专利名称：：象草耐盐体细胞突变体的离体筛选方法
技术领域：
：本发明涉及象草耐盐体细胞突变体离体筛选的方法，属于生物
技术领域：
，专用于象草耐盐细胞工程育种。二、技术背景象草(尸e朋Aet,Schumach)又名紫狼尾草，原产热带非洲，上世纪20年代引入我国，具有耐渍、耐旱、耐贫瘠、适应性广、无明显病虫害和高效光合作用能力，是一种特别适宜于热带和亚热带地区种植的多年生禾本科植物。国内外的研究表明，象草不仅是草食畜禽的优质青饲料、公路护坡理想的水土保持作物、中高档纸浆和人造板的优质原料，而且还是一种理想的生物质能源作物。象草尽管为多年生草本植物，但在我国长江中下游及其相同纬度地区不能自然开花结实，即使结实，也由于种子成熟期不一、易于落粒和发芽率极低的原因，目前生产上只能采用无性繁殖方法。我国人多地少，为了确保粮食作物安全，研究利用非耕地资源沿海滩涂满足象草多用途产业化需求，具有十分重要的意义。自从1972年Melchers首次提出植物组织培养技术用于筛选耐盐突变体的优越性，国内外学者进行了大量研究，利用组织培养技术筛选耐盐突变体被认为是一种可行的途径。本发明在已建立起象草幼穗离体培养高频率植株再生技术体系的基础上，明确NaCl浓度对胚性愈伤组织生长和分化的影响，并对耐盐体细胞突变体及其无性系后代进行耐盐性初步鉴定，旨在建立象草离体培养耐盐体细胞突变体筛选技术体系，为开展象草耐盐细胞工程育种奠定基础。三、
发明内容技术问题本发明涉及一种象草耐盐体细胞突变体离体筛选方法，其目的在于克服现有技术中以非颗粒状胚性愈伤组织为材料，通过NaCl胁迫筛选后完全丧失植株分化能力；采取低浓度NaCl重复或逐步提高NaCl浓度进行胁迫筛选，导致获得生理性耐盐植株的缺陷。技术方案象草耐盐体细胞突变体离体筛选方法，具体步骤如下1)材料选用象草的幼穗为外植体，以幼穗诱导产生的白色或浅黄色颗粒状愈伤组织为供体材料；2)培养基基本培养基MS无机盐、Bs有机成分，蔗糖质量比3%，琼脂条质量比0.8%;愈伤组织诱导培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸，简称2，4-D4.0mg/L和激动素，简称KT0.05mg/L或0.lmg/L;愈伤组织继代培养基附加2，4-D3.0mg/L和6—苄基腺嘌呤，简称6-BA0.2mg/L;愈伤组织分化培养基附加苯基脲类细胞分裂素，简称CPPU2.0mg/L和萘乙酸，简称NAAO.Olmg/L;或附加KT0.5mg/L和NAA0.5mg/L;幼苗生根培养基1/2MS培养基，附加NAA0.5mg/L;培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整PH值至5.8。3)颗粒状胚性愈伤组织的获得用黑塑料薄膜对象草进行短日照处理3~4周后，以孕穗初期的幼穗为外植体，把幼穗的切段或小花消毒后接种于愈伤组织诱导培养基上，28d后获得白色或浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织；4)耐盐体细胞突变体的离体筛选将诱导培养基中培养28d的颗粒状愈伤组织转入添加16g/LNaCl的愈伤组织继代培养基，45d后转入添加NaCl相同浓度的愈伤组织分化培养基。培养35d后，超过3片叶的幼苗转入无NaCl的生根培养基，绿芽点转入含NaCl相同浓度的愈伤组织分化培养基，幼苗生长28d后移入简易大棚；培养室温度为26t^28。C，光强为20001ux，每天光照16h;5)体细胞突变体综合农艺性状评价和耐盐鉴定体细胞耐盐胁迫离体培养再生的植株在滩涂大田综合农艺性状评价和产草量测定后，刈割留茬20cm，连部分根挖起植株，以有效分蘖单茎扦插无性繁殖，进行O、8.25g/L和16.5g/L海盐的1/2Hoagland营养液盆栽耐盐鉴定，选择出综合农艺性状优良、能在含16.5g/L海盐的1/2Hoagland营养液中生长、在含8.25g/L海盐的1/2Hoagland营养液生长明显优于对照的耐盐体细胞突变体植株，获得了象草耐盐新种质。有益效果本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果克服了在现有技术中以非颗粒状胚性愈伤组织为材料，通过NaCl胁迫筛选后完全丧失植株分化能力；采取低浓度NaCl重复或逐步提高NaCl浓度进行胁迫筛选，导致获得生理性耐盐植株的缺陷。本发明以象草幼穗培养获得的颗粒状胚性愈伤组织为材料，在愈伤组织继代培养和愈伤组织分化培养二个阶段高浓度NaCl胁迫筛选获得再生植株，结合滩涂大田综合农艺性状评价初选，以及盆栽耐盐鉴定，获得综合农艺性状优良的体细胞耐盐突变体新种质，提高了耐盐突变体的选择效率，加快了象草耐盐育种的进程。通过本发明筛选方法获得的植株，比对照增产23.8%，该植株不仅分蘖力强，而且茎秆粗壮，综合农艺性状优良，能在含16.5g/L海盐的1/2Hoagland营养液中生长、在含8.25g/L海盐的1/2Hoagland营养液生长明显优于对照。本发明的优点是操作简便，周期短，选择效率高。四图i象草幼穗离体培养诱导产生的颗粒状愈伤组织图2象草愈伤组织培养阶段NaCl胁迫筛选图3象草愈伤组织分化阶段NaCI胁迫筛选图4NaCl胁迫筛选的再生植株滩涂大田耐盐性鉴定图5NaCl胁迫筛选的体细胞突变体耐盐性盆栽鉴定五具体实施方式1.1供试材料象草N51，公知公用，1985年江苏省农业科学院从美国引进，种茎无性繁殖保存，2005年4月20日大田扩繁，参照陈礼伟等短日照处理方法，2005年6月20日开始，用黑塑料薄膜对象草进行短日照处理3~4周后，以孕穗初期的幼穗为外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，诱导产生的白色或浅黄色、颗粒状、胚性愈伤组织作为供试材料。1.2培养基基本培养基由MS无机盐和B5有机成分组成，附加3%蔗糖和0.8%琼脂，pH值为5.8。愈伤组织诱导培养基为基本培养基附加4.0mg/L2,4-D和0.05mg/L激动素(简称KT);愈伤组织继代培养基为基本培养基附加3.0mg/L2,4-D和0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤(简称6-BA);愈伤组织分化培养基为基本培养基附加2.0mg/L苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU)和0.01mg/L萘乙酸(简称NAA);生根培养基为1/2MS培养基附加0.5mg/LNAA。1.3NaCI胁迫筛选将在愈伤组织诱导培养基中培养28d的颗粒状愈伤组织转入添加0、10、12、14、16、18和20g/LNaCl的愈伤组织继代培养基，45d后转入添加NaCl相同浓度的愈伤组织分化培养基。培养35d后，超过3片叶的幼苗转入无NaCl的生根培养基，绿芽点转入含NaCl相同浓度的愈伤组织分化培养基，28d统计成苗率。幼苗生长28d后移入简易大棚，生长21d统计活棵率。培养室温度为26。C28'C，光强为20001ux，每天光照16h。1.4耐盐胁迫筛选组织培养再生植株耐盐性初步鉴定1.4.1耐盐性滩涂大田初步鉴定2006年4月28日，将简易大棚移栽成活的耐盐胁迫筛选组织培养再生植株和未经盐分胁迫处理的胚性愈伤组织再生植株(对照)移栽至浙江省上虞巿滩涂地。试验区土壤为沙土，2006年3月8日取样分析土壤020cm土层有机质含量2.70%、全氮含量0.098%、速效磷5.60mg/kg、速效钾63.20mg/kg,pH值为8.67，电导率0.039mScm—'，全盐含量0.11.;2040土层有机质含量0.4%、全氮含量0.051°/。、速效磷1.71mg/kg、速效钾108.00mg/kg，pH值为9.01，电导率0.078mScnT，全盐含量0.22%;田边水塘中水的全盐含量为1.19%。2006年9月4日大田测产后，选择综合农艺性状优良、产草量最高的耐盐胁迫筛选组织培养再生植株和典型对照株，刈割留茬20cm，连部分根挖起植株待用。1.4.2耐盐性盆栽初步鉴定2006年9月5日，将上述产草量最高的体细胞突变体和对照的基部20cm植株，以有效分蘖单茎扦插，移栽于玻璃温室内装石英沙的盆钵中，每盆插入3茎，待根茎生长10d萌发出4-5张新叶后，于9月25日用含0、25%(8.25g/L)、50%(16.5g/L)和75%(24.75g/L)海盐的l/2Hoagland营养液处理，每3盆重复放在同一周转箱中为1个处理，周转箱中液面高度4cm，每天观察，添加自来水保持液面高度，15d更换l次营养液，IO月IO日和II月15日分别刈割测定鲜草生长量。2.结果与分析2.1NaCl浓度对愈伤组织生长的影响挑取诱导培养基中的白色或浅黄色颗粒状愈伤组织，转入添加NaCl不同浓度的愈伤组织继代培养基中。试验表明(见表1):在不添加NaCl的继代培养基中，颗粒状愈伤组织生长迅速，10d后部分愈伤组织开始分化出绿芽点或毛状根，部分愈伤组织开始变为蓬松状或褐化。在添加NaCl不同浓度的继代培养基中，愈伤组织的生长速度随NaCl浓度提高而降低，绿芽点和毛状根的分化率均随继代培养基中添加的NaCl浓度的提高而降低。在继代培养基添加10g/LNaCl的处理中，愈伤组织的长势稳定，颜色白或淡黄，表面新鲜，颗粒状愈伤组织的保持率高于对照，但愈伤组织褐化率比对照高91.1%，绿芽点分化率比对照低84.6%。在NaCl浓度为12g/L、14g/L和16g/L处理中，愈伤组织的长势略弱，大部分愈伤组织呈淡黄色或部分灰白色，部分愈伤组织褐化死亡，毛状根分化率明显低于对照和NaCl浓度为10g/L的处理。在NaCl浓度为18g/L的处理中，愈伤组织的生长缓慢，大部分愈伤组织质量差，呈黄色或灰白色，绿芽点的出现率和毛状根的分化率均有明显的下降。在NaCl浓度为20g/L的处理中，愈伤组织基本停止生长，颗粒状愈伤组织呈灰白色，色泽暗淡，绿芽点的出现率只有0.5%，大部分绿芽点呈现白化现象，愈伤组织的褐化率达到84.0%，无毛状根。根据这一结果推断，20g/L浓度NaCl是象草愈伤组织继代培养耐盐筛选的临界浓度。表1继代培养基中NaCl浓度对颗粒状愈伤组织的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2NaCl浓度对愈伤组织分化的影响颗粒状愈伤组织和绿芽点转入愈伤组织分化培养基，培养35d时的统计结果表明(见表2):在不添加NaCl的分化培养基中，颗粒状愈伤组织成苗率明显高于其它处理，达到8.4%;绿芽分化率也较高，为4.4%;绿芽转入分化培养基后成苗率为96.7%，总成苗数为87株。在NaCl浓度为lO、12、14g/L的分化培养基中，成苗率为1.6~4.0%，平均成苗率只有对照的33.3%;绿芽分化率为2.2~4.9%，部分绿芽在生长后期呈现白化干枯现象，再次转入分化培养基绿芽成苗率分别为60.0%、50.0%和44.4%，总成苗数分别为8株、15株和26株。在NaCl浓度为16、18g/L的分化培养基中，成苗率只有0.6%和0.3%，绿芽分表2分化培养基中NaCI浓度对愈伤组织分化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>化率为10.2%和3.3%，绿芽再次转入分化培养基，成苗率分别为12.5%和10.0%，总成苗数分别为3株和2株。在NaCl浓度为20g/L的分化培养基中，培养35d只出现少量的绿芽点，无试管苗或绿芽形成。这一结果表明，在象草幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织分化培养中，NaCl筛选的临界浓度为18g/L、致死浓度为20g/L。2.3耐盐胁迫组织培养再生植株移栽和耐盐性初步鉴定2.3.1耐盐胁迫组织培养再生植株滩涂大田耐盐性初步鉴定2006年4月28日，将简易大棚移栽成活的45株耐盐胁迫筛选组织培养再生植株和20株未经盐分胁迫处理的胚性愈伤组织再生植株(对照)移栽至浙江省上虞市滩涂地，2006年9月4B田间测产结果表明，经NaCl胁迫筛选的体细胞再生植株鲜草产量为1.4~2.6kg/株，20株组织培养对照株平均产量为2.1kg/株，经NaCl胁迫筛选的体细胞再生植株中17.8%(8/45)的单株鲜草产量比对照减产5%以上、55.6%(25/45)的单株比对照增产5%以下、13.3%(6/45)的单株比对照增产5~10%、11.1%(1/45)的单株比对照增产23.8%，单株产草量最高的植株为经16g/LNaCl胁迫筛选组织培养获得，该植株不仅分蘖力强，而且茎秆粗壮。2.3.2耐盐体细胞突变体耐盐性盆栽鉴定对经滩涂初选、产草量最高的耐盐体细胞突变体和对照株无性系后代进行的盆栽耐盐性初步鉴定表明，各单茎鲜草生产量无显著差异，在不含NaCl的l/2Hoagland营养液中，单茎平均鲜草生长量对照株和耐盐体细胞突变体10月10日第1刈次分别为16.4g和20.4g，11月15日第2刈次分别为89.4g和97.0g。在含8.25g/L海盐的1/2Hoagland营养液中，第1、2刈次单茎平均鲜草生长量对照株和耐盐体细胞突变体分别为10.9g、11.9g和18.8g、20.2g，耐盐体细胞突变体比对照分别高9.17%和7.45%。在含16.5g/L海盐的1/2Hoagland营养液中，对照株停止生长并逐渐枯黄死亡，但根系一直保持白色，耐盐体细胞突变体生长极其缓慢但叶片一直保持绿色。在含24.75g/L海盐的1/2Hoagland营养液中，对照和体细胞突变体均停止生长并逐渐枯死，根系也逐渐变黑枯死。3结论(1)在愈伤组织继代培养中NaCl胁迫筛选的临界浓度为20g/L，在愈伤组织分化培养中NaCl胁迫筛选的临界浓度为18g/L、致死浓度为20g/L;(2)以幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织为材料，10g/L~18g/LNaCl胁迫筛选继代培养45d和分化培养35d后，均获得了再生植株。经田间试验初步鉴定，获得了在pH8.67-9.01的滩涂大田条件下鲜草产量比对照高23.8%的植株；其无性系后代能在含16.5g/L海盐的1/2Hoagland营养液中生长，在含8.25g/L海盐的1/2Hoagland营养液中，第1、2次刈割的鲜草生长量分别比对照高9.2%和7.4%，选择出综合农艺性状优良、耐盐性明显提高的耐盐体细胞突变体。这表明在愈伤组织继代培养和愈伤组织分化培养二个阶段采用NaCl胁迫筛选，结合滩涂和盆栽耐盐性鉴定，是一种有效的象草耐盐体细胞突变体筛选方法。权利要求1、象草耐盐体细胞突变体的离体筛选方法，其特征在于，1)材料选用象草的幼穗为外植体，以幼穗诱导产生的白色或浅黄色颗粒状愈伤组织为供体材料；2)培养基基本培养基MS无机盐、B5有机成分，蔗糖质量比3％，琼脂条质量比0.8％；愈伤组织诱导培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸，简称2，4-D4.0mg/L和激动素，简称KT0.05mg/L或0.1mg/L；愈伤组织继代培养基附加2，4-D3.0mg/L和6-苄基腺嘌呤，简称6-BA0.2mg/L；愈伤组织分化培养基附加苯基脲类细胞分裂素，简称CPPU2.0mg/L和萘乙酸，简称NAA0.01mg/L；或附加KT0.5mg/L和NAA0.5mg/L；幼苗生根培养基1/2MS培养基，附加NAA0.5mg/L；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；3)颗粒状胚性愈伤组织的获得用黑塑料薄膜对象草进行短日照处理3～4周后，以处于孕穗初期的穗长小于5cm幼穗为外植体，把幼穗的切段或小花消毒后接种于愈伤组织诱导培养基上，28d后获得白色或浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织；4)耐盐体细胞突变体的离体筛选将诱导培养基中培养28d的颗粒状愈伤组织转入添加16g/LNaCl的愈伤组织继代培养基，45d后转入添加NaCl相同浓度的愈伤组织分化培养基。培养35d后，超过3片叶的幼苗转入无NaCl的生根培养基，绿芽点转入含NaCl相同浓度的愈伤组织分化培养基，幼苗生长28d后移入简易大棚；培养室温度为26℃～28℃，光强为2000lux，每天光照16h；5)体细胞突变体综合农艺性状评价和耐盐鉴定体细胞耐盐胁迫离体培养再生的植株在滩涂大田综合农艺性状评价和产草量测定后，刈割留茬20cm，连部分根挖起植株，以有效分蘖单茎扦插无性繁殖，进行0、8.25g/L和16.5g/L海盐的1/2Hoagland营养液盆栽耐盐鉴定，选择出综合农艺性状优良、能在含16.5g/L海盐的1/2Hoagland营养液中生长、在含8.25g/L海盐的1/2Hoagland培养液生长明显优于对照的耐盐体细胞突变体植株，获得了象草耐盐新种质。全文摘要本发明涉及象草耐盐体细胞突变体的离体筛选方法，属于农业生物
技术领域：
。将颗粒状愈伤组织转入添加16g/LNaCl的继代培养基，45d后转入添加相同NaCl浓度的分化培养基，35d后幼苗转入无NaCl的生根培养基，获得再生植株。当代再生植株在滩涂大田综合农艺性状评价和产草量测定后进行盆栽耐盐鉴定，获得了在pH8.67-9.01的滩涂大田鲜草产量比对照高23.8％的植株；其无性系后代在含8.25g/L海盐的1/2Hoagland营养液中，第1、2次刈割的鲜草生长量分别比对照高9.2％和7.4％；选择出综合农艺性状优良、耐盐性明显提高的耐盐体细胞突变体。本发明的优点是操作简便，周期短，选择效率高。文档编号A01H1/04GK101161055SQ200710132279公开日2008年4月16日申请日期2007年9月18日优先权日2007年9月18日发明者丁成龙,佘建明,倪万潮,张建丽,钟小仙,顾洪如申请人:江苏省农业科学院