专利名称：表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法
技术领域：
本发明属用于污染微生物降解领域，特别是涉及一种表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解 方法。
背景技术：
Jensen在1966年首次报道了环境中多氯联苯(Polychlorinated biphenyls， PCBs)的污 染，从此，PCBs的存在和它的持久性己成为人们所关注的热点问题。由于PCBs的持久性 和难于降解性，PCBs是环境中最重要的污染物之一，其广泛积累于土壤、水、沉积物和大 气中。目前处理PCBs污染的方法主要是物理或者化学技术，两者都存在或者价格昂贵或 者产生二次污染的问题。而微生物处理技术作为经济、有效的方法而被各国采纳并开展研 究。
微生物针对不同的污染物会分泌不同的酶参与反应，从而改变有机污染物的结构，将 其降解成为简单有机物，降低其不利的影响。在PCBs的降解过程中存在着两种不同的作 用模式厌氧脱氯作用和好氧生物降解作用。
由于微生物对环境的适应性强，且污染过程经历一段自然驯化期，因而可以通过驯化 从自然环境中筛选到可降解某一污染物的微生物降解菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物降解多氯联苯的方法，通过表皮葡萄球菌对多氯联苯 降解，为其污染治理和应用提供技术方法。
本发明的表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法，包括
(1) 将表皮葡萄球菌接种于多氯联苯降解培养基28 32"C摇床培养24 120h;
(2) 培养物经高效液相色谱测定，可分析该菌株对多氯联苯的降解效果；
(3) 在添加了外加碳源葡萄糖后，提高了多氯联苯的降解效率，获得降解多氯联苯的条 件。
所述表皮葡萄球菌是从上海松江污水处理厂的活性污泥中筛选出来的，此菌株属于微 球菌科(wz'cracoccaceae)，葡萄球菌属。该菌株的驯化培养基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L联苯。 该菌落为圆形，边缘整齐，乳白色，光滑，湿润，凸起；菌体呈球状，革兰氏染色阴性， 菌体周围有粘液层包裹。
所述的多氯联苯降解培养基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2 g/LMgS04， 0.1g/LCaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 100mg/L 2,3，,4，,5-四氯联苯一丙酮溶液， pH6.8-7.2。
所述的降解多氯联苯的条件为pH7.0， 30°C，摇床的转动频率150rpm。
有益效果
表皮葡萄球菌在pH7.0， 30°C，摇床的转动频率150rpm，在添加了外加碳源葡萄糖的 降解培养基中发酵5天，表皮葡萄球菌对2,3'，4'5-四氯联苯的降解效率达到93.33%。
图1是表皮葡萄球菌(5to; /^/ococc^印/cfem7/^y)所属种群系统树；
图2是2,3',4',5-四氯联苯一丙酮溶液作为标准样品的高效液相色谱图3是降解培养基(DM)作为对照样品的高效液相色谱图4是降解培养基(DM)中表皮葡萄球菌对PCBs降解的高效液相色谱图5是在添加了外加碳源葡萄糖的降解培养基中表皮葡萄球菌对PCBs的降解效率。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限
定的范围。
实施例1多氯联苯降解菌的分离鉴定
1、菌株的分离
(1)采集上海松江污水处理厂的活性污泥，置于一个长60cm，宽40cm，高50cm的玻 璃驯化装置，在不加营养物质，没有进水出水交换的基础上用空压机曝气3天，然后进行 换水，排出装置中大约10L的泥水混合物，加入营养液并进行不间断曝气。在培养了 10 天后在加入营养液的同时开始加入PCBs的废液进行驯化培养，培养驯化两个月。培养液 的配制葡萄糖5克、尿素2克、磷酸二氢钾l克。配制成大约IO升左右的营养液。
(2)将驯化后的水样沉淀30分钟后取上清夜，然后用8层纱布过滤两遍，滤液与富集 培养基按体积1:5的比例配成溶液移入锥形瓶中，放在摇床上培养。摇床转速为150r/min， 温度为3(TC，调节溶液pH值为7.0。富集培养基(Enrichment Medium)的主要成分为 牛肉浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L， pH7.4 7.6。
在驯化培养中利用联苯作为唯一碳源再进行驯化培养。取驯化培养基100ml移入250ml的锥形瓶中，调节pH值为7.0，在无菌条件下移入富集培养基的混浊液lml。放入 摇床中培养，摇床转速为150r/min，温度为30°C，培养时间为两个星期。驯化培养基 (Domestication Medium)的主要成分为0.5 g/LKH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4， 0.1g/LCaCl2、 0.2g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L联苯。
菌株划线分离，分离培养基SM (SeparateMedium)的主要成分为牛肉浸膏5g/L、 蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、联苯0.5g/L。得到单一菌株，在纯化富集培 养基中富集培养。纯化富集培养基PEM (Purification Enrichment Medium)主要成分为 0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2 g/L MgS04， 0.1 g/L CaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 2g/L联苯。
2、菌株的鉴定
(1) 菌体及菌落形态特征
菌株个体为球状，革兰氏染色阴性，菌体周围有粘液层包裹；其菌落为圆形，边缘整 齐，乳白色，光滑，湿润，凸起。
(2) 通过16S rDNA序列测定和分析比较，该序列与表皮葡萄球菌16S rDNA序列的 同源性达到99%，确定该菌株为表皮葡萄球菌(Sto户/^/ococciw印fflfeA7w'cfo),其16SrDNA 序列如表l。
实施例2表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解分析 将表皮葡萄球菌接种到经灭菌的驯化培养基中(0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L联苯)，置于恒温 摇床内，30°C， 150rpm，培养14天。然后接种于PCBs降解培养基(DegradationMedium) (0.5g/LKH2PO4、 0.5g/LK2HPO4、 0.2g/LMgSO4， 0.1g/LCaCl2、 0.2g/LNaCl、 1.0 g/L (NIL02SO4、 100mg/L2，3，,4，,5-四氯联苯一丙酮溶液、pH7.0)，样品经高效液相色谱测定， 分析该菌对PCBs的降解效果。 液相色谱条件
① 单柱单检测系统，长250mm，内径5mm活性炭柱。
② 载体比例色谱级甲醇10%，纯净水90%
③ 柱温150°C
④ 泵及泵压范围二元泵，20 400Pa
⑤ 进样方式手动进样⑥ 进样量50 UL
⑦ 波长范围检测波长230nm，参比波长360nm
先用2,3'，4'，5-四氯联苯一丙酮溶液作为标准样品测得样品中的PCBs在7. 5min处出现 波峰，如图2。确定了PCBs标准样品的出峰时间，就可以进一步分析PCBs的降解效果。 通过在降解培养基(DN)中未接种表皮葡萄球菌作为对照和接种表皮葡萄球菌样品的高效 液相色谱图比较(如图3、图4)可以得到PCBs的初始浓度为15. 7ng/ix L，最终浓度为5. 9ng/ U L ，降解效率为62. 4%。
实施例3外加碳源对多氯联苯降解效率的影响
(1) 将表皮葡萄球菌，接入富集培养基EM内，置于摇床内3(TC， 150rpm，富集培养 5天。
(2) 配制三份50ml的降解培养基DM，其中一份添加2g/L葡萄糖做外加碳源，置于 150ml锥形瓶中。一瓶不接种留作空白，另两瓶分别接种100ul富集菌液。摇床30'C， 150rpm培养。
(3) 在无菌操作条件下，分别于接种后ld、 2d、 3d、 4d、 5d取出5ml菌液。
(4) 样品预处理
① 将菌液置于分液漏斗内，分三次加入二氯甲烷。第一、二次加入2ml，第三次加入 lml。每次加入后充分振荡，静置片刻。待上下完全分层后，取出下层油相层。
② 将上述所取的油相，用无水硫酸钠过滤。并统一浓縮至lml。 液相色谱条件与实施例2中的液相色谱条件相同。
经分析测定，得到表皮葡萄球菌降解多氯联苯的条件在pH7.0， 30'C,摇床的转动 频率150rpm，添加了外加碳源葡萄糖的降解培养基中发酵5天，表皮葡萄球菌对2,3',4'5-四氯联苯的降解效率达到93.33%，见图5。表1 16S rDNA序列 caccttcgac ggctagctcc aaatggttac tccaccggct tcgggtgtta caaactctcg 60 tggtgtgacg ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgtagca tgctgatcta 120 cgattactag cgattccagc ttcatatagt cgagttgcag actacaatcc gaactgagaa 180 caactttatg ggatttgctt gacctcgcgg tttcgctacc ctttgtattg tccattgtag 240 cacgtgtgta gcccaaatca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc 300 ggtttgtcac cggcagtcaa cttagagtgc ccaacttaat gatggcaact aagcttaagg 360 gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc 420 accacctgtc actctgtccc ccgaagggga aaactctatc tctagagggg tcagaggatg 480 tcaagatttg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540 gcgggtcccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg 600 cttaatgcgt tagctgcagc acttaagggc ggaaaccccc taacactt 648
权利要求
1. 表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法，包括(1)将表皮葡萄球菌接种于多氯联苯降解培养基28～32℃摇床培养24～120h；(2)培养物经高效液相色谱测定，分析该菌株对多氯联苯的降解效果；(3)在添加了外加碳源葡萄糖后，获得降解多氯联苯的条件。
2. 根据权利要求1所述的表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法，其特征在于所述表皮葡萄球菌是从上海松江污水处理厂的活性污泥中筛选出来的，其驯化培养基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L联苯。
3. 根据权利要求1所述的表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法，其特征在于所述的多氯联苯降解培养基是0.5 g/LKH2P04、 0.5 g/LK2HP04、 0.2 g/LMgS04， 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0g/L(NH4)2SO4、 100mg/L 2,3，,4，,5-四氯联苯_丙酮溶液、pH 6.8-7.2。
4. 根据权利要求1所述的表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法，其特征在于所述的降 解多氯联苯的条件为pH7.0， 30°C，摇床的转动频率150rpm。
全文摘要
本发明涉及表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解方法，包括将表皮葡萄球菌接种于多氯联苯降解培养基28～32℃摇床培养24～120h，其培养物经高效液相色谱测定，可分析该菌株对PCBs的降解效果。在添加了外加碳源葡萄糖后，可提高表皮葡萄球菌对多氯联苯的降解效率，获得该菌降解多氯联苯的条件。
文档编号A62D3/00GK101428171SQ200810041050
公开日2009年5月13日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者任昱宗, 庞晓倩, 瑶 彭, 赵晓祥 申请人:东华大学