细胞都可这样处理。例如，在某些实施方式中，被处理的细胞是HER2/neu-阳性或HER2/neu-阴性。然而，在一个具体实施方式
中，被处理的细胞是HER2/neu-阳性。
其内容纳入本文作参考的美国专利No.5,641,484说，可采用脂质体介导的直接基因转运技术来获得对活的宿主中HER2/neu-过度表达的人癌细胞的抑制。其所述实施方案如下。给雌性裸小鼠(5-6周龄)腹腔内注射SK-OV-3细胞(2×106/100μl)。SK-OV-3细胞已证明是能在裸鼠腹腔中生长的人卵巢癌细胞。5天后，给小鼠腹腔注射各种化合物。某些小鼠只注射治疗性DNA，某些注射按上述方法制备的脂质体/治疗性DNA复合物，还有一些注射脂质体/突变型治疗性DNA复合物。所述小鼠注射200μl所述化合物。首次注射后，在小鼠活着期间每7天重复注射。
上述结果表明脂质体介导的基因转运可抑制HER2/neu-过度表达的人卵巢癌细胞生长。因此，预计脂质体介导的靶向融合物基因疗法通过将靶向融合物直接靶向HER2/neu-癌基因，可作为HER2/neu-过度表达的人卵巢癌的强力治疗制剂。
c.用突变型Bik脂质体转染治疗人的疾病根据美国专利No.5,641,484所述的动物体内研究结果，本领域技术人员会理解和预计有极大的可能采用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D DNA与脂质体的复合物，来治疗HER2/neu-介导的癌症。认为临床研究可证明这些效果。本领域技术人员将会知道可直接确定采用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D来抑制HER2/neu-介导的癌症的最好治疗方案。这在医学领域中不是常规实施的实验问题而是优化问题。裸鼠的体内研究提供了开始优化剂量和输送方案的起始点。注射次数开始是一周一次，如美国专利No.5,641,484所述小鼠研究那样做。然而，注射次数可调整优化，从一天到每隔二周，每月一次，取决于初步临床试验的结果和具体患者的需要。人的剂量最初可从小鼠所用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D的剂量推测确定，约每50克体重15μg质粒DNA。据此，50kg的妇女每剂需要用15mgDNA治疗。当然，此剂量可上调或下调，如这类治疗方案常规那样，取决于初步临床试验的结果和具体患者的需要。预计这些临床试验将证明用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D以及其它抑制neu的基因产物来治疗人HER2/neu-过度表达癌症的用途。剂量和频率方案最初可根据动物体内研究的数据，如该领域经常做的那样。
D.电穿孔本发明某些实施方式中，通过电穿孔将表达构建物导入细胞中。电穿孔包括将细胞和/或DNA悬液暴露于高压放电。
采用电穿孔转染真核细胞已相当成功。以此方式已采用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter等，1984)和/或用氯霉素乙酰转移转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa等，1986)。
E.磷酸钙和/或DEAE-葡聚糖本发明其它实施方式中，采用磷酸钙沉淀将表达构建物导入细胞。已用此技术以腺病毒5型DNA转染了人KB细胞(Graham和Van Der Eb，1973)。还以此方式用新霉素标记基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NTH3T3和/或HeLa细胞(Chen和Okayama，1987)，和/或用各种标记基因转染了大鼠肝细胞(Rippe等，1990)。
另一实施方式中，采用DEAE-葡聚糖然后用聚乙二醇将表达构建物输送给细胞。以此方式将报告质粒导入小鼠骨髓瘤和/或红白血病细胞(Gopal，1985)。
F.粒子轰击技术本发明另一实施方式将裸DNA表达构建物转运入细胞涉及颗子轰击技术。此方法依靠加速包被DNA的微粒到高速使微粒穿过细胞膜和/或进入细胞而不杀伤它们(Klein等，1987)。已开发了加速小粒子的几种装置。一种装置依靠高压放电产生的电流来提供驱动力(Yang等，1990)。所用微粒由生物学惰性物质如钨和金珠组成。
G.直接显微注射和/或超声加载本发明其它实施方式包括用直接微量注射和/或超声加载导入表达构建物。已采用直接微量注射将核酸构建物导入蟾蜍卵母细胞(Harland和Weintraub，1985)，和/或通过超声加载用胸苷激酶基因转染了LTK-成纤维细胞(Fechheimer等，1987)。
H.腺病毒辅助转染本发明某些实施方式中，采用腺病毒辅助的转染将表达构建物导入细胞。据报道采用腺病毒偶联系统在细胞系统中提高了转染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotton等，1992；Curiel，1994)。
V.联合治疗为了提高Bik突变形式，或编码Bik突变形式的表达构建物的效率，可能需要将这些组合物与能有效治疗过度增生性疾病的其它制剂，如抗癌症制剂联用。“抗癌症制剂”能负面影响对象的癌，例如通过杀伤癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速度、减少转移发生或数量、减少肿瘤体积、抑制肿瘤生长、减少肿瘤或癌细胞的血供、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答反应、防止或抑制癌症进展或提高癌症受试者寿限而负面影响受试者的癌瘤。更一般说，这些其它组合物以有效杀伤或抑制细胞增殖的联合剂量提供。此方法可能包括使细胞同时与表达构建物和制剂或多种因素相接触。这可通过使细胞与单一组合物或包含两种制剂的药物相接触，或使细胞同时与不同的组合物或药物接触而实现，其中，一种组合物含有表达构建物，另一种含有第二种制剂。
肿瘤细胞对化疗和放疗制剂的耐受性提出了临床肿瘤学的一个重大问题。当前癌症研究的一个目标是通过联合化疗和放疗与基因治疗，找到提高化疗和放疗疗效的方法。例如，通过逆转录病毒载体系统将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HS-tK)基因输送到脑肿瘤中时，成功地诱导了对抗病毒剂更昔洛韦的易感性(Culver等，1992)。在本发明正文中，考虑除其它促凋亡或细胞周期调节剂外，可将Bik基因治疗，相似地与化疗、放疗或免疫治疗干预结合起来应用。
或者，此种基因疗法可先于或后于其它药物治疗间隔几分钟至几星期。在其它药物和表达构建物分别施加于细胞的实施方式中，通常要保证在各次输药时间之间不会有显著的失效期，这样所述制剂和表达构建物仍能发挥对细胞的有益联合作用。在此类例子中，考虑可使细胞在约12-24小时内，更优选在约6-12小时内，与二种药征相互接触。某些情况下，可能需要明显延长治疗时间，然而各次给药之间的失效时间是几天(2，3，4，5，6或7)至几周(1，2，3，4，5，6，7，或8)。
可采用各种组合，基因疗法是“A”，而另一种制剂，如放疗或化疗是“B”A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/BB/A/A A/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A给予患者本发明的治疗性表达构建物，将按照给予化疗药物的通用方案，并考虑到载体的毒性，(如果有的话)。预计可按需要重复治疗周期。也考虑各种标准疗法及手术干预可与上述细胞过度增殖疗法联合应用。
A.化疗本领域技术人员可以理解，除本文所述的用于抑制细胞生长目的的Bik突变形式以外，其它化疗制剂在肿瘤病的治疗中也是有用的。这些化疗制剂的例子描述于下表4。
癌症治疗包括基于化学和放射性治疗的各种联合。代表性的具体方式包括，例如，顺铂(CDDP)，碳铂，甲基苄肼，二氯甲基二乙胺，环磷酰胺，喜树碱，异环磷酰铵，美法仑，苯丁酸氮芥，白消安，亚硝基脲，更生霉素，道诺霉素，阿霉素，博来霉素，普卡霉素，丝裂霉素，依托泊苷(VP16)，它莫西芬，雷洛昔芬，雌激素受体结合剂，紫杉酚，吉西他滨，诺维本，法呢基-蛋白转移酶抑制剂，反铂(transplatinum)，5-氟尿嘧啶，长春花新碱，长春灭瘟碱和氨甲喋呤，或以上物质的任何类似物或衍生变体。
表4-在肿瘤病中有用的化疗制剂






b.放疗其它引起DNA损伤并被广泛应用的因素包括大家所熟知的□-射线、X-射线和/或向肿瘤细胞直接输送放射性同位素。其他形式的DNA损伤因素如微波和紫外辐射也可以考虑。所有这些因素最可能引起对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持的大范围损伤。X射线的剂量范围从每天50-200伦琴，持续一段时间(3到4周)，到2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围很宽，可根据同位素的半衰期、所发出射线的强度和类型以及肿瘤细胞摄取的量而定。
本文所用的术语“使接触”或“暴露于”用于细胞时指将治疗性构建物和化疗或放疗药物输送给靶细胞、或直接与靶细胞一起放置的过程。为了达到杀死细胞或细胞抑制的目的，两种药物应以能联合有效杀死细胞或阻止细胞分裂的剂量给予细胞。
C.免疫治疗免疫治疗一般依赖于利用免疫效应细胞和分子来靶向和摧毁癌细胞。免疫效应器可以是，例如，肿瘤细胞表面上一些标记的特异性抗体。抗体可单独作为治疗的效应分子或可征集其它细胞来实施细胞杀伤。也可将抗体与药物或毒素(化疗药物，放射性核素，蓖麻毒素A链，霍乱毒素，百日咳毒素等)偶联，抗体只作为靶向试剂。或者，效应分子可以是携带有可与肿瘤细胞靶子直接或间接相互作用表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒T细胞和NK细胞。
因此，免疫治疗也可用作联合治疗的一部分，与Ad-Bik基因治疗联用。下面讨论联合治疗的一般方法。通常，肿瘤细胞必须带有可供靶向的标记，即大多数其它细胞不存在的标记。存在很多肿瘤标记，它们中的任何标记都可能适于本文所述的靶向。常用肿瘤标记包括癌胚抗原，前列腺特异性抗原，泌尿肿瘤相关抗原，胚胎性抗原，酪氨酸酶，(p97)，gp68，TAG-72，HMFG，Sialyl Lewis抗原，MucA，MucB，PLAP，雌激素受体，层连蛋白受体，erb B和p155。
D.基因在其它实施方式中，第二种治疗包括第二种基因治疗，其中，在给予编码全部或部分突变形式的Bik的第一种治疗性多聚核苷酸之前、之后或同时给予第二种治疗性多聚核苷酸。编码全长或截短的突变形式Bik的载体与编码一种下列基因产物的载体一起输递对靶组织有联合的抗过度增殖效果。或者，可采用编码两种基因的单一载体。本发明包括多种蛋白，下面描述了其中的一些。
1.细胞增殖诱导因子诱导细胞增殖的蛋白质根据功能可分成各种类型。所有这些蛋白质的共性是它们可调控细胞增殖。例如，PDGF的一种形式，sis癌基因，是分泌型生长因子。癌基因很少产生于编码生长因子的基因，目前，sis是唯一已知自然发生的致癌生长因子。在本发明的一个实施方式中，考虑利用细胞增殖特定诱导因子相关的反义mRNA来阻止该细胞增殖诱导因子的表达。
蛋白FMS、ErbA、ErbB和neu是生长因子受体。这些受体的突变导致调控功能的丧失。例如，影响Neu受体蛋白质跨膜区域的点突变产生neu癌基因。erbA癌基因产生自甲状腺激素的细胞内受体。认为经修饰的致癌ErbA受体可与内源甲状腺激素受体相互竞争，引起生长失控。
癌基因最大的一类包括信号转导蛋白质(例如，Src，Abl和Ras)。蛋白质Src是细胞质蛋白质-酪氨酸激酶，某些情况下通过酪氨酸残基527位突变使它从原癌基因转化为癌基因。与之相比较，在一个实施例中，GTP酶蛋白质ras从原癌基因转化为癌基因是因为其序列中氨基酸12位的缬氨酸突变为甘氨酸降低了ras的GTP酶活性。
蛋白Jun，Fos和Myc是作为转录因子在细胞核功能上直接发挥作用的蛋白。
2.细胞增殖抑制因子肿瘤抑制性癌基因的功能是抑制过量的细胞增殖。这些基因的失活破坏它们的抑制活性，导致增殖失控。下面描述了肿瘤抑制因子p53，p16和C-CAM。
在以化学致癌剂、紫外线辐射和几种病毒转化的很多细胞中已发现了高水平的突变p53。在多种人肿瘤中，p53基因是突变失活的高频靶点，并在已有的记录中是在普通的人癌症中突变频率最高的基因。在超过50％的人NSCLC以及多种其它肿瘤中p53是突变的(Hollstein等，1991)。
P53基因编码393个氨基酸的磷酸化蛋白，该蛋白可与宿主蛋白例如大T抗原和E1B形成复合物。在正常组织和细胞中可发现该蛋白，但与转化的细胞或肿瘤组织相比，其浓度很低。
野生型p53被认为在很多细胞型中是重要的生长调节子。错义突变对于p53基因是很常见的，并且其对于癌基因的转化能力是很关键的。点突变造成的单遗传改变可产生致癌p53。然而与其它癌基因不同，已知p53点突变发生在至少30个不同密码子中，经常产生改变细胞型但不减低纯合性的显性等位基因。此外，很多这些负显性等位基因似乎在生物体中是可以耐受的并在种系中传递。各种突变等位基因的范围似乎是从轻度的功能异常到强烈外显性，负显性等位基因(Weinberg，1991)。
另一个细胞增殖抑制因子是p16。真核细胞周期的主要转换是由细胞周期蛋白依赖性激酶或CDK’s来启动的。一种CDK，细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)调控G1进程。该酶的活性可能是在G1晚期磷酸化Rb。CDK4的活性由活化亚基、D-型细胞周期蛋白和抑制亚基控制，生化鉴定已确认p16INK4为特异性结合和抑制CDK4的蛋白质，并因此可能调控Rb的磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。既然p16INK4蛋白质是CDK4抑制因子(Serrano，1993)，那么该基因的缺失将提高CDK4的活性，导致Rb蛋白质的过度磷酸化。还已知p16可调控CDK6的功能。
p16INK4属于新描述的CDK-抑制蛋白类别，该类蛋白还包括p16B，p19，p21Waf1/Cip1，和p27KIP1。p16INK4基因图谱定位于9Bik，这是在很多肿瘤类型中常常缺失的染色体区。p16INK4基因的纯合性缺失和突变在人肿瘤细胞系中时常发生。该证据提示p16INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，因观察到p16INK4基因改变的频率在原代未培养的肿瘤中比培养细胞系中低得多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)，上面的解释已受到质疑。以质粒表达载体转染来恢复野生型p16INK4功能降低了某些人癌细胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。
本发明可利用的其它基因包括Rb，APC，DCC，NF-1，NF-2，WT-1，MEN-I，MEN-II，zacl，p73，VHL，MMAC1/PTEN，DBCCR-1，FCC，rsk-3，p27，p27/p16融合物，Bik/p27融合物，抗-血栓形成基因(例如，COX-1，TFPI)，PGS，Dp，E2F，ras，myc，neu，raf，erb，fms，trk，ret，gsp，hst，abl，E1A，p300，参与新生血管形成的基因(例如，VEGF，FGF，血小板反应素，BAI-1，GDAIF，或它们的受体)和MCC。
3.细胞程序性死亡的调节因子凋亡或细胞程序性死亡是正常胚胎发育、成年组织内环境稳定的维持以及癌变抑制中的一种基本过程(Kerr等，1972)。已证明，Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶家族是其他系统中凋亡的重要调节因子和效应因子。发现Bcl-2蛋白与滤泡性淋巴瘤有关，在由各种凋亡刺激因子引起的凋亡的控制以及提高细胞的存活中起着重要作用(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现认为进化保守的Bcl-2蛋白是相关蛋白家族的一个成员，可以归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
Bcl-2被发现以后，证明它可以抑制由各种刺激因素引起的细胞死亡。而且现已知道存在一个Bcl-2细胞死亡调节蛋白家族，它们具有相同的结构，其序列同源。已证实这个家族内的不同成员或者具有与Bcl-2相似的功能(如BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)，或者具有与Bcl-2相反的功能，并可促进细胞死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
E.手术约60％患有癌症的人将进行一些类型的手术，包括预防性、诊断性或阶段性、治疗性和姑息性手术。治疗性手术是可与其它治疗例如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或其它治疗联合使用的癌症治疗。
治疗性手术包括切除术，其中将全部或部分癌组织从身体移除、切除和/或摧毁。肿瘤切除指将肿瘤的至少一部分从身体移除。除肿瘤切除术之外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制的手术(Mohs’手术)。还考虑将本发明与表面癌、初癌或偶然量正常组织的切除联合使用。
移除所有癌性细胞、组织或肿瘤的一部分之后，身体内可能形成了腔隙。可通过灌注、直接注射或在该区域局部应用其它抗癌治疗的方法来达到治疗目的。这种治疗可以重复，例如每1，2，3，4，5，6，或7天，或每1，2，3，4，和5周或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12个月。这些治疗的剂量也可不同。
F.其它制剂可与本发明联合使用以提高治疗效果的其他药物也可以考虑。这样的其它制剂包括免疫调节剂、可上调细胞表面受体和GAP连接的制剂、细胞抑制剂和分化制剂、细胞粘附抑制剂以及能提高过度增殖细胞对凋亡诱导因子敏感性的药物。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β、γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。本发明还考虑上调细胞表面受体或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL的表达，能够通过提高过度增殖细胞的自分泌或旁分泌作用来加强本发明的凋亡诱导能力。通过增加GAP连接的数量来提高细胞间的信号传递也可以增强对邻近的过度增殖细胞的抗过度增殖效应。在其它的实施方式中，细胞抑制剂或分化制剂可与本发明联合使用以提高治疗的抗过度增殖效应。考虑使用细胞粘附的抑制剂以提高本发明的效果。细胞粘附抑制剂的例子有病灶粘连激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他丁。能增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其它药物，如抗体c225，也可与本发明组合物联用以提高治疗效果。
也可将激素治疗与本发明或上述任何其它癌症治疗方法联合使用。可在某些癌症例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌的治疗中使用激素以降低某些激素例如睾酮素或雌激素的水平或阻抑其作用。这种治疗经常作为一种治疗选择或用于减少转移危险与至少一种其它癌症治疗联合使用。
VI.药物制备本发明的药物组合物含有有效量的一种或多种形式的溶于或分散于药学上可接受的运载体或赋形剂中的突变型Bik或其它制剂。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当动物时，例如人(适当时)，不会产生副作用、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。通过本文所公开的内容，本领域技术人员将会知道含有至少一种Bik突变形式或其它活性成分的药学组合物的制备方法，例如见Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，纳入本文参考文献。另外，对动物(如人)给药，可以理解的是制品应符合FDA公署生物标准要求的无菌、无致热原，总体安全和纯度标准。
本文使用的“药学上可接受的运载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂，抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、调味剂、染料等物质和它们的组合，这是本领域普通技术人员知道的(见例如，Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PrintingCompany，1990，1289-1329页，纳入本文参考文献)。除了与活性成分不相容的常规运载体外，认为均可用于治疗或药物组合物中。在具体实施方式
中，突变型Bik组合物在脂质体中给药。
所述Bik突变形式可含不同类型的运载体，对于注射这种给药途径，运载体的形式取决于是否要以固体、液体或气溶胶形式给药，以及是否需要除菌。本发明组合物可通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、膀胱内、粘膜、心包内、口服、局部、采用气溶胶、注射、输液、持续输液、局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、配制在霜膏中、在脂质组合物(如脂质体)中或通过该领域普通技术人员知道的其它方法或上述方法的任何组合给药(见例如，Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，纳入本文参考文献)。
给予患病动物本发明组合物的实际剂量由物理和生理因素，如体重、疾病严重性、待治疗疾病的类型、原有和共同的治疗措施、受试者的特发病和给药途径所决定。负责给药的医生将决定组合物中活性成分的浓度和受试者个体的合适剂量。
某些实施方式中，药物组合物可含有，例如至少约0.1％的活性成分。其它实施方式中，该活性成分含有的重量单位约在2％-75％之间，或约在25％-60％之间，例如，可从其中推断出的任何范围。其它非限制性例子中，每次给药的一个剂量也可含约1μg/kg/体重，约5μg/kg/体重，约10μg/kg/体重，约50μg/kg/体重，约100μg/kg/体重，约200μg/kg/体重，约350μg/kg/体重，约500μg/kg/体重，约1mg/kg/体重，约5mg/kg/体重，约10mg/kg/体重，约50mg/kg/体重，约100mg/kg/体重，约200mg/kg/体重，约350mg/kg/体重，约500mg/kg/体重，约1000mg/kg/体重，或每次施用更多，和可从其中推断出的任何范围。在从上列数字推断出的范围的非限制性例子中，可根据上述数字给予约5mg/kg/体重-100mg/kg/体重，约5μg/kg/体重-约500mg/kg/体重等。
无论如何，该组合物可含有各种抗氧化剂以防止一种或多种组分的氧化。此外可用防腐剂来预防微生物的作用，如各种抗菌和抗真菌剂，包括但不仅限于对羟基苯丙酸酯(如甲基对羟基苯丙酸酯、丙基对羟基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
Bik突变形式可配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，如与蛋白质组分的游离氨基形成的盐，或与无机酸，如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱如异丙胺、三甲基胺、组胺或普鲁卡因。
在该组合物是液体形式的实施方式中，运载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液态聚乙二醇等)、脂质(如甘油三酯、植物油、脂质体)和它们的组合。例如，可通过采用包衣如卵磷酯；通过用运载体如液体多元醇或脂分散维持所需颗粒大小；用表面活性剂如羟丙基纤维素；或这些方法的组合来维持适当的流动性。许多情况下，优选包含等渗剂如糖、氯化钠或其组合。
其它实施方式中，本发明可采用滴眼剂、滴鼻液或喷雾、气溶胶或吸入剂。通常将这类组合物设计成与靶组织类型相容。一非限制性例子中，滴鼻液常设计成以液滴或喷雾形式给予鼻通道的水溶液。制备的滴鼻液在许多工作方面类似于鼻分泌液，从而可维持正常的纤毛运动。因此，在优选实施方式中，滴鼻水溶液通常等渗或轻度缓冲，将pH维持在约5.5-6.5。此外，类似于眼科制品中使用的抗微生物防腐剂、药物或适合的药物稳定剂，如需要可包含于配方中。例如，已知的各种商品化滴鼻制品，其中包括抗菌素或抗组胺药。
某些实施方式中，制备通过诸如口服消化途径给药的Bik突变形式。这些实施方式中，固体组合物可含有，例如溶液、悬浮液、乳液、片剂、药丸、胶囊(如硬或软衣壳明胶胶囊)、缓释制剂、口颊吸收组合物、栓剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、糯米纸囊剂或它们的组合。口服组合物可直接加到饮食中。口服给药的优选运载体包括惰性稀释剂、可同化食用运载体或它们的组合。在本发明其它方面，可将口服组合物制成糖浆或酏剂。糖浆或酏剂可含有，例如至少一种活性制剂、增甜剂、防腐剂、矫味剂、染色剂、防腐剂功它们的组合。
在某些优选实施例中，口服组合物可含有一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂和它们的组合。某些实施例中，此组合物可含有以下一种或多种物质粘合剂如西黄嗜胶、阿拉伯胶、谷物淀粉、明胶或其组合；赋形剂如磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂如谷物淀粉、土豆淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂如硬脂酸镁；增甜剂如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；矫味剂如薄荷、冬青油、樱桃香精、橙子香精等；或上述物质的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型物质外可含有运载体如液体运载体。可存在多种其它物质，如以包衣剂的形式存在，或用以修饰剂量单位的物理形式。例如可用虫胶、糖或二者包裹药片、药丸，或胶囊。
适合于其它给药方式的其它制剂包括栓剂。栓剂是重量和形状不同的固体剂量形式，医学上常用于插入直肠、阴道或尿道给药。插入后，栓剂变软，融化或溶于体腔液体中。通常对于栓剂，传统的运载体包括，例如，聚亚烷基二醇、甘油三脂或其组合。某些实施方式中，栓剂可由含有约0.5％--10％，优选约1％--2％范围活性成分的混合物形成。
通过在适当溶剂中加入所需量的活性组分与根据所需加入上述各种其它成分，然后按需要过滤除菌配制而成灭菌可注射溶液。通常在含有基础分散介质和/或其它组分的无菌运载体中，加入不同的除菌活性成分配成分散剂。配制灭菌注射液、悬浮液或乳液用的灭菌粉剂时，优选的配制方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这样的技术可从事先过滤除菌的液体介质产生活性成分加上其它所需成分的粉末。如需要液体介质应适当缓冲，注射前该液体稀释液先用足够的盐或葡萄糖做成等渗。也考虑制备供直接注射的高浓度组合物制品，考虑用DMSO作为溶剂可导致极快的渗透，输送高浓度的活性制剂到小区域中。
该组合物在制备和贮存条件下必须稳定，防止微生物如细菌和真菌的污染。需知应将内毒素的污染控制到最低，处在安全水平内，例如低于0.5ng/mg蛋白质。
在
具体实施例方式
中，可在该组合物中采用延迟吸收的制剂如单硬脂酸铝、明胶或其组合来延缓可注射组合物的吸收。
VII.定点突变结构导向的位点特异性突变是对蛋白质一配体相互作用进行解剖分析和工程操作的一种有力的工具(Wells，1996，Braised等，1996)。该技术通过向所选DNA引入一个或多个核苷酸序列变化来提供序列变体的制备和测试。
位点特异性突变采用编码所需突变的DNA序列的特异性寡聚核苷酸序列，以及足够数目的毗连的未修饰的核苷酸。以这种方式提供具有足够大小和复杂性的引物序列，而在其横跨的缺失接头两端形成稳定的双链。优选长度约为17-25个核苷酸的引物，其中在序列接头的两端约5-10个残基被改变。
该技术通常使用以单链和双链形式存在的细菌噬菌体载体。用于定点突变的载体包括载体例如M13噬菌体。这些噬菌体载体可商业购得，它们的使用一般是本领域技术人员所熟知的。双链质粒也常规性地用于定点突变中，这可以免去将感兴趣的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。
一般，首先获得单链载体，或将双链载体的两条链熔化，该单链载体或双链载体的序列中包含编码所需蛋白或遗传元件的DNA序列。通过合成制备携带所需突变序列的寡聚核苷酸引物，然后将其与单链DNA制品退火，在选择杂交条件时需考虑错配的程度。将杂交产物用DNA多聚酶例如大肠杆菌聚合酶I(Klenow片段)处理以完成携带有突变的链的合成。这样，形成了异源双链，其中一条链编码原始的非突变的序列，第二条链携带所需的突变。然后用此异源双链载体转化合适的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞，选择包括带有突变序列排列的重组载体的克隆。
最佳地，可通过饱和(saturation)突变，其中检查所有19个氨基酸替代，来获得有关蛋白某残基功能重要性和信息含量的全面信息。该方法的缺点是多残基饱和突变的逻辑学是另人生畏的(Warren等1996，Brown等1996；Zeng等1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等1995；Jackson等，1995；Short等19959 Wong等，1996；Hilton等1996)。必须研究上百甚至可能上千种的位点特异性突变。然而，改进的技术使突变的产生和快速筛选更为直接。也可参见美国专利5,798,208和5,830,650，描述了“走过式”(“walk-through”)突变。
定点突变的其它方法揭示于美国专利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377；和5,789,166。
实施例本文包括以下实施例以显示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应懂得，实施例中按照本发明人发现的代表性技术所公开的技术，在实施本发明时能很好地发挥作用，可认为构成了实施本发明的优选方式。然而，阅读了此公开内容后，本领域技术人员应理解可在所公开的具体实施方式
中作出许多修改而仍能获得相似或类似的结果，但这未脱离本发明的思路和范围。
实施例1代表性材料和方法细胞系人乳腺癌细胞系MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435，卵巢癌细胞系SKOV-ipl和人前列腺癌细胞系PC-3购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，根据卖方说明培养。
质粒构建和定点突变通过将Bik，Luc，和GFP9的cDNA分别插入含有巨细胞病毒启动子的pcDNA3载体来构建表达Bik，Luc，和GFP9的质粒。根据厂商的方法(ClontechInc.)进行定点突变。用下列引物，对于T33D为5’-GGCATGACTGACGATGAAGAGGACCTG-3’(SEQ ID NO1)，对于S35D为5’-GTTCTTGGCATGGATGACTCTGAACAGG-3’(SEQ ID NO2)，将Bik残基苏氨酸33和丝氨酸35天冬氨酸化。用自动测序验证3个Bik突变构建物的序列。
配方非病毒基因输递系统，称为SN，实质上是阳离子脂质体，如前所述(Zou等，2002)来配制。
转染细胞在含1毫升/孔DMEM/F12培养基的6孔板中培养24小时直到60％-70％汇合，DMEM/F12培养基含有10％FBS(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)。将脂质体DNA(SN-DNA)以2μg/106细胞的比例直接加到培养板中。24小时后，通过在荧光显微镜下计数GFP-阳性细胞来确定转染效率，结果表示为总细胞的百分比的形式表示结果。对每个样品的6个＞200细胞/区域的随机区域加以计数。所有试验独立地重复3次。
Western印迹分析以RIPA-B细胞裂解缓冲液制备蛋白裂解物，该缓冲液含有20mM Na2PO4(pH7.4)，150mM NaCI，1％ 吐温X-100，100mM NaF，2mM Na3VO4，5mM苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，1％抑蛋白酶肽，和10μg/ml亮抑肽酶。山羊抗Bik多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，California)。驴(Donkey)抗-山羊IgG过氧化物酶(Jackson)用作二抗。Western印迹用增强型化学发光(ECL；Amersham)来显影。
荧光素酶试验为了确定Bik对细胞增殖的剂量效应，用50ng CMV-luc和递增数量(0，0.5，或2ug)的CMV-Bik共转染不同的癌细胞。通过加入合适量的pcDNA3载体使各剂量转染的DNA总量保持恒定(2.05μg)。转染后48小时，收获细胞，根据厂商提供的方法用luc试验系统(Promega)测量luc活性。通过将得自无CMV-Bik(0μg)转染的luc活性设定为100％来计量相对活性。数据代表3次独立试验的平均±SD。
凋亡试验对于体外试验，用标准荧光激活细胞分选分析来确定细胞的凋亡。简言之，用SN-bik或其它物质转染细胞。转染后12或24小时，碘化丙锭染色后用流式细胞仪测定sub-G1 DNA含量来评估凋亡细胞。随机选择每个样品中＞2000细胞/区域的区域，计数凋亡细胞和未凋亡细胞的比率。
离体肿瘤抑制用SN-bik或SN-luc转染人乳腺癌细胞系MCF-7和前列腺细胞系PC-3细胞。转染后24小时，小心地将细胞进行胰蛋白酶消化，收获，接种到裸鼠的MFPs中(2×106细胞/肿瘤)。每周测量所得的肿瘤体积。
抗肿瘤活性测验为了研究肿瘤生长抑制，以2×106的乳腺癌细胞/肿瘤接种雌裸鼠MFPs。2周后，当大多数肿瘤超过4×4mm时，将荷瘤小鼠随机分成3组，每组5只。所有处理组中的小鼠都接受SN-bik的i.v.注射3周，每周3次，剂量为15ugDNA/小鼠。用相同剂量的SN-luc或相同体积的PBS注射对照组小鼠。每周测量肿瘤体积。为了评估动物存活和寿限的增加，采用了相同的肿瘤模型和相同的治疗处理。肿瘤接种后200天结束实验。
统计学分析本研究中所有统计学测验均为双侧log秩统计学测验。
实施例2代表性BIK突变体的构建用定点突变(Clontech；La Jolla，CA)构建Bik单突变体T33D，S35D和双突变体T33DS35D，其中残基33(苏氨酸)和35(丝氨酸)分别或共同改变成天冬氨酸残基。通过DNA测序验证突变型Bik构建物之后，以Bik抗体进行的Western印迹证明，瞬时转染后HBK293细胞中产生不同的Bik突变体的表达。阳离子脂质(SN)的配方用于将促凋亡突变型Bik基因递送到体外和体内不同的人癌细胞中(Zou等，2002)。
实施例3代表性BIK突变体的体外检测为了检测Bik突变体在体外对人癌细胞系生长的抑制是否好于野生型Bik，进行了瞬时转染试验以评价突变型Bik对细胞生长抑制的效果，其中用数量递增(0，0.5，和2μg)的CMV-Bik野生型和不同人癌细胞中的突变体和固定量(50ng)的CMV-luc共转染，人癌细胞包括人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，MDA-MB-468，MCF-7，前列腺癌细胞系PC-3和卵巢癌细胞系SKOV-ipl。因为明显的luc活性是活细胞的一种量度，所以相对荧光素酶活性可用作细胞生长和增殖的指标(图1)。
图1A中显示了瞬时转染后293T细胞中Bik和突变型蛋白表达的western印迹分析。肌动蛋白用作等量上样对照。图1B-1F中，用50ng的CMV-luc和数量递增(0，0.5，或2ug)的CMV-Bik野生型或突变体共转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-468(图1B)，MCF-7(图1C)，MDA-MB-231(图1D)，卵巢癌细胞系skov-ipl(图1E)和前列腺癌细胞系PC-3(图IF)。通过将得自无CMV-Bik(0μg)转染的荧光素酶活性设定为100％来计量相对活性。数据代表3次独立试验的平均值；竖条，SD；星号(*)表示相比于野生型具有显著差异(P＜0.05)。
虽然野生型和突变型Bik的表达都以剂量依赖方式引起全面的生长抑制，但Bik突变体，尤其是T33DS35D突变体，表现出对不同癌细胞更强的生长抑制作用，并且表达水平与生长抑制活性成比例。因此，突变型Bik在体外和体内对多种癌细胞型都非常有效。其作用不依赖于Her-2/neu癌基因的表达水平。
用相似的方法，表示于图2，Bik突变体T33DS35D也表现出对头颈癌细胞(TU138和TU167)，黑素瘤(B16F10)，卵巢癌(2774和SKOV。SKOV不是Her-2/neu过表达细胞，与SKOV-ipl相反)和内皮细胞(人脐带血管内皮细胞，HUVEC)有效的抗癌作用。因此，除Her-2/neu过表达的癌细胞SKOV-ipl之外，Bik突变体也对无Her-2/neu过表达的细胞表现出有效的抑制作用。
实施例4BIK突变体活性的FACS分析已知促凋亡基因Bik在很多恶性细胞中增强凋亡。为了检测突变型Bik是否在不同的癌细胞上引起细胞杀伤作用或凋亡的增强，用标准荧光激活细胞分选分析(FACS)来检测癌细胞的凋亡。简言之，用SN-Bik或其它物质转染细胞。
具体说，用100ng CMV-GFP和2μg CMV-Bik野生型或突变体共转染人乳腺癌细胞系MCF-7和前列腺癌细胞系PC-3。pcDNA3转染的细胞用作对照。转染后12或24小时，收获凋亡的细胞，以碘化丙锭染色后通过流式细胞仪检测sub-G1DNA含量来评估凋亡的细胞。数据代表3次独立试验的平均值；竖条，SD；星号(*)表示相比于野生型具有显著差异(P＜0.05)。
转染后12或24小时，以碘化丙锭染色后通过流式细胞仪检测sub-G1 DNA含量来评估凋亡的细胞。在MCF-7细胞中，不同的Bik突变体诱导多于野生型Bik 40％-80％的凋亡(图3)。凋亡的启动也比野生型早，早在转染后8小时就开始凋亡。在PC-3细胞系中观察到类似的现象。结果表明突变型Bik可诱导显著的癌细胞凋亡，比野生型Bik更强和更早。
实施例5
代表性Bik突变体的活体外试验肿瘤抑制基因的最重要生物学特性之一就是其能够在体内降低肿瘤生成的能力。为了测定不同的Bik突变体中哪些可能具有更好的抗肿瘤活性，在裸鼠癌症模型中进行了活体外肿瘤生成试验。在组织培养板中，通过SN脂质体用CMV-Bik野生型或突变体转染人乳腺癌细胞系MCF-7和前列腺癌细胞系PC-3。pcDNA3转染的细胞作为对照。24小时后，小心地收获处理过的细胞，并将其接种到裸鼠的乳房脂肪垫(mfp)(对于MCF-7)或皮下结缔组织(对于PC-3)中。对于MCF-7接种400万个细胞，对于PC-3接种100万个细胞。用空白载体pcDNA3转染的细胞作为对照。每周测量接种的肿瘤的体积。
具体地，在组织培养板中，人乳腺癌细胞系MCF-7(4×106细胞，接种前2周在每只小鼠的皮下植入0.72mg的17β-雌二醇片剂)和前列腺癌细胞系PC-3(1×106细胞)通过SN脂质体用CMV-Bik野生型或突变体进行转染。pcDNA3转染的细胞用作对照。24小时后，收获处理的细胞，并将其接种到裸鼠的乳房脂肪垫(mfp)(对于MCF-7)或皮下结缔组织(对于PC-3)中，每组8只小鼠。每周测量肿瘤的体积，如图4A所示。7周后，处死小鼠，并测量肿瘤的重量，如图4B所示。每组中都有肿瘤形成速率。竖条，标准差；星号(*)表示与野生型相比具有显著差异(P＜0.05)；星号(**)表示与pcDNA3对照相比具有显著差异(P＜0.05)。
该“活体外试验”绕过了体内基因递送问题，并且表明在最佳的基因递送条件下，具有突变型Bik的肿瘤细胞在体内比野生型Bik表现出更低的肿瘤生长能力(图4A)。与pcDNA3对照相比，SN-Bik延迟小鼠中的肿瘤生长至少3周。对于MCF-7细胞，7周内野生型Bik和3个Bik突变体处理组的肿瘤体积比在2.1至3.7的范围内，对于PC-3细胞，该比值在2.2至4.1之间，表明突变型Bik的处理在体内具有强烈的肿瘤抑制活性。图4的数据代表每组8只小鼠肿瘤体积的平均值±标准偏差。此外，野生型Bik的平均肿瘤体积(以重量测定)是不同的Bik突变体组的约2至4倍(图4B)。在MCF-7组中，突变型Bik也具有较低的肿瘤形成速率。
实施例6代表性Bik突变体的体内试验以上研究表明，在体外和活体外条件下，3个突变型Bik形式比野生型Bik更好地诱导凋亡和抑制肿瘤细胞生长，并且进一步在原位乳腺癌模型和皮下前列腺癌模型中将SN递送的Bik突变体的抗肿瘤活性与野生型Bik加以比较。
因为在体外凋亡试验和肿瘤生长活体外试验中，双突变T33DS35D Bik在三个Bik突变体中是最强的突变，因此将Bik T33DS35D(Bik DD)用作三个Bik突变体的代表，在以下的体内研究中以其和野生型Bik加以比较。然后，用SN-wtBik、SN-Bik T33DS35D或SN-pcDNA3处理已经形成肿瘤的小鼠。与SN-Bik和SN-pcDNA处理的小鼠相比，注射SN-Bik T33DS35D显著地抑制小鼠的肿瘤生长。
具体地，图5A中使用的是小鼠体内的原位人乳腺癌MCF-7细胞(乳房脂肪垫，4×106细胞/小鼠，在接种前2周给每只小鼠皮下植入0.72mg的17β-雌二醇片剂)和异位人前列腺癌PC3细胞(皮下，1×106细胞/小鼠)模型。一周后，将荷瘤小鼠随机地分至三个组，每组5只小鼠。一组接受多次SN-DNA注射，15μg DNA/小鼠，每周三次，总共处理12次，原位乳腺癌用静脉内注射，而异位前列腺癌则用肿瘤内注射，另一组接受相同剂量的SN-pcDNA3。每周测量肿瘤的体积。图5B中，用SN递送的突变型Bik基因显著地延长了具有原位或异位人类癌症的小鼠的寿限。该图中的数据代表来自5只独立的小鼠的平均值±标准偏差。竖条，SD。)到3至5周，在两个模型中SN-Bik处理的小鼠的平均肿瘤体积均大于SN-Bik T33S35D处理的小鼠。可以在第8周和第9周观察到最显著的肿瘤抑制效果，野生型和突变型处理组的肿瘤体积之间大约有2-3倍的差异(P＜0.05；图5A)。与用SN-野生型Bik处理的对照组相比，SN-Bik T33S35D处理显著地增加了被处理小鼠的存活率(P＜0.05；图5B)。在MCF-7细胞中，对于Bik T33S35D处理组，中位存活时间为175天，与此相比，Bik处理组中位存活时间为112天，在PC3细胞中，分别为140天和105天。该结果表明SN-Bik T33S35D在这些人癌症模型中抑制了约50％的肿瘤生长，并显著地提高了存活率。
已经建立了乳腺癌系统性基因治疗方法，该方法包括一个非病毒基因递送系统(SN)和一个促凋亡基因bik。SN-Bik基因复合物体外在4种乳腺癌细胞系中显著地诱导凋亡，该复合物也在裸鼠的原位肿瘤组织中显著地诱导凋亡(Zou等，2002)。系统性地施用SN-Bik显著地抑制植入裸鼠中的人乳腺癌细胞的生长和转移，并且延长被治疗动物的寿限。Bik基因是一个有效的凋亡诱导基因，不依赖于p53。像Bad(Wang等，1999)和Bid(Desagher等，2001)一样，Bik是由磷酸化(苏氨酸33和丝氨酸35残基)加以调控的。不同于Bad，磷酸化能够增强Bik的促凋亡能力。该作用机制目前还不知道，可能是由酪蛋白激酶II相关酶引起的(Verma等，2000)。磷酸酶PP2A可能负调控其功能(Klumpp和Krieglstein，2002)。在具体实施方式
中，Bik的翻译后磷酸化引起构象的改变，从而使其从非活性的复合物中释放出来，并增强其与抗凋亡Bcl-2同源物的亲和度或易接近度。
结果表明Bik突变体(T33D，S35D和T33DS35D)转染比野生型(wt)Bik转染更有效地抑制多种人类癌细胞的增殖和增强凋亡诱导，也能更有效地在活体外和体内模型中抑制小鼠的肿瘤生长。因此，这就表明突变型Bik基因比野生型Bik基因更有效地诱导细胞死亡，SN-Bik可以用作癌症治疗制剂。
显然，本文揭示的方法是在本发明的背景下对于具体的Bik突变体证实有效。根据本文提供的指导，本领域的技术人员可以制备并检测任意数量的具有抗细胞增殖活性、抗肿瘤活性、促凋亡活性或其组合的突变体。
实施例7代表性的Bik突变体用作治疗制剂的试验在动物研究中检测了与抗肿瘤活性相关的Bik突变体，这些动物研究诸如细胞系、细胞培养、和/或除了先前实施例中已述模型之外的其它模型。在本发明的通用实施方式中，用载体将突变体递送到裸鼠模型中检测其抗肿瘤活性，所用的载体如脂质体、腺病毒载体、或其组合。一旦证明了抗肿瘤活性，则进一步用免疫活性的小鼠检测其潜在的毒性，随后即是临床试验。
在
具体实施例方式
中，在动物中检测了Bik突变体的优先生长抑制活性。简言之，将癌细胞系给予裸鼠的乳房脂肪垫而产生乳房异种移植模型。尽管如本文所述，任何癌细胞都在本发明的范围之内，无论其基因型或表达水平，(例如，不管是HER-2/neu-阳性或是HER-2/neu-阴性)，在具体实施方式
中，使用的是HER-2/neu过表达的乳腺癌细胞系(例如，SKBR3和/或MDA-MB361)，如用于试验。在肿瘤达到特定体积之后，将Bik突变体和/或野生型Bik对照给予小鼠，例如，与可接受的载体，如脂质体，以混合物的形式实施静脉注射。对比这些处理组的肿瘤体积和存活曲线，并进行统计分析。在优选实施方式中，突变型Bik在抑制肿瘤生长方面基本上与野生型Bik相当，或者效果更好。
实施例8制备其它Bik突变体根据前述实施例的数据和说明书其它的内容，以及本领域的现有知识，技术人员会有动力并且也能够产生其它的Bik突变体，而且，也能够使用本文揭示的方法确定本发明背景下的突变体的功效。
实施例9测试其它Bik突变体一旦产生了除了本文揭示的代表性突变体之外的Bik突变体，就如本文所述的方法在相关的细胞系中用细胞培养进行测试。此外，也如本文所述使用FACS分析来检测Bik突变体。也可以在具体的实施方式中应用本文所述的使用活体外系统或体内系统的检测其它Bik突变体的方法。
实施例10突变型Bik在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌模型中的抗癌效果代表性Bik突变体(BikDD)多聚核苷酸表现出显著的肿瘤生长抑制效果以及在乳腺癌原位模型中提高存活率的功效。将人乳腺癌细胞MDA-MB-231(2×106细胞)接种到裸鼠的乳房脂肪垫(MFP)中。一周后，将荷瘤小鼠随机分成5组，每组5或8只小鼠。所有治疗组中的小鼠每周接受静脉内注射，注射载体(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(15μg DNA/小鼠)，使用NIH脂质体进行递送，治疗持续10周。对照组的小鼠接受5％的右旋糖(D5W)注射。图6A中，每周测量并记录肿瘤体积。图6B表明BikDD提高了具有MDA-MB-231原位肿瘤的小鼠的存活率。图6A和6B中所示数据表示的是5或8只独立的小鼠的平均值和标准偏差。
Bik突变(BiIcDD)基因也显示出显著的肿瘤生长抑制，以及能在乳腺癌原位模型中提高存活率。将人乳腺癌细胞MDA-MB-468(3×106细胞)接种到裸鼠的乳房脂肪垫中(MFP)。1周后，将荷瘤小鼠随机地分至5个组中，每组9或10只小鼠。所有治疗组的小鼠每周接受静脉注射，注射载体(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(45μg DNA/小鼠)，使用NIH脂质体进行递送，持续治疗10周。对照组的小鼠注射5％的右旋糖(D5W)。图7A中，每周测量并记录肿瘤体积。图2B中，BikDD提高了荷有MDA-MB-231原位肿瘤的小鼠的存活率。图7A和7B所示数据代表了来自9或10只独立的小鼠的平均值和标准偏差。
图8中，用Bik突变(BikDD)基因进行治疗提高了卵巢癌原位模型中小鼠的存活率。将人卵巢癌细胞2774(2×106细胞)以腹膜内注射(i.p.)接种到裸鼠体内。将小鼠随机地分成3组，每组10只。所有治疗组的小鼠每周接受i.p.注射，注射载体(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(15μg DNA/小鼠)，使用NIH脂质体进行递送，持续治疗12周。对照组的小鼠注射5％的右旋糖(D5W)。图中所示数据代表了来自10只独立小鼠的平均值和标准偏差。
图9中，用Bik突变(BikDD)基因进行治疗提高了胰腺癌原位模型中小鼠的存活率。将胰腺癌细胞Pan02(5×104细胞)接种到裸鼠体内。将小鼠随机地分成3组，每组10只。所有治疗组的小鼠每周接受i.p.注射，注射载体(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(15μg DNA/小鼠)，使用NIH脂质体进行递送，持续治疗11周。对照组的小鼠注射PBS。
实施例11突变型Bik的癌组织特异性表达目前的癌症治疗，如化疗(CT)和放疗，对于肿瘤细胞的选择性较低，对正常组织具有副作用。为了将副作用降至最小，这些治疗方法通常以间断的方式加以施用，使正常细胞在治疗周期之间得到恢复。然而，在恢复期，一些存活的癌细胞因为基因突变而对治疗产生更大抗性。于是就会发生癌症复发或恶化。靶向肿瘤的基因治疗通过作用于肿瘤特异性的信号通路可以将治疗所带来的副作用和产生抗性的危险降至最低。本发明中使用组织特异性启动子来进行突变型Bik的靶向基因治疗，诸如靶向乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。
突变型Bik的乳腺癌特异性表达突变型Bik的乳腺癌特异性表达采用两个本文所述的代表性启动子，这两个启动子在名为“癌症特异性启动子”的美国临时专利申请60/__＿中有更具体的描述，该专利申请属于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同时列出并全文引入本文作为参考。
拓扑异构酶IIα的乳腺癌特异性表达构建了一个治疗性构建物，该构建物包括操作性连接于CMV增强子(SEQ IDNO25)的拓扑异构酶IIα控制序列，如CT90区(SEQ ID NO26)，同时包括这两个序列的组合的构建物(SEQ ID NO37)操作性连接于编码突变型Bik的多聚核苷酸以调控其表达。本文中详述了该构建物，而在名为“癌症特异性启动子”的美国临时专利申请60/＿＿中有更详细的描述，该专利申请属于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同时列出并全文引入本文作为参考。在下文中将一个具体的含有编码BikDD突变体序列的突变型Bik构建物称为CT90-BikDD。该构建物与一个荧光素酶报告载体共转染入乳腺癌细胞系MDA-MB-231和468，以及正常的乳腺上皮细胞系184A1中，然后用荧光素酶活力试验来确定细胞杀伤效果。CMV启动子控制的BikDD载体(CMV-BikDD)和空白载体分别用作阳性和阴性对照。CMV-BikDD对所有三个细胞系的杀伤程度几乎相同，而CT90-BikDD优先地杀伤乳腺癌细胞(图10)，表明CT90-BikDD的杀伤效果对乳腺癌细胞具有选择性。因此，CT90可以用于靶向乳腺癌的基因治疗。
接着，对该靶向乳腺癌基因治疗的抗肿瘤效果进行了体内评估。将乳腺癌MDA-MB-231细胞接种至乳房脂肪垫后一周，每周一次用脂质体复合的CT90-BikDD对裸鼠进行治疗(治疗组)，用CMV-BikDD治疗(阳性对照)，以及用CMV-PGL3进行处理(模拟处理)，或用右旋糖缓冲液D5W进行治疗作为未处理对照。每只小鼠静脉内注射15□g脂质体复合的DNA构建物，每周一次，并定期测量肿瘤体积。与CMV-BikDD或CMV-PGL3组相比，CT90-BikDD治疗组表现出更显著的肿瘤抑制效果(图11)。
在原位小鼠模型中也表现出了CT90-BikDD乳腺癌构建物的治疗效果，其中脂质体复合的CT90-BikDD靶向乳腺癌细胞(图12A)。将脂质体复合的CT90-BikDD或CMV-BikDD构建物施用至携带MDA-MB-468乳腺癌异种移植物的小鼠体内。注射后72小时处死小鼠，并将肿瘤和主要的器官取出并固定。在组织切片上进行原位杂交以检测BikDD mRNA的表达。显示了肿瘤和心脏的检测结果。箭头表示阳性细胞。图12B和12D中显示了基因治疗期间的肿瘤大小记录结果。携带MDA-MB-231乳腺癌异种移植物的小鼠接受15-μg脂质体复合的CT90-BikDD、CMV-BikDD、空白载体pGL3、或5％右旋糖水溶液的治疗，施用方法为静脉注射。每个治疗组包括10只小鼠。小鼠每周接受一次治疗(QW，图12B)或每周接受两次治疗(BIW，图12D)，治疗持续8周，每周2次测量并记录肿瘤大小。图中显示了T-测验得到的CT90比pGL3的p值(P(CT90pGL3))以及CMV比pGL3(P(CMVpGL3))的p值。图12C和12E显示了QW组(图12C)或BIW组(图12E)小鼠的存活记录。第八周开始停止治疗，而小鼠则继续饲养直至它们出现研究机构规则所定义的病态。每周记录存活的小鼠数量。
用Bik-DD在MDA-MB-468异种移植小鼠中进行的基因治疗结果显示于图13中。携带MDA-MB-468乳腺癌异种移植物的小鼠接受15μg脂质体复合的CT90-BikDD、CMV-BikDD、空白载体UK21、或5％右旋糖水溶液的治疗，施用方法为，例如，静脉注射。每个治疗组包括10只小鼠。小鼠每周接受一次治疗，持续8周，每周2次测量并记录肿瘤大小。
转铁蛋白受体的乳腺癌特异性表达本发明人还在名为“癌症特异性启动子”的美国临时专利申请60/＿＿(属于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同时列出并全文引入本文作为参考)中表明，至少有部分的转铁蛋白受体(TR)启动子，如含有SEQ ID NO27(CTR116)的序列，具有乳腺癌特异性，而且在与，例如，CMV启动子增强子(SEQ ID NO25)联合应用时，它能够调控突变型Bik的表达，使其具有有效的乳腺癌特异性表达。全长CTR116对照序列(SEQ ID NO38)含有操作性连接于SEQ ID NO27的SEQ IDNO25。
在本发明的其它实施方式中，还进一步分别缩短CT90和CTR116元件来确认其中能够保持乳腺癌特异性表达活性的更小片段。例如，可以对这些区域分别构建缺失构建物，并检测它们的组织特异性，以确认仍然保持能够指导在乳腺癌组织中表达的更小片段。
突变型Bik的胰腺癌特异性表达本发明人可以利用胰腺癌特异性启动子序列来调控编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸的表达。本文已述一个特殊又典型的胰腺癌特异性启动子，该启动子在名为“癌症特异性启动子”的美国临时专利申请60/＿＿中有更详细的描述，该专利申请属于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-MingRau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同时列出并全文引入本文作为参考。
通常，可操作性连接的最小CCKAR启动子和可操作性连接于WPRE的TSTA构建物(其中，TSTA序列可以是，例如，Gal4VP2)调控突变型Bik多肽的表达。这种两步转录放大(活化)(TSTA)序列优先地提高细胞启动子如CCIKAR的转录活性(Iyer，Wu等2001；Zhang，Adams等2002)。在该系统中，第一步包括融合蛋白，例如GAL4-VP16或GAL4-VP2的组织特异性表达。第二步，GAL4-VP16或GAL4-VP2反过来驱动在最小启动子中GAL4应答元件调控下的目标基因的表达。TSTA序列也可以包含G5E4T序列(SEQ ID NO36)，举例说，它可以包括5个17-bp的GAL4结合区，该结合区位于距离腺病毒E4基因TAT盒23个碱基的位置(Carey等，1990)。也可以在胰腺癌中应用突变型Bik的转录后调控，该方法使用一个调控元件，如WPRE。因此，胰腺癌特异性表达的组合构建物包含在SEQ IDNO34中，其至少包括CCKAR(SEQ ID NO28)，GAL4-VP2(SEQ ID NO30或SEQ IDNO33)，G5E4T(SEQ ID NO36)，以及WPRE(SEQ ID NO29)。
在本发明的具体实施方式
中，以类似的方法产生构建物，这些构建物包含这些或类似的胰腺特异性启动子，这些启动子连接于编码突变型Bik的多聚核苷酸，接着将构建物导入需要接受胰腺癌治疗的哺乳动物体内，所用的方法与本文所述的相似。本领域技术人员很容易优化实验参数，如递送模式、组合物浓度等。
本发明的其它实施方式中，进一步缩小胰腺癌特异性元件以确定一个或多个仍能保持胰腺癌特异性表达活性的更小片段。例如，可以对这些区域分别构建缺失构建物，并对它们的组织特异性加以评估，以确认仍能保持能够指导在胰腺癌组织中表达的更小片段。
突变型Bik的前列腺癌特异性表达采用前列腺癌特异性启动子序列来调控编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸的表达。本文已述一个特殊又典型的胰腺癌特异性启动子，该启动子在名为“癌症特异性启动子”的美国临时专利申请60/＿＿中有更详细的描述，该专利申请属于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同时列出并全文引入本文作为参考。在具体实施方式
中，使用前列腺癌特异性启动子，该启动子能够以独立于雄性激素的方式和依赖雄性激素的方式调控突变型Bik的表达。
通常，hTERT启动子操作性连接于两步转录放大(活化)(TSTA)序列，该序列优先地提高细胞启动子的转录活性(Iyer，Wu等2001；Zhang，Adams等2002)。可以使用GAL4-VP16融合蛋白或GAL4-VP2融合蛋白。在该系统中，第一步包括GAL4-VP16(或GAL4-VP2，例如)融合蛋白的组织特异性表达。第二步，GAL4-VP16反过来驱动在最小启动子中GAL4应答元件调控下的目标基因的表达。使用TSTA优先放大转基因的表达水平。启动子还含有ARR2前列腺癌特异性元件(SEQ ID NO31)。将土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调控元件操作性连接于pARR2-hTERT-TSTA以产生pARR2.hTERTp-TSTA-突变型Bik-WPRE，WPRE的转录后调控包括RNA多聚腺苷酸化、RNA输出、和/或RNA翻译(Donello，Loeb等，1998)。本发明的一个具体方面中，启动子在雄性激素依赖性和非雄性激素依赖性的前列腺癌中均发挥功效。因此，用于前列腺癌特异性表达的组合构建物包含在SEQ ID NO35中，其至少包括ARR2(SEQ ID NO31)、hTERT(SEQ ID NO32)、GAL4-VP2(SEQ ID NO30或SEQ ID NO33)、G5E4T(SEQ ID NO36)、和WPRE(SEQ ID NO29)。
在本发明的其它实施方式中，进一步分别缩小前列腺癌特异性元件以确定一个或多个仍能保持前列腺癌特异性表达活性的更小片段。例如，可以对这些区域分别构建缺失构建物，并检测它们的组织特异性，以确认仍能保持能够指导在前列腺癌组织中表达的更小片段。
实施例12临床试验本实施例涉及单独使用Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸，或与其它抗癌药物联用来开发应用于人体治疗的方案。Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸，以及抗癌药物治疗可能在多种癌症的临床治疗中发挥作用，包括，例如，转化的或癌变的细胞参与的Akt活化。这种治疗将会成为抗肿瘤治疗中极其有效的工具，例如，在治疗对传统的化疗方法具有抗性的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、结肠癌和肺癌的患者时。
根据本发明公开的内容，本领域技术人员可以了解实施临床试验的各种要素，包括患者的治疗和监控。所提供的以下信息作为通用方针使用于临床试验中构建所使用的Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸。
选作临床研究对象的罹患晚期、转移性乳腺癌、上皮卵巢癌、胰腺癌、结肠癌或其它癌症的患者应当是典型的具有癌症发生高风险的患者，他们应当先前接受过对于现在复发的癌症的治疗，或者至少对一种传统疗法没有应答。在一个代表性的临床方案中，患者可在胸膜或腹膜腔内安装Tenckhoff导尿管或其它合适的装置，并进行一系列的胸膜/腹膜泻流。通常希望确定没有形成已知的胸膜或腹膜腔的小室，肌苷水平低于2mg/dl，以及胆红素水平低于2mg/dl。患者应当表现出正常的血凝分布图。
关于Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸，以及其它的抗癌药物的给药，可以在胸膜腔或腹膜腔内安置一个Tenckhoff导尿管或其它装置，除非在先前的手术中已经安放了这样的装置。可以获得胸膜或腹膜液的样品，这样就能评估并记录细胞结构(cellularity)、细胞学、LDH和合适的体液标记(CEA，CA15-3，CA 125，PSA，p38(磷酸化的和未磷酸化的形式)，Akt(磷酸化的和未磷酸化的形式))以及细胞内标记(Bik突变蛋白、肽或多肽或编码这些的核酸)的基线水平。
在相同的方法中，Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸，可以单独给药或与其它抗癌药物联用。可以是在胸膜/腹膜腔内给药，直接给予至肿瘤中，也可以系统性给药。起始剂量可以是0.5mg/kg体重。在没有＞3级的毒性作用下，可以以每剂量水平治疗三个患者。可以以100％的递增增加剂量(0.5mg，1mg，2mg，4mg)，直至检测到药物相关的2级毒性作用。此后，可以以25％的递增增加剂量。如果对于任何患者所确定的Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸部分以及抗癌药物部分的联合内毒素水平超过5EU/kg，则可以将给药剂量等分成2份灌注液，两次给药间隔为6小时。
Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸，和/或其它抗癌药物的联合治疗，可以在短时间内灌注给药，或者以恒定的速率在7至21天的时间内灌注给药。对于Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸，可以单独灌注，或者与抗癌药物和/或像大黄素之类的酪氨酸激酶抑制剂联用。任何剂量水平的灌注都依赖于各水平下达到的毒性级别。因此，如果在任一次灌注后或在稳定速率灌注的特定时间达到II级毒性水平，则应当停止给予以后的剂量或者停止恒定速率灌注，除非毒性水平有所改善。对患者组持续给予剂量递增的Bik突变蛋白、肽、或多肽或编码Bik突变蛋白、肽、或多肽的核酸(与抗癌药物联用)，直至大约60％的患者表现出任何类型的不能接受的III级或IV级毒性水平。该剂量值的2/3则定义为安全剂量。
当然，应当在治疗开始前和大约3-4周后的一定时间间隔，对患者进行身体检查、肿瘤测量、和实验室检测。实验室研究应当包括CBC、分化和血小板计数、尿液分析、SMA-12-100(肝和肾功能测试)、血凝分布图、和其它任何合适的化学研究，以此确定疾病程度，或确定现有症状产生的原因。同样也应当监测合适的血清生物学标记，例如，CEA，CA 15-3，p38(磷酸化和未磷酸化的形式)和Akt(磷酸化和未磷酸化的形式)，p185等。
为了监测疾病的进程以及评估抗肿瘤反应，考虑应当每4周检测患者合适的肿瘤标记，如果开始时标记水平是异常的，则每周2次检测CBC，分化和血小板计数持续4周；然后，如果没有观察到骨髓抑制现象，则进行每周检测。如果任何患者出现长期的骨髓抑制现象，则建议实施骨髓检查以排除肿瘤侵入骨髓造成全血细胞减少症的可能性。应当每4周获得一个血凝分布图。应当每周进行SMA-12-100。第一次给药后的72小时，可以对胸膜/腹膜导出液进行取样，并在此后的第一、二个周期中每周取样检测，然后每4周检测，直至疾病恶化或研究结束。可以评估细胞结构、细胞学、LDH和合适的体液标记(CEA，CA15-3，CA125，ki67和Tunel试验来检测凋亡，Akt)以及合适的细胞内标记(Akt)。当出现可测量的疾病时，每4周记录肿瘤的测量。每8周应当重复进行合适的放射研究以评估肿瘤的反应。治疗开始后的每4周和8周以及研究结束时都重复进行肺活量测定和DLCO。每4周可以进行尿液分析。
可以用可接受的计量方法来定义临床反应。例如，完全反应可以定义为所有可测量的疾病消失至少1个月。而部分反应则可以定义为所有可评估的肿瘤节结的垂直直径乘积(product)之和减少50％或者更多，或者至少1个月内没有肿瘤位点显示出体积扩大。类似地，混合反应则可以定义为所有可测量病灶的垂直直径的乘积减少50％或者更多，与此同时在一个或多个位点出现恶化。
参考文献本说明书所提到的所有专利和出版物表明了本发明涉及领域技术人员的水平。所有纳入本文作参考的专利和出版物以同样程度纳入，就象各出版物特定和单独纳入作参考那样。
专利美国专利No.4,683,202美国专利No.4,797,368
美国专利No.4,879,236美国专利No.5,139,941美国专利No.5,220,007美国专利No.5,284,760美国专利No.5,354,670美国专利No.5,366,878美国专利No.5,389,514美国专利No.5,635,377美国专利No.5,641,484美国专利No.5,670,488美国专利No.5,789,166美国专利No.5,798,208美国专利No.5,830,650美国专利No.5,871,986美国专利No.5,925,565美国专利No.5,928,906美国专利No.5,935,819出版物Anderson，L.M.，Krotz，S.，Weitzman，S.A.，和Thimmapaya，B.(2000).用转录靶向方法进行的白色念珠菌胞嘧啶脱氨酶基因的乳腺癌特异性表达，Cancer Gene Ther 7，845-852.
Bartke，T.，Siegmund，D.，Peters，N.，Reichwein，M.，Henkler，F.，Scheurich，P.，和Wajant，H.在DLD-1细胞中，p53上调cFLIP，抑制NF-kappaB-调控的基因的转录，以及诱导胱冬酶-8依赖性细胞死亡，Oncogene.20571-80.，2001.
Boyd，J.M.，Gallo，G.J.，Elangovan，B.，Houghton，A.B.，Malstrom，S.，Avery，B.J.，Ebb，R.G.，Subramanian，T.，Chittenden，T.，Lutz，R.J.，等Bik，一种新型的死亡诱导蛋白，与Bcl-2家族蛋白共有独特的序列结构域，并与病毒和细胞促存活蛋白相互作用，Oncogene.111921-8.，1995.
Carey，M.，Leatherwood，J.，和Ptashne，M.一种强效GAL4衍生物在体外远距离激活转录，Science 247710-712，1990.
Daniel，P.T.，Pun，K.T.，Ritschel，S.，Sturm，I.，Holler，J.，Dorken，B.，和Brown，R.死亡基因Bik/Nbk的表达促进皮质类固醇抗性T-细胞淋巴瘤对药物诱导的凋亡的敏感性，并在严重组合型免疫缺陷小鼠中阻止肿瘤生长，Blood.941100-7.，1999.
Desagher，S.，Osen-Sand，A.，Montessuit，S.，Magnenat，E.，Vilbois，F.，Hochmann，A.，Journot，L.，Antonsson，B.，和Martinou，J.C.酪蛋白激酶I和II对bid的磷酸化调控胱冬酶8对bid的切割，Mol Cell.8601-11，2001.
Emami，K.H.和Carey，M.(1992)多聚VP16转录激活结构域功效的协同增长，EMBO J.115005-5012.
Han，J.，Sabbatini，P.，和White，E.Nbk/Bik，一种含有BH3并与E1B 19K互作的蛋白，对凋亡的诱导，Mol Cell Biol.165857-64.，1996.
lyer，M.，Wu，L.，Carey，M.，Wang，Y.，Smallwood，A.，和Gambhir，S.S.(2001).两步转录扩增作为采用弱启动子时显现报告基因表达的方法，Proc.Natl.Acad.Sci.9814595-14600.
Katabi，M.M.，Chan，H.L.，Karp，S.E.，和Batist，G.(1999).己糖激酶II型一种在人癌细胞中差异性表达和调控的新型肿瘤特异性启动子，Hum Gene Ther 10，155-164.
Klumpp，S.和Krieglstein，J.凋亡中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，CurrOpin Pharmacol.2458-62.，2002.
Lu，H.，Zhang，Y.，Roberts，D.D.，Osborne，C.K.，和Templeton，N.S.(2002).在体外乳腺癌细胞中和体内肿瘤中增强的基因表达，Mol Ther6，783-792.
Maeda，T.，J，O.W.，Matsubara，H.，Asano，T.，Ochiai，T.，Sakiyama，S.，和Tagawa，M.(2001).最小c-erbB-2启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的表达使更昔洛维具有人乳腺癌细胞的选择性细胞毒性，CancerGene Ther 8，890-896.
Mathai，J.P.，Germain，M.，Marcel lus，R.C.，和Shore，G.C.响应E1A和p53引起的凋亡信号转导的BIK/NBK的诱导和内质网定位，Oncogene.212534-44.，2002.
Nettelbeck，D.M.，Jerome，V.和Muller，R.(2000)基因治疗用于肿瘤靶向的设计者(designer)启动子，Trends Genet.16174-181.
Panaretakis，T.，Pokrovskaja，K.，Shoshan，M.C.，和Grander，D.对阿霉素的凋亡响应中，Bak，Bax，和仅含BH3的蛋白质的激活，J Biol Chem.27744317-26.，2002.
Puthalakath，H.和Strasser，A.紧紧约束杀伤者仅含BH3的蛋白质促调亡活性的转录和翻译后控制，Cell Death Differ.9505-12，2002.
Qiao，J.，Doubrovin，M.，Sauter，B.V.，Huang，Y.，Guo，Z.S.，Balatoni，J.，Akhurst，T.，Blasberg，R.G.，Tjuvajev，J.G.，Chen，S.H.，和Woo，S.L.(2002).自杀型基因治疗的肿瘤特异性转录靶向.Gene Ther9，168-175.
Sadowski I，Ma J，Triezenberg S，Ptashne M.GAL4-VP16是一种异常有力的转录激活子.Nature.1988年10月6；335(6190)563-4.
Sato，M.，Johnson，M.，Zhang，L.，Zhang，B.，Le，K.，Gambhir，S.S.，Carey，M.，Wu，L.(2003)最优化腺病毒载体以指导高度扩增的前列腺特异性表达，用于成像和基因治疗.Mol.Ther.8(5)726-737.
Takeuchi M，Shichinohe T，Senmaru N，Miyamoto M，Fujita H，Takimoto M，Kondo S，Katoh H，Kuzumaki N.负显性H-ras突变体，N116Y，在裸鼠肝中抑制转移性人前列腺癌细胞的生长.Gene Ther.2000年3月；7(6)518-26.
Theodorakis，P.，Lomonosova，E.，和Chinnadurai，G.对于人上皮癌细胞中多次刺激诱导产生的凋亡，BAX是其显现的关键必要因素，Cancer Res.623373-6.，2002.
Verma，S.，Zhao，L.，和Chinnadurai，G.促调亡蛋白BIK的磷酸化磷酸化位点的图谱以及对凋亡的作用，J Biol Chem.1717，2000.
Wang，H.G.，Pathan，N.，Ethell，1.M.，Krajewski，S.，Yamaguchi，Y.，Shibasaki，F.，McKeon，F.，Bobo，T.，Franke，T.F.，和Reed，J.C.通过钙调神经磷酸酶对BAD的去磷酸化产生Ca2+-诱导的凋亡，Science.284339-43.，1999.
Wang XP，Yazawa K，Yang J，Kohn D，Fisher WE，Brunicardi FC.由大鼠胰岛素启动子指导的使用胞嘧啶脱氨酶基因进行的对胰腺癌特异性的基因表达和治疗.J Gastrointest Surg.2004 Jan；8(1)98-108.
Wesseling JG，Yamamoto M，Adachi Y，Bosma PJ，van Wijland M，BlackwellJL，Li H，Reynolds PN，Dmitriev I，Vickers SM，Huibregtse K，CurielDT.Midkine和环化加氧酶-2启动子有望用于对胰腺癌进行腺病毒载体基因递送.Cancer Gene Ther.2001年12月；8(12)990-6.
Zhang，L.，Adams，J.Y.，Billick，E.，Ilagan，R.，Iyer，M.，Le，K.，Smallwood，A.，Gambhir，S.S.，Carey，M.，Wu，L.(2002)用于前列腺癌中转基因递送的两步法转录扩增(TSTA)系统的分子工程.Mol.Ther.5(3)223-232.
Zou，Y.，Peng，H.，Zhou，B.，Wen，Y.，Wang，S.C.，Tsai，E.M.，和Hung，M.C.促调亡基因bik的系统性肿瘤抑制，Cancer Res.628-12.，2002.
虽然已对本发明的内容和优点作了详细描述，但应理解可在不脱离本文所附权利要求所确定的思路和范围的前提下，对本发明作出各种变化、替代和改变。而且，并不希望本申请的范围受到此说明书所述的过程、机制、制造方法、材料组成、工具、方法和步骤的具体实施方式
的限制。本领域的普通技术人员根据本发明公开的内容不难理解，可以根据本发明，利用现有的或将来发展形成的、其功能或获得的结果与本文所述的相应实施方式基本相同的过程、机制、制造方法、材料组成、工具、方法和步骤。因此所附的权利希望要求将这类过程、机制、制造方法、材料组成、工具、方法和步骤包括在其范围内。
序列表<110>M.-C.洪(HUNG，MIEN-CHIE)Y.李(LI，YAN)Y.闻(WEN，YONG)<120>突变型Bik的抗肿瘤效果<130>UTFC791WO<140>未知<141>2004-04-02<150>60/459,901<151>2003-04-02<160>38<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>1ggcatgactg acgatgaaga ggacctg 27<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>2gttcttggca tggatgactc tgaacagg 28
<210>3<211>160<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>3Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20 25 30Thr Asp Ser Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35 40 45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50 55 60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65 70 75 80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85 90 95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>4<211>150<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>4Met Ser Glu Ala Arg Leu Met Ala Arg Asp Val Ile Lys Thr Val Pro1 5 10 15His Asp Gln Val Pro Gln Pro Pro Val Ala Ser Glu Thr Pro Ser Met20 25 30Lys Glu Pro Val Arg Asp Val Asp Leu Met Glu Cys Val Glu Gly Arg35 40 45Asn Gln Val Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Leu50 55 60Cys Leu Arg Ser Pro Arg Leu Val Gln Leu Pro Gly Ile Ala Ile His65 70 75 80Arg Leu Ala Val Thr Tyr Ser Arg Thr Gly Val Arg Gly Ile Phe Arg85 90 95Ser Leu Ile Arg Ser Leu Thr Asn Leu Arg Glu Asn Ile Trp Ser Trp100 105 110Arg Val Leu Thr Pro Gly Ala Trp Val Ser Pro Asp Gln Asp Pro Gly115 120 125Gln Leu Phe Pro Met Val Leu Leu Val Phe Leu Leu Leu Gly Gly Ala130 135 140Trp Tyr Leu Gln Leu Gln145 150<210>5<211>21560<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物
<400>5tgatcagcat attgtcttgg gattttgcaa agtaaataag tactgtattt gcacccactc 60tgcccttgaa tcatccagtg tccccaaacg gtccttcttt ctccatcttt tctgctaatg 120tttactgaac atctcctaca tacctggcac tgtgcctcca gccttaagac ccctctgcaa 180gcatctcaca tatatcaggt ctttcggacc catgagaccc cgtgtcattg ctttacctcc 240ctgagtctca attttttcat ctgcaaaatg cattcagagg gaagccccca ttatgaaggg 300ttccctactc ctgactgtaa ggcactctgt ggctgttagc cacagtcagg gcgagctgct 360ttgtaggggt tgatgtagtt tggaggccct agaagaaaag actacagggc cgggagtggt 420ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg agcccgaggc cggtggatca cctggtgtca 480ggagttcaag accagcctgg ccaatatggc aaaaccccgt ctctactaaa aatacaaaaa 540ctagccgggc atggtggcac acgcctgtaa tccagctact aggggggctg aggcgggagg 600attgcttcaa cctgggagac agacgttgca gtgagccaag attgtgccac tgcactccag 660cctgggcaac agggctagac tctgtctcaa aaaaacaaaa acaaaaacaa acaaaaaaac 720cccacaaaag caaagaaggt ccagagcccg gaaggcggga ggggctctga agactttatc 780acactttacc tcctctgttc ctcccaacag cccagctctt ggtaggtgct gttgtccatt 840tcacagatga gaacattgaa ggggaagtaa ttaccctaga ggtgggaaga acagagtgag 900ggtacccaac aggtagcaaa cgacagagct gggggagggg aacccctgtc cctgcccctc 960ccctaatctc tgaggggatc aagacagaag taaacaagct ttgccgtgcc caggacaatt 1020gttactttgt tattccagga gcgctctgcc ttctcccacc cccaatatac cccagggctg 1080gagttaggtc ctacccatcc ccgcgtagca ggctgcccac ccgcccaccc cgcctggaag 1140ctttctgatt tctctgttcg ccccgccagg cgctgtgggg tccgtctcac caggtctgca 1200cgtgagcccc ctgcccccaa tccctcccag tcccgcccgc ctctcgcgga cccggagccc 1260cgacgggagg gggaaggcag tgggtgtgtc atgcagctgg aaggctgcgg acgggcggca 1320gtggaggggc agccccctgg cttcgggtat ggatcactgg atgctgctgc taaccaaatg 1380tgaacctcgg ttttcatatt tgtgaaatag gcttaaaaac acctaaatcc caaagctgcc 1440agcctaagga gcacacgtct ttgaacgctg gcttcacgct gtcatttaag tcatttcgtc 1500ctcttggagc ctcggtttcc acgtgggtaa aatgatcgtg aaaaaaagca ccgaggagta 1560ctttgagctc gaacggaggc catccgtgta aagggccaga ttctgtcaat ggatcgatcc 1620ccccgatatt gatggaaacc cctgagtgca cgcccgtgct gggcgcaggg gaaacagcga 1680cgcacgggac aaaacaagct tgcagaacag cagggggcag agaggctgta aacaagccaa 1740cgggctgcac ttgtagcggt tctgttgcca atgccattca gaccccagtc cgggattccg 1800cgctcggggt gcgagaggcc gctcccgggg aggggcggga cccgggcggg gcgggagggg 1860cggggcgccc gggcctatta ggtcccgcgc cggcagccgg gccgcagaca cgaagcctcc 1920cgggtggctt acagacgctg ccagcatcgc cgccgccagg tgagtgcccc cgaccctgct 1980gccgcccgct gctccgccca gctcgagccc ggcggttagc gcccaggccg cggcccgggt 2040gccgagcggc tggaagtgtg gggagccgtg cccaggtttt accgctccag caagtcgctg 2100gcggggcgac gtctcgggac tccggctccg aaacgtaccc tctctgtccg gggctccagg 2160tccccgacgg gcgatcgtgc caggcgcggc ccctgcgggc ctcagtctcc gcgcctgtgc 2220aatggggtgg tccctctgcg tctcgccgcg acggctggac gccccatcgc cgccgcacag 2280tcctccagtg cggcttccgg gcacccggct ccgaactctg gggtcgtgcg gacccggcca 2340gaccgtagcg cggcaacgcc agcccacggc cgcggccgca cagccccggt gcccttaaaa 2400gagggaagat ggcgtcgtgc ccggtgccgc cgggaccggc tcccggaggc gctgcgcacc 2460tgaggaaggg ccgaggaaag gcttcgtaac gggacgccca gaaagtccgg aacaggaacg 2520tgcacacgga gcggcgcgca gccgcccgcc ctcgcttgcc cacgcgccct gcacaggtgc 2580
gccccagact gggcggggac tagagcccgg ctggggcatg cgaccttgtt tggtaaattg 2640gaggtgcgcc cctgcgggtg acccgcgagg gggccccccg cctgcggggc gcggtcacga 2700caaggcttgt ggggttcgga gctggtcgtc gtctgggctc tggcctccta aatgcgatcg 2760ctttcaagcc cttcattgtc aattttgcta gaatgagcca ctcgtggggt aggacgtggt 2820tgttgatgtt actgttgtag ctcttactat tgtaacattt ttgttgctgt tttaacgcag 2880tgtttactgt ggtctgggag cccgagcttc ccagggagca ttggtgtcag cctcatgtcc 2940ccgcattagg aggagcgcag tctggtgggc actagcgccg ggaagttctt aacatctgtc 3000tgcccctggg agcaggaggc ctcatcttcc aggtggagaa acagagattt cagtcccagg 3060aggcacagaa atgccagggt tgtctagcta gaagccaagg gccctttatg gaacccaagc 3120caaaacctct ttccactctc cagccctgtg gcctcggaag ggccactcca tctctctgaa 3180cctcagtttg ttctgttcac tctgcaaaat gtatccctga ggtttctggc caggtgaaag 3240cccctctcaa gttagtagcc tccctggagt taagactcac cccgatttct acttaatttg 3300ggcacgcctt tggaataagt tctcaggaat ggcacagttt gggtgttttt tgtttctttt 3360tgtttttttt tgaaacagag cttcgctctt gttgcccagg ctggagtgca atggcgccgt 3420ctcggctaac tgcaacctcg gcctcctggg ttcaaacggt tctcctgcct cagcctccta 3480gtagctggga ttacaggcgc ctaccacgag gcccagctaa ttttttgtat ttttagtaga 3540gatggggttt caccatgttg gccaagctag tctcgaactc ctgacctcag gcgatccacc 3600cgcctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgacc caccccgccc ggcttgagtg 3660tttaaatact cctgcctcag cctcccaagg tgctgggatt acagacgtga gcccctatgc 3720ctggcccttt tttttttttt aattgtctta aggatgttaa gactaagatt ctcacacatt 3780tgactcgtgc ctgtaatcct agcactttgg gaggctgagg caggaggatt gcttgagctc 3840aggagactag actgggctag accagactgg gtaacatggt aaaaccctgt ctctaccaaa 3900aatacaaaaa attaaccggg catggtggca tgtgcctctg gtcctagcta cgcaggaggc 3960tgagttcaga ggcctacctg agcttggagg ggttgaggct gcagtgaacc ctgatcatgc 4020cactgcactc tagcctggga gacagagtga gaccctgtct caaaaaaagg agcattaggc 4080tgggcatggt ggctcacatt tgtaatccta gcactttggg aggccgaggg agatggatca 4140cctgaggtca ggagttgtga gacgagcctg gccaacatgg caaaaccagt ctcttttaaa 4200aatgcaaaaa ttagccggtc gtggtggcgt gtgtctgtaa tcccagctac ttgggaggct 4260gaggcaggag aactgcttga atctgggagg cagaggttgc actgagcgga gatcacacca 4320tggcactcca gcctgggcca catagggaga ctctctgtca aaagaaaatt taaaaaagca 4380tcaaatggta gatccccagt gtctgttaca gcttgggtac tctatggctg gatagagagg 4440ctgcatacat gttagttatt gtaagtttgt ttgttttttt gagacggagt ttcgctcttg 4500ttgcccaggc tggagtgcaa tggctgggaa tacaggcgtg agccacctca cccggctcaa 4560gattcttaca catttgactt gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctaa ggcgggagaa 4620ttgcttgaac ccaggaggcg gagattgcag tgagcagaga tggtgccact gcactcagcc 4680tgggctaacg tgagactcca tctcaaaaaa aaaaaaatta cgtcttgtgt cacagagctg 4740cagataaacc agagactact cataaccgtg tacttttttt ttcccccatt tctgatcccg 4800tctcaacgga aggatgtaat tgaggaaggg cttgattggc cagtgagtct tgaagctgac 4860accactgctg gtggtatttt cccctctccc tggaaagcat cctgttttta gtgaacctat 4920taaatgtgta gacaattaat ggctttttgc ttcccctgct gcagacttag cggatcccat 4980gagattttga ctaccgtctg tgctcagaac agtttgagcc gtatggagga agtctccgca 5040ccagtcttac tgttggtggt caccaggaag ccagcagtgt gtctgaactg gacacatgtg 5100gccacttcct agcctccctt tgtcctgcca ctggttggtt ggggctgggc cctgggagaa 5160acatagaatg tgagcaaatc agtccgtggc ccctaagttc cttgttggcc ccgaggcagg 5220
caggagaggg gcgggcacac agggcagctg attttcctag tgtcaatatt aggatgtgac 5280aatacaaaac accactgggc ctcgccaggc actgcatggt aaacctgttt ttctgggggt 5340gggacagaac ttggcaccca gttagccaaa ctgaaaagcc atgcagcaaa gagagaaaag 5400ctcacttgtt tatttgagtg agggtccctg tcattttgga tatttaagat caagtattct 5460tgaccgcccc ctccccgaga tggagtcttg ctctgttgcc caggctggag tgcagtggtg 5520tgatctcagc tcactgcaac ctctgcctcc cgggttcagg tgattctcct gcctcagcct 5580cccgagtagc tgagattaca ggcgcgtgcc accacaccag gctaattttt gtatttttaa 5640tagagatggg gtttcaccac gttggccagg ttggtcttga actcctgacc ttgtgatccg 5700cccgcctcag cctcccaaag tgctgggatt acaggtgcga gccaccgtgc ctggccaaga 5760gatgacattt attgtgtgtg acagtatctt cgagattaga ggctcccttt catgtgaggg 5820caaagagagc tacctgattc caggaggagc tgaaattccc tgtgcagaca atggcgcatc 5880atgaagataa atccgagctc ggaccgtgag gtggtcagca cgggtgtgcg cctcgcagag 5940caacaggctc acagaatgag agctgcctct tagtgggcac ttactgcata ccatgcatgc 6000agcatttcac ctccttctca gggctacatc tgcccatggg gctttccctc ctgcccttta 6060acagaaggtg atactgtcca gtccagggtc tcccagccag gaacagcctg ccatcgtgag 6120cccagcacca gagtaacccc ttccctcatt ctcaggattt tgcagtgaac tctcaggctg 6180tctgcatcct ctcaccggct ttcactgggt ccctgctctg ttctggggcc atgcaggttc 6240ccgactggct ggggcagaca cacaggtaaa catttaacga gaccttgatg ggctgagtgc 6300ccaatccagg tctgtttacc caaggtgctg ggacaacaca gatgaggagc atttaattct 6360gtcctgggga gggtggggag gaagtgactt gtgcctgagc cccaaggaag cagtgagtcc 6420cccgtgcctg cctgggggat gttggtaaca gagggaggat gtaaaggagg agctggggtg 6480tgaaagggct gggtgcaagt tcatagggga gacccaaaca ctgaagtgga gcccaggggc 6540cgtacctgcc tctcaagcct cagggtcggg gccagggtga gcagtcttca tattcttcag 6600cctcagcatt tcagaacttg ttttattttt tttttgagat ggagccttac tcctgtcgcg 6660ggggctggag tgcagtggcg cgatctcggc tcactgcaac ctccacctcc tgggttcaag 6720tgattctcct tcctcagcct ccctagtagc tgggattaca ggcgtgcgcc accacgcctg 6780gctagttttt gtatttttag tagagatgag gtttcgccat gttggccagg atggttgtga 6840actcctgacc tcagttgatc cacctgcctc aacctcccaa agtgctagga ttataggtgt 6900gagccaccgc gtctggccta ttttttattt ttgattgagt cttgctctgt tgcccaggtt 6960agagtgcggt ggcacgatct tggctcactg caacctctgc ctctcaggtt taagtgattc 7020tcctgcctta gtctcccgag tagcttggac tacaggtgcc cgccaccacg cccggctaac 7080tttggtattt ttagtagaga cactgtttca ccatgttgac cggggggtct tgaactcctg 7140accttagttg atccatctgc cttgacctcc caaagtgctg ggattacagg agggagccac 7200cgcgccccgg cccagaactt gttttaaata tgaacttttg aaacttaaca actgtaggcc 7260caggtggtgg cttggcattc tctgcttcct tcatggtgat aaaaaggcac aggcttcccc 7320tttttggggt catttcaaaa tcagtcaaga gaattattag tctgttagac ttcctctacg 7380gttaggatta tttttatagg tgttcgaaca ggaaaggaca tagaataaaa tctcctcccc 7440taacttattg atacagggtc tcactctgtc gcccaggctg gagtgcagtg gcgcagtcac 7500agctcactgc agcctcaacc tcctgggctc aagtgatcct ttcgccttgt gctcttaaag 7560tgctgggagc ctccaaaagg ctaagctgtg acgttgggta ggttacatgt attaaatgca 7620tttttttttt tttgagacag ttttgttctt gtcacccagg ctggagtgta atggcataat 7680ctcggctcac tacaacctct gcctcccagg ttcaagtgat tctcctgcct cagcctcccg 7740agtagctggg attacaggcg cccaccccca cgcccggcta atttttgtat ttttagtaga 7800gacagagttt caccgtgtta gccagaatgg tttcgatctc ctgacctcgt gatccgcccg 7860
cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gcgtaagcca ccgtgcccgg cctggtgaaa 7920ccccgtcttt actaaaaata caaaattagc caggtgtggt ggcgtgcacc tgtagtccca 7980ggtacttggg aagttgaggt ggaaagatca cctgagccca gggaggtgga gactacagtg 8040agccatgttc atgccactgc actccagcct gggtgacaga gagaccctgt ctcaaaatag 8100taatactcca tattgggcct ctcacagggg aatcttgggg ggagctgcag ctcagggtga 8160ctcccatctt gtcactagcc aggtgacccc ttcattctgg agccttagct ctgaaagccg 8220caggtggggg tgccgtttca gatgcccctt ttccatttca aaggctctga ttctagatct 8280tgaagccgga tgcggcactg gcacttggct tcagtttcca ctgtgacgga cggaggtctc 8340ccaggcccag cccaggcagc caagcccatc ctggaatcag aacacgctga gcacattttg 8400tagggtggca cctttttatc caagttacta gctacacatc agtgtttaaa gagaaaaaag 8460tgagctgtct tttttttttc ttgaaacttg aggaaacaag gtacatacta cggatttttt 8520tttttctttt tctttttttt ttttgagaca gtctcactct gtcgcccaga ccggagtgtg 8580gtggcatgat ctcggcttac tgaaagctct gcctccaggg ttcaagccat tctcctgcct 8640cagcctcccg agtagctggg actacaggcg cccgccacca cgcccagcta attttttttg 8700tatttttagt agagacaggg tttcactgtg ttagccagga tgctctccat ctcctgacct 8760tgtgatctgc acgcctcaac ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccaccgcgcc 8820cggcccatat tttttttttt tgagatggag tttttcgctc ttgtcgccca ggttggagtg 8880taatggtgtg atctcggctc actgcaaact cctcctccca ggttcaagcg attctcctgc 8940ctcagccacc cgagtagctg gattacaggc gcgcaccacc acacctggct aatttttttt 9000gaaacggggt agagacggag ttttattacc atgttagtca ggctggtctt gaactcctga 9060cctcatgatc tgcccacctt ggcctcccaa agtgctggga ttacaggtgt aagccaccgc 9120ggctggccca tttcatatat ttttaaaatt ttttattgtt aatttatttt tagagagggg 9180gtctcgttgt attgcccagg ctggtcttga actgggctcg tgcgacgtgc ccgcctcggc 9240ctcccgaagg gctgtgatga cagcacagcg gtgcctgtga tctatggctt caatttttca 9300aggctgccag gtccatgcag gggtgtgtgt gggatgcatc cctagaaatc aaaggtcatg 9360tgcgtgtgtg actggtggat gctgatggtc acactaccct ccagaaaggc agcaacatgt 9420tcagtccacc gtggcgtcct gagctgtgag tggcctctgg tctcctctct tctaaggctg 9480ttgattgtgt taaccagctt ttatggagcc cctgctaggt ggtggaaaat gggcagtagt 9540gtatgttttc atcctctcag cagccctgga ggcccggctg tttctgcaag gctcagaggt 9600gagctggttg ttctgcctca cacagcaggg gccgagcagg gggtggaact gaggtccagc 9660ctggctgcag gctcagggcg tttcctgctg ggttacactg gagttgtgtg cgctccaagg 9720gctttgtgcc accccaccct catggtccag ggccaggctg tgactgggag ggtggcacgt 9780ggaagactgg accagggttt tctagctggg cccactcagc tggccctccc tgtgacccca 9840gcgtggcccc tgaccctctc ggtttgcctg cctgtgaaac aggaagtgtc agatcccgcc 9900tgcttggctt tgacaggact gggcgaggtc atgagagtct gagggtccct accaggagtt 9960cgacctcatc ctcaggtcca gccccatcca cctctgcccc caaccccgct ctgacactcc 10020tgcagcctcg gccctcgaac acctgctgag ggctgagcag aacacatctc tacttgcttg 10080tgcttctggg caacctggga ggggcttggg aggtagatgg cgtttcccca tcttccagat 10140gagccatagg cgagctgtcg agtgcagagc tgttcaccaa atgtaggctg ctctgtccag 10200aacctgccct ccctcccact cggagccctg caggtgccct caaggccgtg ggtgtggtac 10260tcttttctgc acatactaga tttgcatcct aacctcttag ggtaaaatag ggcttctgac 10320tggcgcctgg tgtttccact ggtgagtgtg taggaggcta agtgcgggct gtagcctggg 10380tggggacaca tggctaggtg tgtcttcctt caccaaagaa gggtttcaac tactcatttg 10440caagtttgct ggaaaaaaaa agataataaa aaccagtcca gtttcctgta tctgcagctg 10500
cagtgacctc acagtgggtc ctctgggaat aggttgcctt catgtcttca gtcaacaaac 10560atatgtctgc tctatgccag gccttgggct gacaaccaga aactgataag agcagcagcc 10620cctctcttag cggtttactc tgtgccggat catttcatcc ccacaacagt cctgtgcaat 10680aggtgttact agtatctcca ttctaatttt ttttttttct gatatggagt cttgccctgt 10740agcccagcct ggagtgcagt ggtcagctgg agccagaggg gagcagagac aggggctgca 10800ggacccccag gaggccccca agcagactct gagggtccaa gaaggtgatg cccgaatagg 10860ccagcctcat acccatcctc tcagtacttt gggaggccca ggcgggagtt gaagccagga 10920gttccgagac aagcctgggc aacaaagcaa gaccctatct ctacagcaat tctataaaaa 10980tgagccaagt gcagtggtac atacctgtcg agttaccctg gaggctgagg tgggatgatt 11040acctgagccc aggagtttga ggctgtagtg agcatgatca ggccactgca ctccagcctg 11100ggcaaacggg tgagaccctg tctgtgaaaa aaataataat aaaatttaat ttttaaaaaa 11160ggaccaatag gcgtaggcat gggccggtct gaggttggct ggtgagctct gcacatttga 11220agactttgga ggcatggcag gaccaggcac catccatgga aagcatactt gagtgtggtt 11280agcgcgggaa ccaagattgg ggtggcaggg ccacaggggg agggcctgtt agtggatgtg 11340gcacaacccc ccacttgttt ttgagacaag tcttgctctg tcacccaggt tggagtgcaa 11400tggcgcggtc tcggctcact gcatattctg cctcctggat tcaagtgatt ctcctgcctc 11460agcctcccaa gtagctggga ttataggcga gcgccaccac acctggttaa tttttgtatt 11520tttagtggag atggcgtttc accatgttag ccaggctagt ctcaaactcc taagctcagg 11580tgatccacct gcctccacct ctcaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc gcactgcacc 11640aggccaggtc tagggagccg aacagagcag tgacagggtc agggttgagg ctgctacctt 11700gagattaggt tggagagagc tccactgaag gctggagacc agtaaggcat tcagagctgg 11760tgccaggtag gagctgacag gactgggcct cccttgggct ggtggggtgg ccaggagaga 11820ccagagcagg aggtcgctgc tgcaaggacc ctcctgggca ggctccccac cttccgctcc 11880ctggctccac acttttccca tgcagatctg ggccctaagg ccagcctagg cccagttggt 11940gatgggatct ttgccattca tatcaagtca atctgagggc ctgggcccag aggccagatg 12000gttaaaggtt cagattaggt cccttctttg tggtagaggg taatgggtat ttaataaatt 12060aatccaaagt gctgtaatcc cagtactttg ggaggctgag gcgggtggat cacttgagat 12120caggagttga gaccagcctg gccaacatgg taaaaccccg actctactaa aaatacaaaa 12180attagccggg tgtggtggca tgtgcctgta atcccagcta cctgggagtc tgaggcagga 12240gaatcacttg aacctgggag gcggaggttg cacctgagct gagatcacac cactgcactc 12300cagcctgggc aatagagtga gactgtctca aaaacaaaca aacaaacaaa caaaaaaaca 12360ctaccaccaa caaaaacaca atagatgggg aaactgaggc tggtgcagga agggttgggc 12420tagggtatca acctaaggtg agatgtggtc ctgggtctac tcagatgggg aggttggcag 12480ggtggggagc ttgaaagggt cttgcaggca gagcgtgggt gactgactcc tcaggtaggc 12540ctgacctgca ctctgctgca gaccctcggc agcgcagccc actctggtgg ctggggcctt 12600cttcctatct ggcgcctaag gattctcgga atgcctgctg ggtaaggggg ctgtgggcac 12660agtgggtcaa ggcgaggctc ggtgcagctc acagctcagc tcacagtgag gtgaggttcc 12720actgttgctc tggctttgcg gggcgtggag gtactggggt ctccaggagc acaaagcagg 12780agactgcctt ttcgagggga agggaaaggg gggaaaagca aacaagggct ggagctgctt 12840tcctagggaa atgccatttg catagacacc caaggcagct ggaagttctg gacacagttc 12900ttctaatgcc agcttaacac gcacactgct ggccgtctat acaatgtaaa acatctcatc 12960tgtgaaacct tattttttct ttttgagtca gaatctagct ctgcctccca ggttcaagct 13020gggattacag gcgtatgtca ccacgcctgg ctaattttgt atttttatta gaggcggggt 13080tttaccatgt tggccaggct ggtctcaaac tcctgacctc aggtgatccg cctgtctcag 13140
cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gccaccgcac ccggcccatc catctccctt 13200gaatgctgaa agcaagtcgt gagcacacac ttgtgcctag gcctgtggga gggcggccct 13260gtgggtcctg cctgccgtca gttttctctc tcctgggggt cagggagact tggagctctg 13320tcccttcttg gcttagtcat gaacctctct aagcctcagt gtcctgtgtg aacaaacagc 13380tcagtgagat ggtgggaggg cggagtgtcc tgtcagcagg catggggaat taaaaattaa 13440gaacacccag ggcattatgg taagaaaata atgagttgaa gcataaaggt aatggttagt 13500gccaacttcc tcccagcgtg ccaggccctg ttcaaagtac atgaaggagt tccttatttc 13560gtcttcccaa tagcccaggg cggggctctc agaccatgaa acccatttca cagatgaaga 13620aattgacaca ctgctgctaa ctgccagagc cgggctttga actaggccat tagatttccg 13680tgccacagtc atcgtcatta tcgtcatcta catctaaggc tgtttggtac cctgtagggt 13740aaatgtgggg tacatgatgg tgaatcaggt cgcagaaccc ttctctgcca tcatgatgaa 13800acatgtactg gcatgggatt cgcaatgatc atagttagga aggcctttgg tggcaaagaa 13860gaggaaactc agtgaatggt gatgaggaca catttgggtt catttttctt acacacagtt 13920ggaggagaca gctcagtgac accctcaggc ctggccgctc tctgcctccc cgctctgctc 13980ttcttggtca gccactgcag ctccatcttt gaaggagctg ccctggctgt gtctactccc 14040tggcatccaa cccctgcctc cagcctctga gccctcattg accagaactg ggttacatgg 14100ttgtcaccag ctgcaaggga tgctgggaag ctgagggaga ggagggccat ggttggctta 14160gatgaatgag gatgcagggc caccccgaag aaaattgggg ttctatcagc aaggagccag 14220gtggaatgga tatcggagag gtaaatagca tctgccagta aagaaggctg taagacactg 14280tatggggtga tcccatttgt gaagaaggat gtgtgatgcg cacaagtgtt taggaaaaac 14340actagaagaa ttagcgatgg tctctctggg aatggggatt gtgatacgtt tttctcatgc 14400tgcctctctg cctttcttct caagagaaac agcagacacc aaagaacagg tgtagccttc 14460tgttaagtgg tacagaggaa tcgccctgca gcctggcctc tgtcccctgt gctgacagca 14520ggtgcctggg ttttctgctt tgacaggttc ttgagggctg gtgtccgagg agaacttcta 14580atatttattt atactctgat tttgtttcac aaagaagaaa aaggctgggc gtggtggctc 14640atgtctgtcg tcccagcact ttgggaggcc gaggtggggt ggatcacttt gaggtcagga 14700gttcaagacc agcctggcca acatgatgaa acccccgtct ttactaaaaa tacaaaataa 14760ttagccaggc atagctcatg cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat 14820tgcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaagat tgtgccactg ccctccagcc 14880tccagcaaga ctcagtatcc aaaaacaaag aaagaaagaa agggccctta tgaatcatct 14940tcaagttcct cccttccaag aacagagatg ctaggcgact tgcccagagg cacacagcca 15000gcatgtagca ggattcatgc ctgtgggagc tggggttggg ggatattgac ggctttagcg 15060gatcaaaaga gctggtgagt agggctatac aatctggggg tcatcctgtg agagagcccc 15120cagactgctc agttcttagg ggtccagtca tatgctgtct ttttgcccca gaggagaaat 15180gtctgaagta agacccctct ccagagacat cttgatggag accctcctgt atgagcagct 15240cctggaaccc ccgaccatgg aggttcttgg catgactgac tctgaagagg acctggaccc 15300tatggaggac ttcgattctt tggaatgcat ggagggcagg taggtcccca tggcctgccc 15360taccccctgc ctgatagtga cttcaggggt gggctggatg agcagacctt ctgtgagcgg 15420gggagcgcct gcagatgcct cccaggcagg gcctccgaga ggaagatttc ccggatgtgg 15480gcatggaggc ttctgccctg ggagcggctt cactttgctg ccccaccctc ccctgatacc 15540agctcacaga cccctggaca gccagcatgt tcacagtctc aagatggacc tggggcccct 15600ggctgtcaaa atggcacagt gtttgggcct cagggagcta gacaggccct tagcgacctg 15660ctgaggacat cagggcctct tgaaggaggt gactctgttg ccagaaaggg gacccgatcc 15720agatcccaag agagggttct tagatctcaa gcaagaaaga atttgggcca cacgcagtgg 15780
ctcgcgcctg taatcccagc acttagggag gctgaggcag gcggatcact tgaggtcagg 15840agctcgagac cagcctggcc aacatggcaa aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaagt 15900agctgggcct ggtggcacat gtctgtagtc ccagctagtc gggaggctga ggcaaggaga 15960atctcttgaa cccaggaggc agaggttgca gtgacccaag gttgcaaaaa tgcactccag 16020cctgggcaac agagcgagac tccatctcaa aaaaagaaaa cctactctat aggcagagca 16080gcggcatggg ctgctcaact gaatatactt atagttattt cctgattaca tgctaaacaa 16140ggggtggatt attcatgagt ttccgggtaa ggggtgggca gttcccggaa ccgagaattc 16200ctcctccttt tagacaatat agggcaactt cctgacgttg ccgtggcatt tgtaaactgt 16260cgtggcactg gtgagtgact ccaacatgct aatatagttg gtgcacaatg aatagtgagg 16320atgactggag gtcacttttg tgcccatctt ggctttggtg ggctttggct ggcgtctttg 16380ccgaatcctg ttttatcagc agggtctttg taacctgtat cttatgctga tgtcctatct 16440catcctgtga cttagaattc ctagcctcct gggaatgcaa cccagtaggt ctcagccttt 16500tgttacccag cccctaatca agatggagtc gctctggttc aactgcctct gacggctctc 16560attttagaaa accagaaccg ggccgggcgc cgtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt 16620gggaggctga ggtgggcgga tcacctgagg ttgggagttc gagactagcc tggccaacat 16680ggtgaaaccc aacctctact aaaaatacaa atgttaccca ggtatggggc cgggggtggg 16740gggatgggcg ctggtagtcc cagctactca ggaggctgag gcaggaaaat cacttgaacc 16800cgggacgtgg aggttgcagt gagccctgag attgcaccac tgcactccag cctgggtaac 16860agagtaagac tccgtttcac aaaaaaagag aaagagaaaa gaaagaaaga aaaaagaaag 16920aaaaccagaa cctatggaag agcctgagga ggccatgcag ttcctggtcc cggcttcaaa 16980gaatcactga ggcatgaaga agggatcttc cttggactga caaggaccct ggaggcagca 17040ggatttgcct ggggtttcag gggccaaggt ccagtaggac ctgacccttg cactctgcca 17100actgctccca gctatgtcca gcacacggca gcatacccag atgtccaggc acacccggcc 17160atcccagcgg caggaaggac ctgcactttt tttttttttt tttgagacag agtctctgtc 17220acccaggctg gagtgcagtg gcatgatctt ggctcactgc aacctccacc tcccgggttc 17280aagtgatttt cctgcctcag cctcctgagt agctgggagt gcaggcgtgc accagcatgc 17340ccggcttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctgtgt cgcccaggct ggagtacagt 17400ggcatgatct ctgctcacca caagctccac ctccctggtt tacgccattc tcctgcctca 17460gcctcctgag tagctgggac tacaggcgcc tgccaccaca cctggctaat tttttgtatt 17520ttcagtagag acagggtttc atcatgttag ccaggatggt ctcgatctcc tgacctcgtg 17580atctgcctgc ctcggcctcc caaaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc accacacccg 17640gccaggactg gcactttcat tcttcccctg gtacagatga ggaacgtgaa ggcccaggag 17700cagctgacct cagtagtttc taccctgagc ctggaagaga atggtcaggc ctgacctggg 17760ctgttgcttt ctgctgggga atcctgtctc tgatgtggca cctcccacag gccagggacc 17820agctccatgt tccacaggat tcttttctgc tcaggatttt ttttttcagc ctcaggattt 17880ttagtcatta aggattttag aactggaggc acctgtccat taatggacaa ggttggagga 17940catgaagcct ggggcagtat tttcctgagg tttcccaggg taacagaagg taggaccaca 18000gcccccaacc ctgattgcca gcccacacct gtacccctcc cacccgcatc ccctccaagt 18060agggagtgta ggcccagggc attggcaggt caggtgggtg gggccagggc ccagggccgg 18120cctcagctca gggcccctag gagtcccact tccctgggag ttcccccggt gtagtcactg 18180ggatggaatg cacacaggtc cctggtagag gcccagacca gcaagctggg agggtgggga 18240gtgtcttagt ctttgtgtgg gagtgaatgc gggtggggtg taggatcaag gatgtggttt 18300agtggggggc ctactagggg cttcttagtc cccccattcg gagaggggtg gtgccagcag 18360ggctggtttc aggattggga ccaggacaca ggtcttagag ccccctcacc tcccacaaag 18420
gaaggtaagc tgcaacccct gtgggaaggg ggctcaaggg ggctcagcca tccgggggac 18480tcagcaccac cagacctgtc cattcccctt ggtcagcctc agccatccgg gggctcagca 18540cccccagacc tgcctgttcc ccttgtccac catttccacc aaagcccaca ggtgggcctg 18600ccccaggatt ctttttgaaa tagcttgcac ctctggggcc acccacggat gggacctcat 18660gggtatctct gaatccaagt gggagccgga ggagggatac agggaggccc actcactgcc 18720tgccccaaat ctgacaccat ctcttatcct ctgggccact cccagctgca cacaatccgt 18780tggctgggtg ggtccaggtg catgtggcct ccacggcaca gccacacccg actcctgtgt 18840gtgctccctg cagtgacgca ttggccctgc ggctggcctg catcggggac gagatggacg 18900tgagcctcag ggccccgcgc ctggcccagc tctccgaggt ggccatgcac aggtagccgg 18960cctatgccct atgcctctac acctggggag gggccctggg cggtgggtgg aggccctgaa 19020cacagcacag ggctgggccc tgaggaagct ctgtggggga tgtgccttga cactctgggg 19080ctatactgaa acccttggct gcttcccgca cctctcctgg gagcccccag ctcctggcac 19140tcgccccctg ccacctgtcc ctggcattcc tgggcaacaa agcagagccc agggcccttt 19200tctctctcgc cgtcctcatt gagcccagat ggtacatttc caccgtggtc ttaagagggg 19260gtgctacgtg agctcggatc ctagatcctg ggggctgggc ctctcagcga gtctccggtg 19320ggggaataga gtgggcagtg gcttgtgagg gccctgtaga atgggggttt attttccacg 19380tggccagctc tggaagacag ggccaaacac ccggtgggct ggcgggcggc tggctggcgg 19440aggaagcagg aagttggaat gaatttgacc acaaacagtc cataccacgc ggcccctgca 19500ggtggaggcg cccacggaaa gggccccggg tggctgtggg gtgggagggc acaggcccct 19560gctccccaca gctgtgatgg tgtcatctaa gtacaggctg cccctacctg ctcctgcagt 19620aatggctttg tccccccatc ctctttgtct atagcctggg tctggctttc atctacgacc 19680agactgagga catcagggat gttcttagaa gtttcatgga cggtttcacc acacttaagg 19740agaacataat gaggttctgg agatccccga accccgggtc ctgggtaaga gccttgagat 19800ccctgaccct gacttgcgct gcggccagtg ggggctgtca gagccgctcc ttggggcgcc 19860acagtcccca ccactccgta tcatcatctg tgtcacctgt gtccacatct gcctgatccc 19920atgggctttt gggtttgaga tgcctggttc tgagtgcaca aaccagtgca tggtcctggg 19980tctccctctg gtccgagagc cttcacctgg caggcaggac tcccgtctcc tggccagggc 20040aggggcctcc ctgagcagcc ttcctggtag cctggtccca tggtgtccac tcggcaccgc 20100ccaccacaag ggcagctgac tgccctcacc tgtgcccacc gggtgtcttt gcctgtgtcc 20160cgcagactgg caggcccagg ccacgctggc ctctctggcc acgtcctcag ggccactttc 20220cccctctcct gaactccttc cttctctggt cccctcgagc tccttcccag tccccaccct 20280cctgggcttc cccttggcac tccgctgtca cccgtctggc cccattgctg gggcctgccc 20340cgagcctgac tcctctgctt tgctcccaca ggtgtcctgc gaacaggtgc tgctggcgct 20400gctgctgctg ctggcgctgc tgctgccgct gctcagcggg ggcctgcacc tgctgctcaa 20460gtgaggcccc ggcggctcag ggcggggctg gccccacccc catgaccact gccctggagg 20520tggcggcctg ctgctgttat ctttttaact gttttctcat gatgcctttt tatatttaaa 20580ccccgagata gtgctggaac actgctgagg ttttatactc aggttttttg tttttttttt 20640attccagttt tcgttttttc taaaagatga attcctatgg ctctgcaatt gtcaccggtt 20700aactgtggcc tgtgcccagg aagagccatt cactcctgcc cctgcccaca cggcaggtag 20760cagggggagt gctggtcaca cccctgtgtg atatgtgatg ccctcggcaa agaatctact 20820ggaatagatt ccgaggagca ggagtgctca ataaaatgtt ggtttccagc agtctctggt 20880cctctctggg gggttggcag caccagcacg ggcttcctct cgccccaggg aggcacactg 20940tgttggtggg gagggcaggg cctgtgtgct cctaatcaga tccttccctg caaaagggga 21000ccgcaaatgc tgccttggtt tggcccgacg gtttgccttc tcccttgtcc cggtctgtgg 21060
cctaaaatcc actgttgggg gttatttcct ttgggctttc agttcctctt taggggatgc 21120ctgcctctcc ctgcacagac tcctcaccac agggatgcag ccgtggctcc gctcacaggg 21180agaggtgtgg tggggattgg ggagcaggac aaggggcacc aggggcagga gggccaggac 21240cctgctttgt acctttgtag gcttggtacc tgccctgggc cttggcctcg tgccatttgt 21300agaccccacc aggcctccct cccaggacat cggctctgtg tctgccctcc accccaaatg 21360tcaaagctgg gctgggccgg ccaccattct ccagccccca acccccctca tccccagagc 21420tgggagatgc agctgttcat acctcccagg ctggctgggc agaccctgca tcctgctcac 21480tcctccctcc atcctggcct ccaaaccaaa ggggacctcc aataggcttt cctgcctcct 21540tatgtcttct ctccggtctg 21560<210>6<211>963<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>6gacacgaagc ctcccgggtg gcttacagac gctgccagca tcgccgccgc cagaggagaa 60atgtctgaag taagacccct ctccagagac atcttgatgg agaccctcct gtatgagcag 120ctcctggaac ccccgaccat ggaggttctt ggcatgactg actctgaaga ggacctggac 180cctatggagg acttcgattc tttggaatgc atggagggca gtgacgcatt ggccctgcgg 240ctggcctgca tcggggacga gatggacgtg agcctcaggg ccccgcgcct ggcccagctc 300tccgaggtgg ccatgcacag cctgggtctg gctttcatct acgaccagac tgaggacatc 360agggatgttc ttagaagttt catggacggt ttcaccacac ttaaggagaa cataatgagg 420ttctggagat ccccgaaccc cgggtcctgg gtgtcctgcg aacaggtgct gctggcgctg 480ctgctgctgc tggcgctgct gctgccgctg ctcagcgggg gcctgcacct gctgctcaag 540tgaggccccg gcggctcagg gcggggctgg ccccaccccc atgaccactg ccctggaggt 600ggcggcctgc tgctgttatc tttttaactg ttttctcatg atgccttttt atatttaaac 660cccgagatag tgctggaaca ctgctgaggt tttatactca ggttttttgt ttttttttta 720ttccagtttt cgttttttct aaaagatgaa ttcctatggc tctgcaattg tcaccggtta 780actgtggcct gtgcccagga agagccattc actcctgccc ctgcccacac ggcaggtagc 840agggggagtg ctggtcacac ccctgtgtga tatgtgatgc cctcggcaaa gaatctactg 900gaatagattc cgaggagcag gagtgctcaa taaaatgttg gtttccagca aaaaaaaaaa 960aaa 963<210>7<211>160<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>7Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20 25 30Asp Asp Ser Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35 40 45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50 55 60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65 70 75 80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85 90 95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>8<211>160<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>8Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20 25 30Thr Asp Asp Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35 40 45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50 55 60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65 70 75 80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85 90 95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>9<211>160<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>9Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20 25 30Asp Asp Asp Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35 40 45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50 55 60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65 70 75 80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85 90 95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>10<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>10Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp1 5 10<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>11Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val1 5 10<210>12<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>12Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser1 5 10 15Leu Arg<210>13<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>13Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu
15 10 15Arg Ala<210>14<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>14Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro1 5 10 15Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys20 25<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>15aggacccagg tacctatgtt caaaagtgcc tc32<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>16ccttgcctgc tgctttccac caagtgct 28
<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>17caggttggga aaatggtcag ccctcctgaa a 31<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>18cgttctgagg cgggcaatca aatgacctat 30<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>19cccgctagcc taattttatt ttatttttaa ttc 33<210>20<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>20cccctcgagg tattttggaa aaatgtcctt atctag 36<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>21cgcacgcgta ggcatcagct ctctacaatt c31<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>22agcctcgagc aggatctgag ataagaacca cg 32<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>23acggcgctcg agtccatcag ttctcatc28<210>24<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>24ttacttaagc ttgtgtagga cgcctgtc28<210>25<211>452<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>25tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 60cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 120gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 180ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 240ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 300atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 360cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 420acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact ca 452<210>26<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>26agacggtgag agcgagtcag ggattggctg gtctgcttcg ggcgggctaa aggaaggttc 60aagtggagct ctcctaaccg acgcgcgtct gtggagaagc ggcttggtcg ggggtggtct 120cgtggggtcc tgcctgttta gtcgctttca gggttcttga gccccttcac gaccgtcacc 180<210>27
<211>231<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>27cggccgccag tgtgatggat atctgcagaa ttcgcccttg cgatctgtca gagcacctcg 60cgagcgtacg tgcctcagga agtgacgcac agcccccctg ggggccgggg gcggggccag 120gctataaacc gccggttagg ggccgccatc ccctcagagc gtcgggatat cgggtgaagg 180gcgaattcca gcacactggc ggccgttact agtggatccg agctcggtac c 231<210>28<211>1757<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>28ccttgcctgc tgctttccac caagtgctgg agagctggtg aattgctcac tcccggctca 60ttcctctaat gaccgaagcg tctcgcagat gcaacctgcc gtggaggagc agggagggag 120tgatttccag gtgtgggctt tttcagccat tcctaaaggc gacttgagtt cacctcactc 180actccagcat ttgtactcct gttgtggaaa aggcagtgag cacaagccaa gcccgctcca 240ccttcacccc gccccacctc ccccggccct ttcctgggcc agtcttaggg ccctgagtac 300agacagcctg gctacccgtt aaccattctc agcgtgtggc tgctttttac acacatgtgt 360acatatgcac ggacacacac acacacacag aggcttcccc agtactcctc tatataggaa 420cccgtcacca tcccagacat atgcagaaga aagcccaaac cggctgtgtg agacaggaac 480aattaacacg gtaacagatc cgataatgca gaccatcagg cctaaagaac acggagggac 540tgtgttctac ctccttatag aaaagcaatt agtgcctttt tagctttgga accatgcccg 600gtggtgtgtg tgtggacaga actgctggct ggttgttaag ttgctactaa acacagtgtt 660gtttctcgtg gtctctgccc ttgttaacta ggattgaggc acttttgaac ataggtacct 720gggtcctaag ggcgaattcc agcacactgg cggccgttac tagtggatcc gagctcggta 780ccaagctcca gctgggaata gagataggag gggacccagc tggatgcagt gggcagtggg 840ggtcatagag tcaagagggt acagaataca atggggtcct agtatcatgg tggaggtcag 900aaagagccct aaaagagagg gtcaaggtag gaggttagtg aaggtccacc tccaccctct 960ccaggacagg gacatcaggc cacaattaat ttctctgcag ttggtgagtg gtcatggtct 1020ctggagtccc cagcatccag agtgtccctg gtctagtggt cccccctttc tgagccacag 1080ccactttctc catcaaatga ggccagtaat acccatccca tagtgatgct gtgaggatga 1140gatgagcatc tgtaagtgct gaagataatc cctgacacat cccaagcatt cagcagtgca 1200agcatacact tacacggcac tccccagagc caggcatgtg ctggtgcctc atacacgtga 1260
ccacatttga tcgtcacaat gaccctgtga gggagactgt gcaacagagg actgaccttg 1320ctcaaagacc tcaggcgttt cccctcagag cctgagaggt catctctttt tttttttttt 1380tttcctttct ttctttttct tttccatttc tttttctttg caagaggtca tctctaatgc 1440tttggaatat cctgccagat tagagtccct ttgttcacct gaaggtttgg gccacaccag 1500atagtctaac ggtgtgattt gtgctgaagg ttttgagcca cactatatca gctagatttc 1560tagagcggcc ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt 1620gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact 1680agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct atcgataggt 1740accgagctca tttaggt1757<210>29<211>646<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>29aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga 600gctcggtacg ggctcgacta gagtcggggc ggccggccgc ttcgag646<210>30<211>819<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>30ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc ccaagctgtc gatcgacatt 60tctagaggat ctcggacccg gggaatcccc gtcccccaac atgtccagat cgaaatcgtc 120
tagcgcgtcg gcatgcgcca tcgccacgtc ctcgccgtct aagtggagct cgtcccccag 180gctgacatcg gtcggggggg cggatctcgg acccggggaa tccccgtccc ccaacatgtc 240cagatcgaaa tcgtctagcg cgtcggcatg cgccatcgcc acgtcctcgc cgtctaagtg 300gagctcgtcc cccaggctga catcggtcgg gggggcggat cccccgggct gcaggaattc 360cggcgataca gtcaactgtc tttgaccttt gttactactc tcttccgatg atgatgtcgc 420acttattcta tgctgtctca atgttagagg catatcagtc tccactgaag ccaatctatc 480tgtgacggca tctttattca cattatcttg tacaaataat cctgttaaca atgcttttat 540atcctgtaaa gaatccattt tcaaaatcat gtcaaggtct tctcgaggaa aaatcagtag 600aaatagctgt tccagtcttt ctagccttga ttccacttct gtcagatgtg ccctagtcag 660cggagacctt ttggttttgg gagagtagcg acactcccag ttgttcttca gacacttggc 720gcacttcggt ttttctttgg agcacttgag ctttttaagt cggcaaatat cgcatgcttg 780ttcgatagaa gacagtagct tcatctttca ggaggctag819<210>31<211>1352<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>31acagacattg acattgtgtc atctagtata caaataggtt cttggagtac tttactaggc 60atggacaatg cccaatgcct gtcccattct tcaggcatat ttttatttgt gggctttatg 120tccctattaa gaaaaagact aagaacaaga tgctatcata ttttcttaac tggaatggta 180gatgtttaaa catgatgact accaagcttg gctagaacat tgtgtcatct agtatacaaa 240taggttcttg gagtacttta ctaggcatgg acaatgccca atgcctgtcc cattcttcag 300gcatattttt atttgtgggc tttatgtccc tattaagaaa aagactaaga acaagatgct 360atcataagct ccaagcttat cgccagctgg gaatagagat aggaggggac ccagctggat 420gcagtgggca gtgggggtca tagagtcaag agggtacaga atacaatggg gtcctagtat 480catggtggag gtcagaaaga gccctaaaag agagggtcaa ggtaggaggt tagtgaaggt 540ccacctccac cctctccagg acagggacat caggccacaa ttaatttctc tgcagttggt 600gagtggtcat ggtctctgga gtccccagca tccagagtgt ccctggtcta gtggtccccc 660ctttctgagc cacagccact ttctccatca aatgaggcca gtaataccca tcccatagtg 720atgctgtgag gatgagatga gcatctgtaa gtgctgaaga taatccctga cacatcccaa 780gcattcagca gtgcaagcat acacttacac ggcactcccc agagccaggc atgtgctggt 840gcctcataca cgtgaccaca tttgatcgtc acaatgaccc tgtgagggag actgtgcaac 900agaggactga ccttgctcaa agacctcagg cgtttcccct cagagcctga gaggtcatct 960cttttttttt ttttttttcc tttctttctt tttcttttcc atttcttttt ctttgcaaga 1020ggtcatctct aatgctttgg aatatcctgc cagattagag tccctttgtt cacctgaagg 1080tttgggccac accagatagt ctaacggtgt gatttgtgct gaaggttttg agccacacta 1140tatcagctag atttctagag cggccggccg caataaaata tctttatttt cattacatct 1200gtgtgttggt tttttgtgtg aatcgatagt actaacatac gctctccatc aaaacaaaac 1260
gaaacaaaac aaactagcaa aataggctgt ccccagtgca agtgcaggtg ccagaacatt 1320tctctatcga taggtaccga gctcatttag gt 1352<210>32<211>496<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>32ggccgcccca cgtgcgcagc aggacgcagc gctgcctgaa actcgcgccg cgaggagagg 60gcggggccgc ggaaaggaaa ggggggggct gggaggcccg gagggggctg ggccggggac 120ccgggagggg tcgggacggg gcggggtccg cgcggaggag gcggagctgg aaggtgaagg 180ggcaggacgg gtgcccgggt ccccagtccc tccgccacgt ggggagcgcg gtcctgggcg 240tctgtgcccg cgaatccact gggagcccgg cctggccccg acagcgcagc tgctccgggc 300ggacccgggg gtctgggccg cgcttccccg cccgcgcgcc gctcgcgctc ccagggtgca 360gggacgccag cgagggcccc agcggagaga ggtcgaatcg gcctaggctg tggggtaacc 420cgagggaggg gcctctagat ataagggcga attccagcac actggcggcc gttactagtg 480gatccgagct cggtac 496<210>33<211>857<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>33ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc ccaagctgtc gatcgacatt 60tctagaggat ctcggacccg gggaatcccc gtcccccaac atgtccagat cgaaatcgtc 120tagcgcgtcg gcatgcgcca tcgccacgtc ctcgccgtct aagtggagct cgtcccccag 180gctgacatcg gtcggggggg cggatctcgg acccggggaa tccccgtccc ccaacatgtc 240cagatcgaaa tcgtctagcg cgtcggcatg cgccatcgcc acgtcctcgc cgtctaagtg 300gagctcgtcc cccaggctga catcggtcgg gggggcggat cccccgggct gcaggaattc 360cggcgataca gtcaactgtc tttgaccttt gttactactc tcttccgatg atgatgtcgc 420acttattcta tgctgtctca atgttagagg catatcagtc tccactgaag ccaatctatc 480tgtgacggca tctttattca cattatcttg tacaaataat cctgttaaca atgcttttat 540atcctgtaaa gaatccattt tcaaaatcat gtcaaggtct tctcgaggaa aaatcagtag 600aaatagctgt tccagtcttt ctagccttga ttccacttct gtcagatgtg ccctagtcag 660
cggagacctt ttggttttgg gagagtagcg acactcccag ttgttcttca gacacttggc 720gcacttcggt ttttctttgg agcacttgag ctttttaagt cggcaaatat cgcatgcttg 780ttcgatagaa gacagtagct tcatctttca ggaggctagg gccgccagtg tgatggatat 840ctgcagaatt cgccctt857<210>34<211>8512<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>34ggtacgggag gtacttggag cggccgcgat ccagacatga taagatacat tgatgagttt 60ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 120attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 180cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 240tacaaatgtg gtatggctga ttatgatcat gaacagactg tgaggactga ggggcctgaa 300atgagccttg ggactgtgaa tttaaaatac acaaacaatt agaatcagta gtttaacaca 360ttatacactt aaaaatttta tatttacctt agagctttaa atctctgtag gtagtttgtc 420caattatgtc acaccacaga agtaaggttc cttcacaaag atcccaagct gtcgatcgac 480atttctagag gatctcggac ccggggaatc cccgtccccc aacatgtcca gatcgaaatc 540gtctagcgcg tcggcatgcg ccatcgccac gtcctcgccg tctaagtgga gctcgtcccc 600caggctgaca tcggtcgggg gggcggatct cggacccggg gaatccccgt cccccaacat 660gtccagatcg aaatcgtcta gcgcgtcggc atgcgccatc gccacgtcct cgccgtctaa 720gtggagctcg tcccccaggc tgacatcggt cgggggggcg gatcccccgg gctgcaggaa 780ttccggcgat acagtcaact gtctttgacc tttgttacta ctctcttccg atgatgatgt 840cgcacttatt ctatgctgtc tcaatgttag aggcatatca gtctccactg aagccaatct 900atctgtgacg gcatctttat tcacattatc ttgtacaaat aatcctgtta acaatgcttt 960tatatcctgt aaagaatcca ttttcaaaat catgtcaagg tcttctcgag gaaaaatcag 1020tagaaatagc tgttccagtc tttctagcct tgattccact tctgtcagat gtgccctagt 1080cagcggagac cttttggttt tgggagagta gcgacactcc cagttgttct tcagacactt 1140ggcgcacttc ggtttttctt tggagcactt gagcttttta agtcggcaaa tatcgcatgc 1200ttgttcgata gaagacagta gcttcatctt tcaggaggct agggccgcca gtgtgatgga 1260tatctgcaga attcgccctt ccttgcctgc tgctttccac caagtgctgg agagctggtg 1320aattgctcac tcccggctca ttcctctaat gaccgaagcg tctcgcagat gcaacctgcc 1380gtggaggagc agggagggag tgatttccag gtgtgggctt tttcagccat tcctaaaggc 1440gacttgagtt cacctcactc actccagcat ttgtactcct gttgtggaaa aggcagtgag 1500cacaagccaa gcccgctcca ccttcacccc gccccacctc ccccggccct ttcctgggcc 1560agtcttaggg ccctgagtac agacagcctg gctacccgtt aaccattctc agcgtgtggc 1620tgctttttac acacatgtgt acatatgcac ggacacacac acacacacag aggcttcccc 1680agtactcctc tatataggaa cccgtcacca tcccagacat atgcagaaga aagcccaaac 1740
cggctgtgtg agacaggaac aattaacacg gtaacagatc cgataatgca gaccatcagg 1800cctaaagaac acggagggac tgtgttctac ctccttatag aaaagcaatt agtgcctttt 1860tagctttgga accatgcccg gtggtgtgtg tgtggacaga actgctggct ggttgttaag 1920ttgctactaa acacagtgtt gtttctcgtg gtctctgccc ttgttaacta ggattgaggc 1980acttttgaac ataggtacct gggtcctaag ggcgaattcc agcacactgg cggccgttac 2040tagtggatcc gagctcggta ccaagctcca gctgggaata gagataggag gggacccagc 2100tggatgcagt gggcagtggg ggtcatagag tcaagagggt acagaataca atggggtcct 2160agtatcatgg tggaggtcag aaagagccct aaaagagagg gtcaaggtag gaggttagtg 2220aaggtccacc tccaccctct ccaggacagg gacatcaggc cacaattaat ttctctgcag 2280ttggtgagtg gtcatggtct ctggagtccc cagcatccag agtgtccctg gtctagtggt 2340cccccctttc tgagccacag ccactttctc catcaaatga ggccagtaat acccatccca 2400tagtgatgct gtgaggatga gatgagcatc tgtaagtgct gaagataatc cctgacacat 2460cccaagcatt cagcagtgca agcatacact tacacggcac tccccagagc caggcatgtg 2520ctggtgcctc atacacgtga ccacatttga tcgtcacaat gaccctgtga gggagactgt 2580gcaacagagg actgaccttg ctcaaagacct caggcgttt cccctcagag cctgagaggt 2640catctctttt tttttttttt tttcctttct ttctttttct tttccatttc tttttctttg 2700caagaggtca tctctaatgc tttggaatat cctgccagat tagagtccct ttgttcacct 2760gaaggtttgg gccacaccag atagtctaac ggtgtgattt gtgctgaagg ttttgagcca 2820cactatatca gctagatttc tagagcggcc ggccgcaata aaatatcttt attttcatta 2880catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac 2940aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga 3000acatttctct atcgataggt accgagctca tttaggtgac actatagaat acaagcttgc 3060atgcctgcag gtccggagga cagtactccg ctcggaggac agtactccgc tcggaggaca 3120gtactccgct cggaggacag tactccgctc ggaggacagt actccgactc tagaggatcc 3180ccagtcctat atatactcgc tctgcacttg gccctttttt acactgtgac tgattgagct 3240ggtgccgtgt cgagtggtgt ctcgagatct gcgatctaag taagcttggc attccggtac 3300tgttggtaaa gccaccatgg aagacgccaa aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta 3360tccgctggaa gatggaaccg ctggagagca actgcataag gctatgaaga gatacgccct 3420ggttcctgga acaattgctt ttacagatgc acatatcgag gtggacatca cttacgctga 3480gtacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa 3540tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc 3600gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct 3660caacagtatg ggcatttcgc agcctaccgt ggtgttcgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa 3720aattttgaac gtgcaaaaaa agctcccaat catccaaaaa attattatca tggattctaa 3780aacggattac cagggatttc agtcgatgta cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg 3840ttttaatgaa tacgattttg tgccagagtc cttcgatagg gacaagacaa ttgcactgat 3900catgaactcc tctggatcta ctggtctgcc taaaggtgtc gctctgcctc atagaactgc 3960ctgcgtgaga ttctcgcatg ccagagatcc tatttttggc aatcaaatca ttccggatac 4020tgcgatttta agtgttgttc cattccatca cggttttgga atgtttacta cactcggata 4080tttgatatgt ggatttcgag tcgtcttaat gtatagattt gaagaagagc tgtttctgag 4140gagccttcag gattacaaga ttcaaagtgc gctgctggtg ccaaccctat tctccttctt 4200cgccaaaagc actctgattg acaaatacga tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg 4260tggcgctccc ctctctaagg aagtcgggga agcggttgcc aagaggttcc atctgccagg 4320tatcaggcaa ggatatgggc tcactgagac tacatcagct attctgatta cacccgaggg 4380
ggatgataaa ccgggcgcgg tcggtaaagt tgttccattt tttgaagcga aggttgtgga 4440tctggatacc gggaaaacgc tgggcgttaa tcaaagaggc gaactgtgtg tgagaggtcc 4500tatgattatg tccggttatg taaacaatcc ggaagcgacc aacgccttga ttgacaagga 4560tggatggcta cattctggag acatagctta ctgggacgaa gacgaacact tcttcatcgt 4620tgaccgcctg aagtctctga ttaagtacaa aggctatcag gtggctcccg ctgaattgga 4680atccatcttg ctccaacacc ccaacatctt cgacgcaggt gtcgcaggtc ttcccgacga 4740tgacgccggt gaacttcccg ccgccgttgt tgttttggag cacggaaaga cgatgacgga 4800aaaagagatc gtggattacg tcgccagtca agtaacaacc gcgaaaaagt tgcgcggagg 4860agttgtgttt gtggacgaag taccgaaagg tcttaccgga aaactcgacg caagaaaaat 4920cagagagatc ctcataaagg ccaagaaggg cggaaagatc gccgtgtaat tctaggtacc 4980gagctcttac gcgtgctagc cctcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 5040ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 5100cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 5160tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 5220actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 5280tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 5340gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 5400aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 5460tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 5520ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 5580tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtacgggc tcgactagag tcggggcggc 5640cggccgcttc gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga 5700atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc 5760attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt 5820cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc 5880gataaggatc cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg 5940ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt 6000aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6060ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 6120caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6180aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 6240atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6300cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6360ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca 6420gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6480accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6540cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 6600cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 6660gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 6720aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6780aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6840actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6900taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6960gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7020
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7080ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcgataa 7140accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7200agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7260acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7320tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7380cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7440tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7500ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 7560gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 7620tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 7680ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 7740gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 7800cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 7860gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 7920ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 8040ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 8340ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400ttacaatttc ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 8460cctcttcgct attacgccag cccaagctac catgataagt aagtaatatt aa 8512<210>35<211>8565<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>35cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 60gccagcccaa gctaccatga taagtaagta atattaaggt acgggaggta cttggagcgg 120ccgcgatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 180gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 240aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 300ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta tggctgatta 360tgatcatgaa cagactgtga ggactgaggg gcctgaaatg agccttggga ctgtgaattt 420aaaatacaca aacaattaga atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat 480
ttaccttaga gctttaaatc tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt 540aaggttcctt cacaaagatc ccaagctgtc gatcgacatt tctagaggat ctcggacccg 600gggaatcccc gtcccccaac atgtccagat cgaaatcgtc tagcgcgtcg gcatgcgcca 660tcgccacgtc ctcgccgtct aagtggagct cgtcccccag gctgacatcg gtcggggggg 720cggatctcgg acccggggaa tccccgtccc ccaacatgtc cagatcgaaa tcgtctagcg 780cgtcggcatg cgccatcgcc acgtcctcgc cgtctaagtg gagctcgtcc cccaggctga 840catcggtcgg gggggcggat cccccgggct gcaggaattc cggcgataca gtcaactgtc 900tttgaccttt gttactactc tcttccgatg atgatgtcgc acttattcta tgctgtctca 960atgttagagg catatcagtc tccactgaag ccaatctatc tgtgacggca tctttattca 1020cattatcttg tacaaataat cctgttaaca atgcttttat atcctgtaaa gaatccattt 1080tcaaaatcat gtcaaggtct tctcgaggaa aaatcagtag aaatagctgt tccagtcttt 1140ctagccttga ttccacttct gtcagatgtg ccctagtcag cggagacctt ttggttttgg 1200gagagtagcg acactcccag ttgttcttca gacacttggc gcacttcggt ttttctttgg 1260agcacttgag ctttttaagt cggcaaatat cgcatgcttg ttcgatagaa gacagtagct 1320tcatctttca ggaggctagg gccgccccac gtgcgcagca ggacgcagcg ctgcctgaaa 1380ctcgcgccgc gaggagaggg cggggccgcg gaaaggaaag gggggggctg ggaggcccgg 1440agggggctgg gccggggacc cgggaggggt cgggacgggg cggggtccgc gcggaggagg 1500cggagctgga aggtgaaggg gcaggacggg tgcccgggtc cccagtccct ccgccacgtg 1560gggagcgcgg tcctgggcgt ctgtgcccgc gaatccactg ggagcccggc ctggccccga 1620cagcgcagct gctccgggcg gacccggggg tctgggccgc gcttccccgc ccgcgcgccg 1680ctcgcgctcc cagggtgcag ggacgccagc gagggcccca gcggagagag gtcgaatcgg 1740cctaggctgt ggggtaaccc gagggagggg cctctagata taagggcgaa ttccagcaca 1800ctggcggccg ttactagtgg atccgagctc ggtacacaga cattgacatt gtgtcatcta 1860gtatacaaat aggttcttgg agtactttac taggcatgga caatgcccaa tgcctgtccc 1920attcttcagg catattttta tttgtgggct ttatgtccct attaagaaaa agactaagaa 1980caagatgcta tcatattttc ttaactggaa tggtagatgt ttaaacatga tgactaccaa 2040gcttggctag aacattgtgt catctagtat acaaataggt tcttggagta ctttactagg 2100catggacaat gcccaatgcc tgtcccattc ttcaggcata tttttatttg tgggctttat 2160gtccctatta agaaaaagac taagaacaag atgctatcat aagctccaag cttatcgcca 2220gctgggaata gagataggag gggacccagc tggatgcagt gggcagtggg ggtcatagag 2280tcaagagggt acagaataca atggggtcct agtatcatgg tggaggtcag aaagagccct 2340aaaagagagg gtcaaggtag gaggttagtg aaggtccacc tccaccctct ccaggacagg 2400gacatcaggc cacaattaat ttctctgcag ttggtgagtg gtcatggtct ctggagtccc 2460cagcatccag agtgtccctg gtctagtggt cccccctttc tgagccacag ccactttctc 2520catcaaatga ggccagtaat acccatccca tagtgatgct gtgaggatga gatgagcatc 2580tgtaagtgct gaagataatc cctgacacat cccaagcatt cagcagtgca agcatacact 2640tacacggcac tccccagagc caggcatgtg ctggtgcctc atacacgtga ccacatttga 2700tcgtcacaat gaccctgtga gggagactgt gcaacagagg actgaccttg ctcaaagacc 2760tcaggcgttt cccctcagag cctgagaggt catctctttt tttttttttt tttcctttct 2820ttctttttct tttccatttc tttttctttg caagaggtca tctctaatgc tttggaatat 2880cctgccagat tagagtccct ttgttcacct gaaggtttgg gccacaccag atagtctaac 2940ggtgtgattt gtgctgaagg ttttgagcca cactatatca gctagatttc tagagcggcc 3000ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg 3060atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag 3120
gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct atcgataggt accgagctca 3180tttaggtgac actatagaat acaagcttgc atgcctgcag gtccggagga cagtactccg 3240ctcggaggac agtactccgc tcggaggaca gtactccgct cggaggacag tactccgctc 3300ggaggacagt actccgactc tagaggatcc ccagtcctat atatactcgc tctgcacttg 3360gccctttttt acactgtgac tgattgagct ggtgccgtgt cgagtggtgt ctcgagatct 3420gcgatctaag taagcttggc attccggtac tgttggtaaa gccaccatgg aagacgccaa 3480aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta tccgctggaa gatggaaccg ctggagagca 3540actgcataag gctatgaaga gatacgccct ggttcctgga acaattgctt ttacagatgc 3600acatatcgag gtggacatca cttacgctga gtacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga 3660agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc 3720tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc 3780gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct caacagtatg ggcatttcgc agcctaccgt 3840ggtgttcgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac gtgcaaaaaa agctcccaat 3900catccaaaaa attattatca tggattctaa aacggattac cagggatttc agtcgatgta 3960cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa tacgattttg tgccagagtc 4020cttcgatagg gacaagacaa ttgcactgat catgaactcc tctggatcta ctggtctgcc 4080taaaggtgtc gctctgcctc atagaactgc ctgcgtgaga ttctcgcatg ccagagatcc 4140tatttttggc aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta agtgttgttc cattccatca 4200cggttttgga atgtttacta cactcggata tttgatatgt ggatttcgag tcgtcttaat 4260gtatagattt gaagaagagc tgtttctgag gagccttcag gattacaaga ttcaaagtgc 4320gctgctggtg ccaaccctat tctccttctt cgccaaaagc actctgattg acaaatacga 4380tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg tggcgctccc ctctctaagg aagtcgggga 4440agcggttgcc aagaggttcc atctgccagg tatcaggcaa ggatatgggc tcactgagac 4500tacatcagct attctgatta cacccgaggg ggatgataaa ccgggcgcgg tcggtaaagt 4560tgttccattt tttgaagcga aggttgtgga tctggatacc gggaaaacgc tgggcgttaa 4620tcaaagaggc gaactgtgtg tgagaggtcc tatgattatg tccggttatg taaacaatcc 4680ggaagcgacc aacgccttga ttgacaagga tggatggcta cattctggag acatagctta 4740ctgggacgaa gacgaacact tcttcatcgt tgaccgcctg aagtctctga ttaagtacaa 4800aggctatcag gtggctcccg ctgaattgga atccatcttg ctccaacacc ccaacatctt 4860cgacgcaggt gtcgcaggtc ttcccgacga tgacgccggt gaacttcccg ccgccgttgt 4920tgttttggag cacggaaaga cgatgacgga aaaagagatc gtggattacg tcgccagtca 4980agtaacaacc gcgaaaaagt tgcgcggagg agttgtgttt gtggacgaag taccgaaagg 5040tcttaccgga aaactcgacg caagaaaaat cagagagatc ctcataaagg ccaagaaggg 5100cggaaagatc gccgtgtaat tctaggtacc gagctcttac gcgtgctagc cctcgacaat 5160caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct 5220tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg 5280gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg 5340cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt 5400tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt 5460gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 5520ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc 5580tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat 5640ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc 5700cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct 5760
cggtacgggc tcgactagag tcggggcggc cggccgcttc gagcagacat gataagatac 5820attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 5880atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac 5940aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 6000aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc gataaggatc cgtcgaccga tgcccttgag 6060agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact 6120tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt 6180cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 6240caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 6300caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6360ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6420cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6480ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 6540tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 6600gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 6660ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 6720ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 6780gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 6840aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 6900tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 6960ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 7020tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 7080aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 7140tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 7200ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 7260gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 7320gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 7380taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 7440tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 7500ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 7560tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 7620ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 7680tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 7740ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 7800aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 7860actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 7920aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 7980tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 8040aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 8100ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 8160ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 8220ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 8280ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 8340ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 8400
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 8460tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 8520ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ccatt 8565<210>36<211>279<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>36gacactatag aatacaagct tgcatgcctg caggtccgga ggacagtact ccgctcggag 60gacagtactc cgctcggagg acagtactcc gctcggagga cagtactccg ctcggaggac 120agtactccga ctctagagga tccccagtcc tatatatact cgctctgcac ttggcccttt 180tttacactgt gactgattga gctggtgccg tgtcgagtgg tgtctcgaga tctgcgatct 240aagtaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacc279<210>37<211>650<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>37gctagctacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 60caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 120taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 180atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 240ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 300acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 360ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 420ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcact cgagagacgg tgagagcgag 480tcagggattg gctggtctgc ttcgggcggg ctaaaggaag gttcaagtgg agctctccta 540accgacgcgc gtctgtggag aagcggcttg gtcgggggtg gtctcgtggg gtcctgcctg 600tttagtcgct ttcagggttc ttgagcccct tcacgaccgt caccaagctt650<210>38
<211>701<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的引物<400>38gctagctacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 60caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 120taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 180atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 240ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 300acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 360ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 420ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcact cgagcggccg ccagtgtgat 480ggatatctgc agaattcgcc cttgcgatct gtcagagcac ctcgcgagcg tacgtgcctc 540aggaagtgac gcacagcccc cctgggggcc gggggcgggg ccaggctata aaccgccggt 600taggggccgc catcccctca gagcgtcggg atatcgggtg aagggcgaat tccagcacac 660tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg gtaccaagct t 70权利要求
1.一种突变型Bik多肽，该多肽包含抗细胞增殖活性，促凋亡活性，或这两者。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽的抗细胞增殖活性，促凋亡活性，或这两者，基本上与天然Bik多肽相同或更有效。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该突变型Bik多肽包含至少一个氨基酸替代。
4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述替代阻止在导致未替代的Bik多肽磷酸化的条件下所述Bik多肽的磷酸化。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
7.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
8.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代，Ser35至Asp35的替代，或两者。
9.如权利要求1所述的多肽，进一步明确该多肽是药学上可接受的赋形剂中的组合物，所述Bik多肽分散在该赋形剂中。
10.如权利要求1所述的多肽，进一步明确该多肽包含在药学上可接受的赋形剂中。
11.如权利要求1所述的多肽，进一步明确该多肽包含在药盒中合适的容器中。
12.一种方法，该方法包括给予细胞具有氨基酸替代的Bik多肽。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述多肽还含有蛋白转导结构域。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述细胞包含在动物中。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述动物是人。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述人患有增殖性细胞疾病。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述增殖性细胞疾病是癌症。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肉瘤、肺癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃肠道癌、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌症是雌激素受体阳性，是EGF受体过表达，是Her2/neu过表达，非Her-2/neu过表达，是Akt过表达，是雄性激素非依赖型，或是雄性激素依赖型。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌症是实体瘤，例如，肉瘤、肺、脑、胰腺、肝、膀胱、胃肠道癌，或血液癌，例如白血病，淋巴瘤或骨髓瘤。
24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述增殖性细胞疾病是再狭窄。
25.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述多肽包含在药学上可接受的赋形剂中。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述多肽与脂质复合。
27.如权利要求13所述的方法，其特征在于，给予所述细胞具有Thr33位氨基酸替代的Bik多肽包括给予所述个体编码具有Thr33位氨基酸替代的Bik多肽的核酸。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述核酸的表达受组织特异性控制序列调控。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述核酸包含在质粒、反转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、或脂质体中。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述核酸分散在药学上可接受的赋形剂中。
31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是乳腺癌特异性控制序列。
32.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是前列腺癌特异性控制序列。
33.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是胰腺癌特异性控制序列。
34.如权利要求13所述的方法，其特征在于，给予细胞具有Ser35位氨基酸替代的Bik多肽包括给予所述个体编码具有Ser35位氨基酸替代的Bik多肽的核酸。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述核酸的表达受组织特异性控制序列调控。
36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述核酸包含在质粒、反转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、或脂质体中。
37.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述核酸分散在药学上可接受的赋形剂中。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是乳腺癌特异性控制序列。
39.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是前列腺癌特异性控制序列。
40.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是胰腺癌特异性控制序列。
41.如权利要求12所述的方法，进一步明确该方法是阻止个体内细胞生长的方法。
42.如权利要求13所述的方法，进一步明确该方法包括在氨基酸33位、氨基酸35位、或这两者修饰所述Bik多肽，其中，该修饰导致所述氨基酸不能被磷酸化。
43.一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括使细胞与有效剂量的突变型Bik多肽相接触以抑制细胞增殖。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik多肽进一步明确为具有抗细胞增殖活性，促凋亡活性，或这两者。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述多肽的抗细胞增殖活性，促凋亡活性，或这两者，基本上与天然Bik多肽相同或更有效。
46.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik含有氨基酸替代。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik多肽中的替代阻止在导致未替代的Bik多肽磷酸化的条件下所述Bik多肽的磷酸化。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
51.一种治疗患有增殖性细胞疾病的个体的方法，该方法包括给予所述个体突变型Bik组合物的步骤。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik多肽进一步明确为具有抗细胞增殖活性，促凋亡活性，或这两者。
53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述多肽的抗细胞增殖活性，促凋亡活性，或这两者，基本上与天然Bik多肽相同或更有效。
54.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik含有氨基酸替代。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
56.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik多肽中的替代阻止在导致未替代的Bik多肽磷酸化的条件下所述Bik多肽的磷酸化。
57.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
58.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
59.一种治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括使所述个体的至少一个癌细胞与治疗有效剂量的多聚核苷酸相接触，该多聚核苷酸编码具有Thr33至Asp33的替代、Ser35至Asp35的替代、或这两者的Bik多肽，其中所述多聚核苷酸包含在脂质体中。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸的表达受组织特异性控制序列调控。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是乳腺癌特异性控制序列。
62.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是前列腺癌特异性控制序列。
63.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述组织特异性控制序列是胰腺癌特异性控制序列。
64.一种多聚核苷酸构建物，该构建物包含编码突变型Bik多肽的核酸序列。
65.如权利要求64所述的多聚核苷酸，其特征在于，该构建物还含有操作性连接于所述编码突变型Bik多肽的序列的组织特异性控制序列。
66.如权利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述组织特异性控制序列包括乳腺癌特异性控制序列，前列腺癌特异性控制序列，或胰腺癌特异性控制序列。
67.如权利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述组织特异性控制序列包括乳腺癌特异性控制序列。
68.如权利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述组织特异性控制序列包括前列腺癌特异性控制序列。
69.如权利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述组织特异性控制序列包括胰腺癌特异性控制序列。
70.如权利要求64所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述突变型Bik多肽含有Thr33至Asp33的替代、Ser33至Asp35的替代、或这两者。
71.如权利要求64所述的多聚核苷酸，该多聚核苷酸进一步明确为包含在脂质体中。
72.一种使肿瘤细胞对化疗制剂敏感的方法，该方法包括向细胞递送突变型Bik组合物。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，使肿瘤细胞对化疗制剂敏感进一步明确为增强所述细胞的化疗制剂诱导的凋亡。
74.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik组合物进一步明确为突变型Bik多肽。
75.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述突变型Bik组合物进一步明确为编码突变型Bik多肽的多聚核苷酸。
全文摘要
本发明涉及Bik的突变形式，这些突变形式具有抗细胞增殖和/或促凋亡活性。在具体实施方式
中，Bik多肽含有在Thr33位和Ser35位的替代，在有些实施方式中，抑制了这些位点的磷酸化。在更多具体的实施方式中，这些形式，尤其当与脂质体联合给予时对癌症治疗是有用的。在给予突变型Bik多肽用于癌症治疗的实施方式中，该多肽可以以组织特异性方式调控。
文档编号A61K38/17GK1771259SQ200480009298
公开日2006年5月10日 申请日期2004年4月2日 优先权日2003年4月2日
发明者M·-C·洪, Y·李, Y·闻 申请人:得克萨斯州大学系统董事会