一种用于抗肿瘤的siRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于肿瘤治疗的siRNA及其应用。经RT-QPCR、Western?Blot和MTT染色法检测发现本发明的siRNA能通过特异性沉默人Pokemon基因，降低相应mRNA的表达水平，进而抑制肿瘤的发生发展，为针对Pokemon基因治疗肿瘤提供了可能，也为针对该基因的肿瘤分子靶向治疗提供了良好的前景，具有重大价值。
【专利说明】—种用于抗肿瘤的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于抗肿瘤的SiRNA及其应用,尤其涉及祀向人Pokemon基因的siRNA及其抗肿瘤作用，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002]RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默过程。在这一过程中，dsRNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), siRNA与相关蛋白质结合成RNA诱导沉默复合体(siRNA-1nduced silencing complex, RISC), RISC 识别并降解革巴信使 RNA(message RNA,mRNA)，终止其参与的翻译过程，从而抑制基因表达。RNAi技术具有高度特异性、作用迅速、起效快等特点，可以有效减少毒副作用发生的可能，现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力。
[0003]Pokemon 基因，即 POK 红系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid Ontogenicfactor)，也被称为LRF、0CZF或FB1-1，是转录抑制因子POK家族的一员，也是被发现的第一个对抑癌基因，可变读框基因(alterative reading frame,ARF)的特异性转录有抑制作用的因子，现已被确认为原癌基因。该基因主要通过调节ARF-p53路径，特异性抑制肿瘤抑制蛋白ARF及其激动剂，使细胞的增殖调控失效，从而导致肿瘤发生(Maeda T7Hobbs RM7PierPaolo Pandolf1.Cancer Res, 2005，65:8575-8578)。此外，Pokemon 还位于多种肿瘤抑制基因和原癌基因的上游，在肿瘤转化分子网络机制中能控制其他癌基因的活性，并对肿瘤细胞的一些重要特性产生影响，被视为“肿瘤总开关”。例如，有研究表明，Pokemon为癌基因LAZ-3 / BCL-6的潜在靶点，可与BCL-6协同作用促进淋巴瘤的发生发展；还可以反馈性增高人类肿瘤中广泛表达的凋亡抑制基因BCL-2的表达(Davies JM, Hawe N, KabarowskiJ, et al.0ocogene, 1999,18 (2):365)。Pokemon基因的编码产物，POK蛋白也可以介导蛋白二聚体形成，通过募集组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)引起染色质结构改变，引起特定DNA基因的开关，从而行使转录抑制功能。
[0004]Pokemon基因在人类多发性肿瘤，如淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等中均有高度表达，而缺失此基因的细胞则不易发生恶性转化。因此该基因有望成为肿瘤预防、诊断、治疗和预后评价的新靶标，能够特异性抑制Pokemon的药物，极有可能成为一种强有力的抗癌剂。
【发明内容】
[0005]本发明要提供的是一种能特异性抑制人Pokemon基因表达的siRNA,通过如下技术方案实现:
[0006]根据siRNA靶序列基本原则，针对人Pokemon基因(NM_015898)设计了 I条21个核苷酸的siRNA靶点序列，即s1-Pokemon，包括正义链和反义链，其碱基序列如下:
[0007]正义链 5’ -AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)；[0008]反义链5’ -CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0009]根据本发明的优选实施例，所述干扰片段的3 ’端还添加了两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸，以增强siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。
[0010]根据本发明的优选实施例，选择目前较为常见的阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂。
[0011]根据体外实验结果表明，本发明提供的SiRNA能够抑制多种肿瘤细胞中人Pokemon基因的表达，可应用于制备抗肿瘤基因药物。优选实施例为人肝癌、乳腺癌和肺癌细胞。
[0012]本发明要提供的siRNA的应用，是指所提供的siRNA在制备对人Pokemon基因表达进行调节、调整或抑制的基因药物，特别是治疗人Pokemon基因过度表达所引起的疾病(如恶性肿瘤)的基因药物中的应用。
[0013]上述基因药物可通过静脉或皮下给药；所述药物可通过局部给药。 【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为RT-QPCR检测人肝癌细胞株H印G2各实验组Pokemon基因的mRNA表达水平的结果图。
[0015]图2为RT-QPCR检测人肺癌细胞株A549各实验组Pokemon基因的mRNA表达水平的结果图。
[0016]图3为RT-QPCR检测人乳腺癌细胞株MCF-7各实验组Pokemon基因的mRNA表达水平的结果图。
[0017]图4为Western Blot检测上述三株细胞H印G2、A549、MCF_7中各实验组蛋白表达水平的结果图。
[0018]图5为MTT法分析s1-Pokemon对人肝癌细胞株IfepG2细胞毒作用的结果图。
[0019]图6为MTT法分析s1-Pokemon对人肺癌细胞株A549细胞毒作用的结果图。
[0020]图7为MTT法分析s1-Pokemon对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞毒作用的结果图。
【具体实施方式】
[0021]以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。
[0022]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，均为市售广品。
[0023]实施例1siRNA的合成
[0024]本发明所提供的s1-Pokemon是根据人Pokemon mRNA序列而设计,过程如下:从转录本(mRNA)的起始密码(AUG)开始寻找，搜索“AA”二连序列，以其3’端相邻19个碱基序列作为候选靶点，从中选择GC含量不超过36.8%的siRNA序列，并通过GenBank数据库的blast功能，将所选序列与人类基因组序列进行比对，排除和人的其他编码序列同源的序列。在正义链3’端加2个dTdT的尾，指导siRNA形成RISC，也避免受核酸酶的降解。
[0025]本实施例选择的s1-Pokemon对应人Pokemon基因mRNA中1759-1779核苷酸位点，碱基序列如下:[0026]正义链5’ -AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)；
[0027]反义链5’ -CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0028]本实施例选择的阴性对照组(NC)碱基序列如下:
[0029]正义链5，-UUCUCCCGAACGUGUACGUdTdT-3’ (SEQ ID NO:3)；
[0030]反义链5，-ACGUACACGUUCGGGAGAAdTdT-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0031]将上述设计序列委托百奥迈科生物技术有限公司通过化学法合成，本发明使用的siRNA双链纯度大于99%。
[0032]实施例2实时定量PCR (RT-QPCR)检测mRNA表达水平
[0033]1、细胞培养
[0034]本实施例采用人肝癌细胞株H印G2、人肺癌细胞株A549和人乳腺癌细胞株MCF-7进行研究。以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基(Gibco公司)培养，所述的培养基中加入浓度为IOOU / mL青霉素和IOOyg / mL链霉素(Invitrogen公司)，于37?、体积分数5% CO2,相对湿度90%的培养箱中培养。
[0035]2、细胞转染
[0036]以肝癌细胞HepG2为例，另两种细胞株可采用相同方法处理。取处于对数生长期的细胞，按照24孔板接种密度为1.0 X IO5个/孔，提前一天接种细胞，待细胞汇合度约为50%时进行转染。用Lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen公司)转染到HepG2细胞内，方法按照产品说明，siRNA终浓度为ΙΟΟηΜ。转染时以无血清培养基培养，37°C转染6h后，换成有血清培养基继续培养。48h后收集细胞，进行后续的总RNA提取。
[0037]3、RT-QPCR 检测 mRNA 表达水平
[0038](I)总RNA的提取:转染48h后，采用RISO? RNA提取试剂(百奥迈科生物技术有限公司)，按其说明书进行提取细胞的总RNA，步骤如下:
[0039]I)弃去24孔板内培养基，PBS清洗两遍，加入250 μ L RISO试剂进行裂解。室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离，转移到离心管中。
[0040]2) 12000g，4°C离心10min，小心吸取上清液，移入新的离心管中。得到的匀浆液中加入50 μ L氯仿，盖紧管盖，上下振荡15s，得浑浊液，无分层现象，室温静置2-3min。
[0041]3) 12000g，4°C离心15min。离心后，样品分为三层:无色上清水相、中间蛋白层及下层有机相，水相的体积约为所用RISO试剂的60%。小心吸取无色上清液至另一离心管。加入125 μ L异丙醇，轻轻混匀，室温静置lOmin。
[0042]4) 12000g，4°C离心10min。弃去上清，加250 μ L70%乙醇，涡旋振荡混匀。7500g，4°C离心5min。弃尽上清，超净工作台真空离心干燥，加入适量DEPC-H2O溶解RNA沉淀。
[0043](2) RT-QPCR 检测 mRNA 表达水平
使用EzOmics? One-Step QPCR试剂盒(百奥迈科生物技术有限公司)，按操作说明进行检测。PCR 条件为:反应体系 25yL，反应程序:1)95°C，10min，2)95°C，20s，3)55°C，20s，4) 72°C，30s，2)-4)，45个循环。同时以β-actin为内参，引物序列见表1，结果如图1所示。
[0044]表1、RT-QPCR检测用弓丨物序列
【权利要求】
1.一种用于抗肿瘤的SiRNA干扰片段，其特征在于，所述SiRNA的碱基序列如下: 正义链 5’-AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)； 反义链 5’-CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
2.权利要求1中所述的用于抗肿瘤的SiRNA，在制备对人Pokemon基因表达进行调节、调整或抑制的基因药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，制备人Pokemon基因过度表达所引起疾病的基因药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，制备人Pokemon基因所调控的下游基因过度表达引起疾病的基因药物中的应用。
5.权利要求2~4中任一项所述的基因药物，可用于肿瘤的预防、诊断、治疗和预后评价。
6.如权利要求2~5任一项所述的基因药物，其特征在于，可通过静脉或皮下给药。
7.如权利要求2~6任一项所述的基因药物，其特征在于，可通过局部给药。
【文档编号】A61P35/00GK103937792SQ201410000101
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】周建平, 王伟, 王雅哲, 丁杨, 鲍秀丽 申请人:中国药科大学