专利名称：一种诱发水稻抗氯磺隆体细胞突变体的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高水稻抗除草剂育种效率，更具体涉及一种诱发水稻抗氯磺隆体细胞突变体的方法，是一种利用化学诱变技术与组织培养相结合的方法选育水稻抗除草剂新品种途径的植物细胞工程实用方法。
背景技术：
随着农业除草剂迅速发展，除草剂的使用安全性问题日趋突出，已引起人们的普遍关注，从除草剂改良入手，不断推出高效、低毒、低残留除草剂新品种，不失为解决良好的途径，但需要巨额投资，其研究周期长；另外水稻对氯磺隆除草剂极敏感，土壤中氯磺隆含量为0.1-0.2×10-9时就抑制水稻植株生长，使植株发僵，根呈鸡爪状；氯磺隆处理过的麦田，不宜作水稻秧田、直播田和小苗插秧田，因此严重制约了氯磺隆除草剂在长江中下游麦稻轮作区的使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱变水稻抗氯磺隆体细胞突变体的方法，采用化学诱变剂诱导与氯磺隆除草剂复合组配筛选，并能有效地为应用于培育水稻抗除草剂新品种提供相关的实验依据，避免育种盲目性，该方法操作简便，效果好，适应广，培育一个水稻抗除草剂新品种至少比常规育种方法提前3-4年完成。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施首先采用成熟的体细胞培养技术，建立了一套最佳诱变剂浓度诱导愈伤组织与氯磺隆除草剂复合组配筛选方法。该方法利用化学诱变技术、与组织培养相结合，采用了离体诱导、继代、筛选、分化(不含氯磺隆)、再分化(含氯磺隆)培养程序。
本发明的技术内容诱发水稻抗除草剂体细胞突变体的方法由最佳操作程序和最适宜的诱变、筛选培养基配方组成。A、配制培养基，诱导培养基NB培养基加入2mg/L二氯苯氧乙酸和20-30mg/L5-溴尿嘧啶；继代培养基NB培养基中加入2mg/L 2，4-D和0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤；筛选培养基NB培养基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺隆；分化培养基MS培养基中加入2mg/6-BA和0.5mg/L萘乙酸；再分化培养基MS培养基中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆；B、培养时间诱导、继代、筛选培养，将已消毒的成熟胚材料接于诱导培养基上，置于黑暗条件下进行诱导愈伤组织培养，并加入5-溴尿嘧啶诱变剂培养18-20天；继代培养将诱导培养基上的愈伤组织转入继代培养基上培养18-20天，扩大愈伤组织抗氯磺隆细胞群体；筛选培养将继代培养获得的愈伤组织切割成直径为1.5-2.0毫米，转入筛选培养基上培养18-20天；C、分化、再分化培养时间在光照条件下愈伤组织进行再分化绿苗培养，12-14小时的光周期，分化培养，将筛选培养基上已成活的愈伤组织转入分化培养基上培养15-16天分化绿苗块；15-16天后进入再分化培养，将已分化的愈伤绿块转入再分化培养基上培养15-16天，筛选抗氯磺隆除草剂再生植株苗；D、诱导、继代、筛选、分化培养温度控制在26-27℃。
五种培养基操作程序及培养方法(1)诱导培养首先选取水稻健康的种子去壳，然后成熟胚置于70％乙醇中浸泡，用0.1％氯化汞溶液浸泡15-20分钟，用无菌水冲洗4次后方能接入诱导培养基上，将接好的成熟胚置于黑暗条件下培养18-20天。(2)继代培养诱导培养获得的愈伤组织，再转入愈伤继代培养基上置于黑暗条件下培养18-20天。(3)筛选培养用继代培养获得的愈伤组织，用刀片切割愈伤组织直径为1.5-2.0mm，再转入筛选培养基上置于黑暗条件下培养18-20天。(4)分化培养用筛选培养获得的愈伤组织，再转入分化培养基上光照条件下分化培养15-16天。(5)再分化培养分化培养基上已分化的愈伤绿块，再转入分化培养基上并含氯磺隆50-60mg/L光照条件下培养15-16天。其次是诱导、继代、筛选培养过程，是将已接种的成熟胚和已转培的愈伤组织及愈伤筛选培养材料放在生化箱黑暗条件下进行培养；分化、再分化培养是在光照条件下进行愈伤组织分化及再分化植株苗筛选培养；培养温度均控制在26-27℃。
本发明具有以下优点1.利用化学剂适宜浓度处理可提高愈伤组织诱发突变频率10-100倍，而植物体细胞离体自发突变频率极低，约为10-6-10-7。因此本方法可大大提高水稻抗除草剂细胞突变体的选择效率。
2.采用了最佳剂量诱导愈伤组织和抗氯磺隆复合组配筛选程序，既可以在较小的空间内筛选数额巨大的抗氯磺隆除草剂细胞系群体，又可以节约大量的人力、物力资源；比常规育种程序简便、实用、效果更佳。
3.通过体细胞培养获得的变异的再生植株在育种中具有稳定快的优点，便于大田抗除草剂育种优良性状的选择。
4.适应性广，可广泛适合于农业科研单位从事水稻抗逆境育种研究，应用化学诱变技术与植物细胞工程技术相结合的方法创造水稻抗除草剂新的种质材料。
具体实施例方式
1.培养基的配制。诱导培养基基本培养基(NB)中加入2mg/L二氯苯氧乙酸(2，4-D)和20-30mg/L5-溴嘧啶(5-Bu)；继代培养基(NB)中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-苄基氨基嘌(6-BA)；筛选培养基(NB)中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺隆；分化培养基(MS)中加入2mg/L6-BA和0.4-0.5mg/L萘乙酸(NAA)；再分化培养基(MS)中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆。
2.诱导、继代、筛选培养时间已接种的成熟胚和已转的愈伤筛选材料置于生化培养箱中，必须在黑暗下培养诱导、筛选愈伤组织，培养温度均控制在26-27℃，否则，诱导出来的愈伤组织生长质量较差；(1)诱导培养将成熟种子去壳，用0.1％氯化汞(HgCI2)溶液浸泡15分钟，用无菌水冲洗4次后，将已消毒的成熟胚接种在诱导培养基上并加入20-30mg/L5-溴尿嘧啶化学诱变剂培养19天诱导愈伤组织；(2)继代培养将诱导培养获得的愈伤组织转入继代培养基上培养20天，扩大愈伤组织抗氯磺隆细胞群体；(3)筛选培养将继代培养获得的愈伤组织转入筛选培养基上并加入氯磺隆除草剂25-50mg/L培养18天，筛选抗氯磺隆细胞系。
3.分化、再分化培养必须在光照下培养，才能诱导出再生植株，光照强度为2000Lx，12小时光周期；否则分化出来的绿苗为黄苗或白化苗。(1)分化培养将筛选培养19-20天后已成活的愈伤组织转入分化培养基上，置于光照培养箱中培养15天，让其分化绿苗；(2)再分化培养将分化培养15天后已分化的愈伤绿块转入再分化培养基上加入氯磺隆除草剂50-60mg/L，筛选抗氯磺隆再生苗培养15天以上。培养温度控制在26-27℃。
NB培养基N6大量元素、铁盐，B5微量元素、有机成分；N6大量元素为硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙；铁盐为硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠；B5微量元素为硫酸锰、硼酸、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、碘化钾；有机成份盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌-肌醇(植物细胞工程实验技术、科学出版社、1995年、P403-408)。
MS培养基大量元素、铁盐、微量元素、有机成分；大量元素为硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙；铁盐为硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠；微量元素为硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴；有机成分为甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌-肌醇(植物细胞工程实验技术、科学出版社、1995年、P403-408)。
权利要求
1.一种诱发水稻抗氯磺隆体细胞突变体的方法，它包括下列步骤A、配制培养基，诱导培养基基本培养基中加入2mg/L二氯苯氧乙酸和20-30mg/L5-溴尿嘧啶；继代培养基培养基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤；筛选培养基培养基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺隆；分化培养基培养基中加入2mg/6-BA和0.5mg/L萘乙酸；再分化培养基培养基中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆；B、培养时间诱导、继代、筛选培养，将已消毒的成熟胚材料接于诱导培养基上，置于黑暗条件下进行诱导愈伤组织培养，并加入5-溴尿嘧啶诱变剂培养18-20天；继代培养将诱导培养基上的愈伤组织转入继代培养基上培养18-20天，扩大愈伤组织抗氯磺隆细胞群体；筛选培养将继代培养获得的愈伤组织切割成直径为1.5-2.0毫米，转入筛选培养基上培养18-20天；C、分化、再分化培养时间在光照条件下愈伤组织进行再分化绿苗培养，12-14小时的光周期，分化培养，将筛选培养基上已成活的愈伤组织转入分化培养基上培养15-16天分化绿块；15-16天后进入再分化培养，将已分化的愈伤绿块转入再分化培养基上培养15-16天，筛选抗氯磺隆除草剂再生植株苗；D、诱导、继代、筛选、分化培养温度控制在26-27℃。
全文摘要
本发明公开了一种诱发水稻抗除草剂体细胞突变体的方法。它由诱导培养、继代培养、筛选培养、分化培养、再分化培养组成。操作者先将健康成熟种子去壳，再在无菌条件下，将成熟胚置于乙醇中浸泡，用氯化汞溶液浸泡，用无菌水冲洗，将已消毒的成熟胚接种在诱导培养基上加入5－溴尿嘧啶诱变剂黑暗培养；诱导培养的愈伤组织转入继代培养基上黑暗培养；愈伤组织再转入筛选培养基上加入氯磺隆黑暗培养；筛选培养后，将已成活的愈伤组织转入分化培养基上光照培养，再将已分化的愈伤绿块转入再分化培养基上并加入氯磺隆除草剂，在光照下筛选培养。本发明操作简便，效果好，适应性广，培育一个抗除草剂新品种比常规育种方法提前3－4年完成。
文档编号A01H3/00GK1582639SQ20041001321
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者冯双华, 肖国樱 申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所