专利名称：:用于诱导针对表皮葡萄球菌的保护性免疫反应的多肽的制作方法用于诱导针对表皮葡萄球菌的保护性免疫反应的多肽相关申请的交叉引用本申请要求2007年3月19日提交的美国临时申请NO.60/918,846的权益，通过引用合并在此。发明背景在本申请-的现有技术。表皮葡萄球菌(》S/a;7/^/ococciwe^We/7m'^s)作为病原体出现，特别是在医院和免疫妥协的患者中。(Ziebuhr等，/打&r"a"ow"//cw7m/Q/^""mz'cra6/a/jge""28S:S14-S20，2006.)凝固酶阴性葡萄球菌属(CoNS),主要是表皮葡萄球菌，是与诊断或治疗操作中使用的外源物体相关的最常分离的微生物感染。(Heilmann和Peters，BiologyandPathogenicityof5Y"/7/^/ococcw51一de/7m'^y,In:GramPositivePathogens,Eds.Fischetti等，AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.2000和5Va//i;;/ococ"'z'wi/誰cmZXseaye,CrossleyandArcher(eds.),ChurchillLivingstoneInc.1997.)表皮葡萄球菌的核酸已经被测序以获得核酸序列信息并进行关于开》文阅读框和潜在多肽的预测。(Doucette-Stamm等，U.S专利No.6,380,370和Doucette-Stamm等，U.S专利No.7，060，458.)一些技术例如涉及展示技术和来自受感染患者的血清的那些可以用于鉴定编码潜在抗原的基因的工作。(Meinke等，国际公开号WO02/059148，Meinke等，国际公开号WO04/087746.)发明概述本发明特征在于包含与SEQIDNO:1结构上相关的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽的用途。SEQIDNO:l是全长表皮葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全长的天然存在的多肽在此被称为全长ORF2695e。SEQIDNO:1的His标签化的衍生物被发现产生针对表皮葡萄球菌的保护性免疫反应。引述"保护性"免疫或免疫反应表明针对表皮葡萄球菌感染的可检测水平的保护。引述"免疫原"是指提供保护性免疫的能力。因而，本发明的第一方面描述了包含至少90%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽免疫原，其中所述多肽不具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。引述包含与SEQIDNO:1至少90%相同的氨基酸序列表明存在SEQIDNO:1的相关区域并且可以存在其他的区域。在一个实施方式中，如果存在其他区域，所述多肽不具有SEQIDNO:3的氨基酸1-28所提供的氨基末端。与参考序列的同一性百分比(也称为百分比相同于)是通过使多肽序列与参考序列比对并确定相应区域中相同氨基酸的数目来测定的。这个数目除以参考序列(例如，SEQIDNO:1)中的氨基酸总数，然后乘以100并四舍五入到最接近的整数。本发明的另一个方面描述了免疫原，其包含提供针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的氨基酸序列以及在羧基末端或氨基末端与所述氨基酸序列共价连接的一个或更多个其他区域或部分，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下性质的区域或部分增强免疫反应，有利于纯化或有利于多肽稳定性。引述"其他区域或部分"表明不同于ORF2695e区域的区域或部分。其他区域或部分可以是，例如，其他的多肽区域或非肽区域。本发明的另一个方面描述了能在患者中诱导针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的组合物。所述组合物包含药学上可接受的载体和免疫有效量的、提供针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的免疫原。免疫有效量是足以提供针对表皮葡萄球菌感染的保护性免疫的数量。该数量应当足以显著地防止表皮葡萄球菌感染的可能性或严重度。本发明的另一个方面描述了包含重组基因的核酸，所述重组基因编码提供针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的多肽。重组基因含有编码多肽的重组核酸以及用于适当的转录和加工的调节元件(其可以包括翻译和翻译后元件)。重组基因可以独立于宿主基因组存在，或可以是宿主基因组的部分。重组核酸是其序列和/或形式在自然中不存在的核酸。重组核酸的实例包括纯化的核酸、组合在一起提供了不同于自然中存在的核酸的两个或更多个核酸区域，以及天然地相互相关的一个或更多个核酸区域(例如，上游或下游区域)的缺乏。本发明的另一个方面描述了重组细胞。所述细胞包含重组基因，所述重组基因编码提供针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的多肽。优选的，所述细胞在体外生长。本发明的另一个方面描述了产生提供针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的多肽的方法。所述方法包括使重组细胞生长，所述重组细胞含有编码所述多肽的重组核酸，并纯化所述多肽。本发明的另一个方面描述了提供针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的多肽，所述多肽由一过程生产，所述过程包括在宿主中使含有编码所述多肽的重组核酸的重组细胞生长并纯化所述多肽的步骤。可以采用不同的宿主细胞。本发明的另一个方面描述了在患者中诱导针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的方法。所述方法包括向所述患者施用免疫有效量的免疫原的步骤，所述免疫原提供针对表皮葡萄球菌的保护性免疫。除非特定的术语互相排斥，引述"或"表明之一或两者的可能性。偶尔地术语例如"和/或"被用于突出之一或两者的可能性。引述开放性的术语例如"包,含"允许其它的元素或步骤。有时用语例如"一个或更多个"与或不与开放式术语一同使用来突出其它的元素或步骤的可能性。除非明确地声明，引述术语例如"一(a),(an)，，不局限于一。例如，"一个细胞(acell)"不排除"复数个细胞(cells)，，。有时用语例如一个或更多个被用于突出复数个存在的可能性。根据在此提供的包括不同实施例的其他描述，本发明的其他特征和益处是明显的。提供的实施例例举了在实践本发明中有用的不同成分和方法。实施例不限制所要求保护的发明。根据当前的公开内容，熟练的技术人员可以鉴定和采用对于实践本发明有用的其他成分和方法。附图的简要描述附图1说明了SEQIDNO:2的氨基酸序列。SEQIDNO:2是SEQIDNO:l的His标签书f生物。SEQIDNO:1区域以粗体显示。附图2A和2B说明了SEQIDNO:3的全长ORF2695e(附图2A)以及编码核酸(附图2B)。附图2A中SEQIDNO:1区域以粗体显示。在附图2B中SEQIDNO:l编码区域以粗体显示。发明的详细说明SEQIDNO:1相关多肽提供保护性免疫的能力在以下提供的使用SEQIDNO:2的实施例中说明了。SEQIDNO:2是SEQIDNO:1的His标签衍生物。这个His-标签有利于多肽纯化和鉴定。附图l说明了SEQIDNO:2,其中SEQIDNO:1区域以粗体显示。SEQIDNO:1是全长ORF2695e表皮葡萄球菌多肽的衍生物。SEQIDNO:1含有ORF2695e序列(SEQIDNO:3)的氨基酸29-261。SEQIDNO:3的氨基酸1-28被鉴定为前导序列。附图2A和2B说明了SEQIDNO:3和编码核酸序列，其中SEQIDNO:1区域以粗体显示。ORF2695e序列ORF2695e具有与Gen-Bank登记号Q5HKC6相应的氨基酸序列。Gen-Bank登记号Q5HKC6参考Gill等，《/5a"eno/.187(7):2426-2438，2005。其他天然存在的ORF2695e序列可以根据与已知ORF2695e序列相比高度的序列相似性或连续氨基酸的存在来鉴定。连续的氨基酸提供了特征性标签。在不同的实施方式中，天然存在的ORF2695e序列是在葡萄球菌属中、优选的表皮葡萄球菌中存在的序列，具有如SEQIDNO:l中至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸；和/或具有与SEQIDNO:1的至少90%序列相似性或同一性。序列相似性可以通过本领域公知的不同的算法和技术来确定。一般地，序列相似性可以通过比对两个序列来获得最大氨基酸同一性，容许序列之一中的缺口、添加和替换的技术来确定。例如，使用利用程序lalign(由Huang和Miller开发，^c/v.^f;/.Mfl仇12:337-357,1991,对于《sim》程序)的局部比对工具，可以确定序列相似性。选项和环境变量是-f#第一个残基缺口的罚分(默认-14);-g#缺口中每个其他残基的罚分(默认-4)，-sstr(SMATRIX)可选择的计分矩阵文件的文件名。对于蛋白质序列，使用PAM250,默认-w#(LINLEN)序列比对输出线长度(60)。SEOIDNO:l相关多肽与SEQIDNO:1结构上相关的多肽包括含有不同表皮葡萄球菌菌抹中存在的相应区域和天然存在区域的衍生物的多肽。SEQIDNO:1相关多肽含有与SEQIDNO:1至少90%相同的氨基酸序列。引述"多肽"不提供最小或最大大小限制。至少90%相同于SEQIDNO:1的多肽含有SEQIDNO:1的最多至约26个氨基酸改变。每个氨基酸改变独立地是氨基酸替换、缺失或添加。所述改变可以在SEQIDNO:1区域之内或添加到SEQIDNO:1区域。在不同的实施方式中，SEQIDNO:1相关多肽至少94%或至少99%相同于SEQIDNO:1;与SEQIDNO:l不同之处在于O、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变；或基本上由SEQIDNO:1组成。引述"基本上由"指明的氨基酸"组成"表明存在所指的氨基酸并且可能存在其他氨基酸。其他氨基酸可以是在羧基或氨基末端。在不同的实施方式中，存在l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个其他氨基酸。优选的其他氨基酸是氨基末端曱硫氨酸。可以对SEQIDNO:1进行改变来获得可诱导针对表皮葡萄球菌的保护性免疫的衍生物。可以进行改变，例如，来获得保持了诱导针对表皮葡萄球菌的保护性免疫能力的衍生物，或来获得除了提供保护性免疫之外还具有可以实现特定目的的区域的衍生物。可以考虑不同的ORF2695e序列和氨基酸的已知性质进行改变。一般地，在取代不同氨基酸以保持活性中，优选的是交换具有相似性质的氨基酸。对于氨基酸替换可以考虑的因素包括氨基酸大小、电荷、极性和疏水性。不同的氨基酸R基团对氨基酸性质的影响是本领域公知的。(参见,例如,Ausubel，CWrew,尸r由co/s/"Mo/ecw/arS/o/og^,JohnWiley,1987-2002,Appendix1C.)实现特定目的的改变包括被设计以有利于多肽的生产或效力；或编码核酸的克隆的那些。通过使用适合于重组表达的起始密码子(例如，编码曱硫氨酸)可以便于多肽产生。曱硫氨酸稍后可以在细胞加工期间被除去。例如，通过引入可伴随有氨基酸添加或改变的限制性位点，可以便于克隆。多肽诱导免疫反应的效力可以通过表位强化来增强。表位强化可以使用不同的技术进行，例如，涉及改变锚定残基来改善肽对MHC分子的亲和性的那些以及提高肽-MHC复合物对T细胞受体的亲和性的那些。(Berzofsky等，A^w"i^v&w1:209-219,2001.)优选的，所述多肽是纯化的多肽。"纯化的多肽"存在于缺少一种或更多种其他多肽的环境中，所述其他多肽天然地与之相关和/或以存在的总蛋白的至少约10%存在。在不同的实施方式中，纯化的多肽在样品或制品中代表总蛋白的至少约50%、至少约75%或至少约95%。在一个实施方式中，多肽是"基本上纯化的"。基本上纯化的多肽存在于缺少与之天然相关的所有或大多数其他多肽的环境中。例如，基本上纯化的表皮葡萄球菌多肽存在于缺少所有或大多数其他表皮葡萄球菌多肽的环境中。环境可以是，例如，样品或制品。引述"纯化的"或"基本上纯化的"不需要多肽经历任何纯化，可以包括，例如，没有被纯化的化学上合成的多肽。多肽稳定性可以通过修饰多肽羧基或氨基末端来增强。可能的修饰的实例包括氨基末端保护基团，例如，乙酰基、丙基、丁二酰基、苯曱基、苄氧基羰基或叔-丁氧羰基；和羧基末端保护基团，例如酰胺、曱酰胺和乙酰胺。在一个实施方式中，多肽免疫原是免疫原的部分，所述免疫原含有在羧基末端或氨基末端与所述多肽共价连接的一个或更多个其他区域或部分，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下性质的区域或部分增强免疫反应，有利于纯化或有利于多肽稳定性。例如，使用可以存在于氨基或羧基末端的基团如聚乙二醇，可以增强多肽稳定性。多肽纯化可以通过向羧基或氨基末端添加基团以有利于纯化来亲合性;示签的实例包括六组l酸标i、trpE、谷^甘肽和麦芽糖结合蛋白。多肽产生免疫反应的能力可以使用一般地增强免疫反应的基团来增强。可以与多肽连接来增强针对所述多肽的免疫反应的基团的实例包括细胞因子，例如IL-2。(Buchan等，2000.Mo/ecw/『/m/wwwo/og少37:545-552.)多肽生产多肽可以使用标准技术来生产，包括涉及化学合成的那些和涉及从产生所述多肽的细胞提纯的那些。多肽的化学合成的技术是本领域公^口的。(参见，例^口,Vincent，尸e/^/eiVc^ez'wZ)n/gDe"very,NewYork,N.Y.，Decker,1990.)重组多肽生产和纯化的技术也是本4页；或7/^《口的。(参见，例^口，Ausubel，Cw厅ewf尸ro/oco/sAfo/ecw/ar5油g》JohnWiley，1987-2002.)使用重组核酸技术来产生多肽便于从细胞获得多肽。用于产生多肽的重组核酸技术包括在细胞中导入或产生编码所述多肽的重组基因并表达所述多肽。重组基因含有编码多肽的核酸以及用于多肽表达的调节元件。重组基因可以存在于细胞基因组中，或是表达载体的部分。可以作为重组基因的部分存在的调节元件包括与所述多肽编码序列天然地相关的那些和不与所述多肽编码序列天然地相关的外源的调节元件。外源调节元件例如外源启动子对于在特定宿主中表达重组基因或提高表达的水平是有用的。一般地，重组基因中存在的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选地存在的操纵子。用于真核细胞中加工的优选的元件是多腺苷酸化信号。通过使用表达载体便于重组基因在细胞中的表达。优选的，表达载体除重组基因之外还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、可选择标记、有限数量的有用的限制性内切酶位点和高拷贝数的潜能。表达载体的实例是克隆载体、修饰的克隆载体、专门设计的质粒和病毒。由于遗传密码的简并性，大量的不同编码核酸序列可以用于编码特定的多肽。由于几乎所有的氨基酸由不同的核苷酸三联体组合或"密码子，，编码，产生了遗传密码简并性。由密码子编码的氨基酸如下H-His-组氨酸I-Ile:异亮氨酸:K-Lys^赖氨酸:L-Leu:亮氨酸八=八13=丙氨酸密码子GCA,GCC,GCG,GCUC二Cys:半胱氨酸密码子UGC，UGUD:Asp:天冬氨酸密码子GAC，GAUE-Glu-谷氨酸密码子GAA,GAGF-Phe-苯丙氨酸密码子UUC，UUUG:Gly:甘氨酸密码子GGA,GGC,GGG,GGU密码子CAC，CAU密码子AUA,AUC,AUU密码子AAA,AAG密码子UUA，UUG,CUA,CUC，CUG，CUUM二Met-甲硫氨酸密码子AUGN-Asn:天冬酰胺密码子AAC，AAUP-Prc^月甫氨酸密码子CCA,CCC,CCG，CCUQ-Gln-谷氨酰胺密码子CAA，CAGR-Arg二精氨酸密码子AGA,AGG,CGA,CGC,CGG，CGUS二Se产丝氨酸密码子AGC,AGU，UCA,UCC,UCG,UCUT^ThF苏氨酸密码子ACA,ACC，ACG，ACUV-VaH缬氨酸密码子GUA,GUC，GUG,GUUW-Trp:色氨酸密码子UGGY-Tyr-酪氨酸密码子UAC,UAU用于SEQIDNO:1相关多肽的重组核酸表达的适合的细胞是原核生物和真核生物。原核细胞的实例包括大肠杆菌(￡.co//);葡萄球菌属(^a//^/ococc^)的成员，例如表皮葡萄球菌；乳杆菌属(丄a"o6ac〃/ws)的成员，例^口才直物乳4干菌(丄.p/aw^^wm);豸丄5求菌属(丄a"ococc^)的成员，例如乳酸乳球菌(丄./acto);芽胞杆菌属(5a"勘)的成员，例如枯草芽孢杆菌(5.sw磁s);棒状杆菌属(Cor少weZac/en'wm)的成员,例如,谷氨酸冲奉杆菌(C.g/Wam/cwm);以及假单胞菌属(；^j^omoww)的成员例如荧光假单胞菌(尸&/7womycew)。真核细胞的实例包括哺乳动物细胞；昆虫细胞；酵母细胞，例如酵母属(Sacc/mromycw)的成员(例如，酉良酒酵母(51.ce"WW"e))、毕赤氏酵母属(尸ZcA&)的成员(例如，巴斯德毕赤酵母(尸.)、汉逊酵母属(//aw"ww/a)的成员(例如，多形汉逊酵母(//,;o(ymo^/m))、克鲁维酵母属(《/w_yv^wn_yc^)的成员(例如，乳酸克鲁维酵母(《./"c&)或脆壁克鲁维酵母(尺./rag〖fc))和裂殖酵母属(Sc/^zc^acc/mramyces)的成员(例如，粟酒裂殖酵母(&;om&))。重组基因产生、导入细胞和重组基因表达的技术是本领域公知的。在参考文件中提供了这些技术的实例，例如Ausubel,O^reW/Vo/oco/"wMo/ecw/arJZo/ogj，JohnWiley，1987-2002,和Sambrook等,Mo/ecw/arC7o打/ng，」丄a6orafo^yM"wwa/，2ndEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989。如果希望，特定宿主中的表达可以通过密码子优化来增强。密码子优化包括使用更优选的密码子。在不同宿主中的密码子优化技术是本领域公知的。SEQIDNO:1相关多肽可以含有翻译后》务饰，例如，N-连接的糖基化，O-连接的糖基化，或乙酰化。引述多肽的"多肽"或"氨基酸"序列包括多肽，其含有来自宿主细胞例如酵母宿主的、具有翻译后修饰的结构的一个或更多个氨基酸。在酿酒酵母中，;数第二个氨基i的性质看起来决定了N-末端曱硫氨酸是否被除去。此外，倒数第二个氨基酸的性质还决定了N-末端氨基酸是否是N。-乙酰化的(Huang等，26:8242-8246，1987)。其他实例包括由于分泌前导区(例如信号肽)的存在耙向分泌的多肽，其中蛋白质被N-连接的或O-连接的糖基化修饰。(Kuk廳zinska等，^肌Aev.肠c/z亂56:915-944,1987.)佐剂-佐剂是可以在产生免疫反应中辅助免疫原的物质。佐剂可以通过不同的机制起作用，例如一种或更多种以下的提高抗原的生物学或免疫学半衰期；改善抗原对抗原呈递细胞的递送；改善抗原呈递细胞的抗原加工和呈递；以及诱导免疫调节细胞因子的产生。(Vogel，C"mW/"/ec".麵D/廳総30(suppl.3):S266画270,2000.)在一个实施方式中，使用了佐剂。，实例包括氢氧化铝、磷酸铝、或其他铝盐，磷酸钓、DNACpG基序、单磷酰基脂质A、霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、百日咳毒素、月包壁酰二肽、Freund's不完全佐剂、MF59、SAF、免疫刺激复合物、脂质体、生物可降解的微球体、皂苷、非离子嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物、聚磷腈、合成的多核普酸、IFN-Y、IL-2、IL-12和ISCOMS。(VogelC7/m'ca//"/ec"鍾Z)/卿雄30(suppl3):S266-270，2000，Klein等,/owrwa/o/尸/mrmacew"ca/5Wewc^89:311-321，2000，Rimmelzwaan等，Kac。'we19:1180-1187,2001,KerstenJ^c"we21:915-920,2003,O，HagenC"/r.Z>wgTag"/Xsoni.,1:273-286,2001.)诱导保护性免疫的患者"患者"是指能被表皮葡萄球菌感染的哺乳动物。患者可以被预防性地或治疗性地治疗。预防性治疗提供了足够的保护性免疫来降低表皮葡萄球菌感染的可能性或严重度。治疗性治疗可以被进行来降低表皮葡萄球菌感染的严重度。预防性治疗可以使用含有在此描述的免疫原的疫苗来进行。这样的治疗优选的对人类进行。疫苗可以被施用给普通群体，或处在提高的表皮葡萄球菌感染风险下的那些人。具有提高的表皮葡萄球菌感染风险的人包括护理工作者；医院患者；具有减弱的免疫系统的患者；经历手术的患者；接受异体植入物的患者，例如导管或血管设备；面对导致减弱的免疫性的治疗的患者；涉及外源物体的诊断操作之下的患者；和在具灼伤或创伤的提高风险的职业中的人。诊断或治疗操作中使用的外源物体包括留置导管或植入的聚合物设备。外源物体相关的表皮葡萄球菌感染的实例包括败血病(stepticemia)/心内膜炎(例如，血管内的导管、血管的假体、起搏器导线(pacemakerlead)、电震发生器系统、假体的心瓣膜、和左心室的辅助装置)；腹膜炎(例如，脑室-腹膜脑脊液(CSF)旁路和连续非卧床腹膜透析导管系统)；脑室炎(例如，内部和外部CSF旁路)；以及慢性聚合物相关的综合征(例如，假体的关节(髋)松动、硅酮假体的隆乳(mammaryargumentation)之后的纤维状荚膜的挛缩综合征、以及在白内障手术之后人工眼内透镜的植入后晚期发作的眼内炎(endophtalmisis))。(Heilmann和Peters，BiologyandPathogenicityofiS鄉/^/ococc"51e/油rmW51，In:GramPositivePathogens，Eds.Fischetti等,AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.2000.)可能被表皮葡萄球菌感染的非人类患者包括牛、猪、绵羊、山羊、兔、马、狗、猫和小鼠。非人类患者的治疗在保护宠物和家畜，以及在评估特定治疗的效力方面是有用的。在一个实施方式中，与涉及外源物体的治疗性或医学操作一起，患者接受预防性的治疗。在其他的实施方式中，患者在所述操作约1个月、约2个月、或约2-6个月之前免疫。组合疫苗SEQIDNO:l相关多肽可以单独使用，或与其他免疫原组合使用，来诱导免疫反应。可以存在的其他免疫原包括一种或更多种其他的表皮葡萄球菌免疫原；靶向一种或更多种其他葡萄球菌属生物例如金黄葡萄球菌(S.awrei^)、溶血葡萄球菌(<S.Aaemo(y"c^)、沃氏葡萄球菌(》S.丽厂"en')或《S./wgw"ew^的一种或更多种免疫原；和/或耙向其他感染生物体的一种或更多种免疫原。一种或更多种其他免疫原的实例包括ORF0657n相关多肽(Anderson等，国际公开No.WO05/009379);ORF0657/ORF0190杂合多肽(Anderson等，国际公开No.WO05/009378);sai-1相关多肽(Anderson等，国际公开No.WO05/79315);ORF0594相关多肽(Anderson等，国际公开No.WO05/086663);ORF0826相关多肽(Anderson等，国际公开No.WO05/115113);PBP4相关多肽(Anderson等，国际公开No.WO06/033918);AhpC相关多肽和AhpC-AhpF组合物(Kelly等国际公开No.WO06/078680);金黄葡萄球菌5型和8型荚膜多糖(Shinefield等，iV.Met/.346:491-496,2002);胶原蛋白粘附素、纤维蛋白原结合蛋白和凝集因子(Mamo等,FE"M5"/mmimo/ogyMet//ca/Mz'cTc^o/og>>10:47-54，1994,Nilsson等，丄C/z>z./騰"101:2640-2649,1998,Josefsson等，T7zeJowr"a/q/7"/ec"ow51ZXyeases184:1572-1580,2001)以及多糖细胞间粘附素和其片段(Joyce等，CaAo/i>^ra&ie"arcA338:903-922,2003)。施用使用在此提供的指导以及本领域公知的技术，可以配制免疫原并施用给患者。一^:的药物施用原则在例如Kacc!>iwEds.Plotkin和Orenstein,W.B.SandersCompany,1999;Aem/wg她k尸/mrmacew"ca/6WewceyEd.Gennaro,MackPublishing,2000;andMo<a^"PAar画cew"'cs2"rf￡^"o，Eds.BankerandRhodes,MarcelDekker，Inc.,1990中提供了。药学上可接受的载体有利于免疫原的保存和向患者的施用。药学上可接受的载体可以含有不同的成分，例如緩冲液、无菌注射水、生理盐水或磷酸盐緩沖盐水、蔗糖、组氨酸、盐和聚山梨酯。免疫原可以通过不同的途径，例如皮下的、肌肉内的或粘膜的途径来施用。皮下的和肌肉内的施用可以使用例如针头或喷射注射器来进行。考虑本领域公知的因素，包括患者的年龄、体重、性别和医学状况；给药途径；期望的效果；和采用的特定化合物，优选地确定合适的给药方案。免疫原可以以多剂量疫苗形式使用。预计的是，剂量将由l.Opg到l.Omg总多肽的范围构成。在本发明的不同实施方式中，所述范围是5.0mg到500|ug,O.Olmg到l.Omg,或0.1mg到l.Omg。给药的时间取决于本领域公知的因素。在初次施用之后，可以随后施用一次或更多次强化剂量来维持或强化抗体滴度。给药方案的实例将是第1天、第1个月、在第4、6或12个月的第三次给药，以及在所需的时间间隔的其他的强化剂量。抗体的产生SEQIDNO:1相关多肽可以用于产生结合所述多肽或表皮葡萄球菌的抗体和抗体片段。这种抗体和抗体片段具有不同的用途，包括在多肽纯化、表皮葡萄球菌鉴定或在针对表皮葡萄球菌感染的预防性或治疗性治疗中使用。抗体可以是多克隆的或是单克隆的。生产和使用抗体包括人类抗体的#支术是本4页；或7>知的。(Ausubel，Cw/reW尸ro/oco/sZ"A/o/ecw/ar肠/柳，JohnWiley,1987-2002，Harlow等，」w"7;o(^,""6ora^yMa肌a/,ColdSpringHarborLaboratory,1988,Kohler等，256:495-497，1975,Azzazy等，C7z.m'c"/Aoc/^m^o;35:425-445，2002,Berger等，」m.Me《324(1):14-40，2002.)适当的糖基化对于抗体功能可能是重要的。(Yoo等，Jowr加/c/Z^z聽wo/og7'ca/M"AoA261:1-20，2002,Li等，7V幽re历o&cAwo/og少24(2):210-215,2006.)天然存在的抗体含有附着于重链的至少一个N-连4妻的碳水^Tb物。(Yoo等，Tow/tzq/q/"/mmwwo/og/ca/AfeAo^y261:1-20,2002.)其他N-连接的碳水化物和O-连接的碳水化物可能存在，并且对于抗体功能可能是重要的。(A/.)不同类型的宿主细胞可以用于4是供有效的翻译后修饰，包括哺乳动物宿主细胞和非哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、C6、PC12和骨髓瘤细胞。(Yoo等，Jowr"fl/。/7mmwwo/ogi'ca/Me/Zicxis1261:1-20，2002，Persic等，187:9-18,1997.)非哺乳动物细胞可以被修饰来复制人类糖基化。(Li等，A^"m"肠&c/mo/，24(2):210-215,2006.)糖基工程化的巴斯德毕赤氏酵母(尸z'c/n'flpaWon'"是这样修饰的非哺乳动物细胞的实例。(Li等，胸,肠/ec/mo/ogy24(2):210-215,2006.)核酸疫苗编码SEQIDNO:1相关多肽的核酸可以利用适合于治疗性施用的载体导入患者中。适合的载体可以将核酸递送到目标细胞内而不引起不可接受的副作用。可以采用的载体的实例包括质粒载体和基于病毒的载体。(BarouchJ.尸a/Ao/.208:283-289,2006，Emini等，国际公开No.WO03/031588.)利用编码希望的多肽的基因表达盒实现细胞表达。基因表达盒含有调节元件，用于在目标细胞内产生和加工足够数量的核酸来实现有益效果。病毒载体的实例包括第一和第二代腺载体、辅助细胞依赖性腺载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、a病毒载体、委内端拉马脑炎病毒载体以及质粒载体。(Hitt等，^4ofv""ces1,"尸/mrm"co/ogy40:137-206，1997,Johnston等，U.S.专利No.6,156,588，Johnston等，国际公开No.WO95/32733，Barouch尸"Ao/.208:283-289,2006，Emini等，国际公开No.WO03/031588.)腺载体可以基于不同的腺病毒血清型，例如在人类或动物中发现的那些。动物腺病毒的实例包括牛的、猪的、黑猩猩的、鼠的、犬的和禽类的(CELO)。(Emini等，国际公开No.WO03/031588,Colloca等，国际公开No.WO05/071093.)人类腺病毒包括B、C、D或E血清型组，例如2型("Ad2")、4型("Ad4")、5型("Ad5")、6型("Ad6")、24型("Ad24")、26型("Ad26")、34型("Ad34")和35型("Ad35")。核酸疫苗可以利用不同的技术和给药方案来施用。(Emini等，国际7>开No.WO03/031588.)例如，疫苗可以通过用或者不用一个或更多个电脉冲地通过注射来月几肉内施用。通过刺激体液和细胞的免疫反应，电介导的转移可以辅助遗传学的免疫。给药方案的实例包括初免-强化以及异源的初免-强化方法。(Emini等，国际公开No.WO03/031588.)实施例以下提供实施例进一步说明本发明的不同特征。这些实施例还i兌明了实践本发明的有用的方法。这些实施例不限制所要求保护的发明。实施例l:保护性免疫原产生、纯化和制剂这个实施例描述了SEQIDNO:2产生、纯化和制剂。SEQIDNO:2^皮用于以下描述的实施例中来说明SEQIDNO:l相关多肽4是供保护性免疫的能力。SEQIDNO:2是SEQIDNO:l的His标签化的衍生物。ORF2695e克隆和表达和修饰ORF2695e的完整开放阅读框施用SignalP来分析，SignalP是被设计以鉴定推定的信号序列的程序。潜在的切割位点在aa28之后检测到。因而PCR《1物被设计以扩增编码蛋白质的aa29到末端的核普酸。还将限制性位点添加到PCR引物中来便于向pET-16b载体中克隆。限制性位点是羧基末端的Xhol位点以及氨基末端的Bpul位点(表1)。最终表达的构建体被设计以具有氨基末端的His标签来便于纯化。表1引物序列(非ORF2695e序列为下划线的)引物1SEQIDNO:5GGAATTCGCTCAGCTCATGATTCATCATCCTCGCTAGG氨基引物(3')引物2SEQIDNO:6GGATATCCTCGAGGAAGATAGCAAAGAAACGGAAA羧基引物(5')利用上述引物和来自表皮葡萄球菌菌抹RP62A的基因组DNA作为模板，通过PCR产生所述基因。进行PCR反应94°C5分钟，然后94°C45秒、56。C45秒、72。C3分钟的30个循环，随后在72°C10分钟并4。C保持。PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上纯化，用Qiagen凝胶提取试剂盒净化，用Xhol和Blpl在37。C切割5.5小时。切下的片段进行苯酚/氯仿提取和EtOH沉淀来除去酶活性并浓缩样品。片段重悬浮在EB緩冲液(10mMTris-HClpH8.5)中，用于连接到Xhol、Blpl切割的pET-16b。连接施用Roche快速连接试剂盒以6:1摩尔比例(插入到载体中)来进行。连接反应物转化到NovaBlue感受态细胞中，羧千青霉素(50|ag/ml)抗性克隆被用于产生小量制备(minipreps)。小量制备质粒通过限制性消化来筛选。两个克隆被选择来证实序列，转化到BLR(DE3)感受态细胞中用于表达验证。在IPTG诱导之后的表达从来自BLR(DE3)转化平板的克隆分离物的6ml培养物中检查。样品检查为为未诱导的、诱导的、诱导的可溶部分和诱导的不溶的部份。发现表达非常高，但是所有的产物处于不溶的部份中。SEQIDNO:2纯化将冷冻的重组大肠杆菌细胞糊(14克)解冻并重悬浮在两倍体积的裂解緩冲液(50mM磷酸钠、pH8.0、0.15MNaCl、2mM氯化镁、10mM咪唑、0.1%Tween隱80、Benzonase(EM#1.01697.0002)以250单位/mL添加到细胞悬液中)，并且蛋白酶抑制物混合物以每50mL—片添加到细胞悬液中(CompleteTM，无EDTA，Roche#1873580)。用微流化仪制备溶胞产物。溶胞产物通过在4。C在10,000xg离心45分钟来澄清。上清液通过25mm0.2微米MilliporeMillex注射器滤器过滤。过滤的上清液添加到Ni-NTA琼脂糖层析树脂(Qiagen#30250)，浆液在4。C混合大约16小时。将层析树脂的浆液注入层析柱，通过重力从柱出口收集未结合的级分。用十倍体积的洗涤緩沖液(50mM磷酸钠、pH8.0、0.5MNaCl、2mM氯化镁、0.1%Tween-80和20mM咪唑)洗涤柱。用六倍柱体积的洗脱緩沖液(50mM磷酸钠、pH8.0、2mM氯化镁、0.P/。Tween-80和0.3M咪唑)洗脱柱。含有根据SDS/PAGE鉴定的蛋白质的部分，以及含有最高蛋白质浓度的部分被集中来产生Ni-IMAC产物。Ni-IMAC产物通过SEC分馏。含有产物蛋白质的SEC级分通过Coomassie染色的SDS/PAGE来鉴定。集中含有产物的SEC级分来产生SEC产物。将滤液无菌过滤，以0.2mg/mL的终浓度吸附在羟基磷酸铝(aluminumhydroxyphosphate)佐剂上。实施例2:大鼠留置导管模型(多次免疫)SEQIDNO:2和大鼠留置导管模型被用于评估利用SEQIDNO:1相关多肽的主动免疫是否可以抑制植入的设备的葡萄球菌感染。含有SEQIDNO:2的疫苗如实施例1中描述的获得。购买3-4周龄的大鼠，在0、14和21天用磷酸氢氧化铝(aluminumhydroxidephosphate)("AHP")上的免疫原IP免疫(Klein等，Jow濯/0/7^"rmacew"ca/Sde"cM89:311-321,2000)，或用单独的佐剂模拟免疫。在第35天，动物进行手术来放置留置导管到颈静脉中。在手术后动物休息大约10天，此时IV给予表皮葡萄i^菌菌4朱RP62A的亚致死攻击(5-7x109CFU)。大鼠在攻击后24小时处死，除去导管。导管上细菌的存在通过在甘露醇盐琼脂平板上培养全部导管来评定。如果在平板上观察到生长的任何征兆，导管被标记为培养物阳性(表2)。假免疫的动物具有>80%的导管定殖。对于被认为是保护性的免疫原，<50%的导管被攻击菌林定殖。表2:利用大鼠留置导管模型的主动免疫实验<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>其他实施方式处于以下的权利要求之内。尽管已经显示和描述了几个实施方式，可以对此进行各种修改和替换而不背离本发明的精神和范围。权利要求1.一种多肽免疫原，其包含至少90％相同于SEQIDNO1的氨基酸序列，其中所述多肽提供了针对表皮葡萄球菌的保护性免疫，以及所述多肽不具有SEQIDNO3提供的氨基酸序列。2.权利要求l的多肽，其中所述多肽由至少94%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列组成。3.权利要求2的多肽，其中所述多肽基本上由SEQIDNO:l组成。4.权利要求3的多肽，其中所述多肽由SEQIDNO:1的氨基酸序列或曱硫氨酸-SEQIDNO:1组成。5.—种免疫原，包含至少90%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列，和在羧基末端或氨基末端与所述氨基酸序列共价连接的一个或更多个其他区域或部分，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下性质的区域或部分增强免疫反应，有利于纯化或有利于多肽稳定性。6.—种能在患者中诱导保护性免疫反应的组合物，包含免疫有效量的权利要求1-5的任一项的免疫原和药学上可接受的载体。7.权利要求6的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。8.—种包含重组基因的核酸，所述重组基因包含编码权利要求1_4的任一项的多肽的核苷酸序列。9.权利要求8的核酸，其中所述核酸是表达载体。10.包含权利要求8的核酸的重组细胞。11.一种产生提供保护性免疫的表皮葡萄球菌多肽的方法，包括步骤(a)在其中多肽被表达的条件下生长权利要求10的重组细胞；以及(b)纯化所述多肽。12.—种在患者中诱导保护性免疫反应的方法，包括向所述患者施用免疫有效量的、包含至少90%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列的免疫原的步骤。13.权利要求12的方法，其中所述患者是人类。14.权利要求13的方法，其中所述患者被针对表皮葡萄球菌感染进行预防性治疗。15.—种在患者中诱导保护性免疫反应的方法，包括向所述患者施用免疫有效量的、权利要求11的方法产生的多肽的步骤。专利摘要本发明特征在于包含与SEQIDNO1结构上相关的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽的用途。SEQIDNO1是全长表皮葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全长的天然存在的多肽在此被称为全长ORF2695e。SEQIDNO1的His标签化的衍生物被发现产生针对表皮葡萄球菌的保护性免疫反应。文档编号C12N15/00GKCN101636493SQ200880008989公开日2010年1月27日申请日期2008年3月14日发明者A·S·安德森,D·L·蒙特戈梅里,J·C·库克三世,T·麦尼利,W·L·麦克莱门茨申请人:默克公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan