或减少了引物和探针聚合出现指数扩增而干扰检测结果，见图1。联 合使用热盖时，在反应的过程中，矿物油表面的残留反应液会被蒸发至热盖而继续残留在 矿物油表面，随着反应条件的变化，也会经历循环的过程，产生较多的含有扩增产物的气雾 胶。而不使用热盖时，矿物油表面的残留液会蒸发至管盖，离矿物油下面的反应液较远，其 温度也不易随着模板扩增而变化，产生的气雾胶也较少。所以，在进行实时荧光定量PCR检 测时，单独使用矿物油封闭而不加热盖是保证检测结果准确性的前提。
[0010] 所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征是一种TaqMan和Molecular Beacon重新组合并对其结构进行调整的解链式探针及实时荧光PCR技术，其关键是探针5' 端荧光基团标记的常规碱基序列仍能被Taq酶的外切酶活性水解产生荧光，3'端靶序列外 添加5~8个与5'端3~14个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光 基团的解链式探针实时荧光PCR检测技术。
[0011] 所述的解链式探针是指模板序列探针5'末端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚 合酶外切酶活性水解；3'端靶结合序列外添加5~8个与5'端4~10个碱基之后的中部 序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光基团，由于环状结合部分较短杂交使自身较难形 成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也 规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了 Molecular beacon本底 低和TaqMan灵敏、特异的优点。
[0012] 所述的荧光探针设计策略原则是：首先选取一段小于40nt的靶荧光探针序列并 遵守一般常规荧光探针设计所有原则，再在其3'末端多加5~8个与离5'端4~10个 后面的中部序列反向互补的碱基，且在最末端标记淬灭剂TAMRA (6-羧基-四甲基-罗丹明 rhodamine)、DABCYL或BHQl等，则探针Y端可选择标记荧光素 FAM、HEX或TET。
[0013] 所述的实验条件同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系。为了更进一 步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化 学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善本发明 一种解链式水解探针实时荧光PCR质量。
[0014] 所述的引物采用中部5-8个碱基同序的引物对以减少引物二聚体ro程度，从而减 少对靶扩增的竞争性抑制，提高灵敏度。
[0015] 所述的PCR反应液加等体积的矿物油单独使用，封闭反应液，不联用热盖条件。
[0016] 所述的技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，5mM dNTPs，Taq DNA聚合酶及其缓冲液，荧光探针，上游引物F/下游引物R，标准对照物，纯化水dH20,矿物 油。
[0017] 在一般PCR反应体系中，既存在引物与靶模板结合的特异性扩增，亦存在过量引 物与过量非特异模板，包括引物与引物，或引物与探针等短Oligo杂交、延伸的聚合体非特 异性扩增，这种非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长期，非特异性扩增 开始严重起来，对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大多PCR可以结束了， 如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对于大多数30个热循 环以内的PCR影响不太大。而实时荧光PCR第30-40个热循环正位于其黄金检测窗口期，因 此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确定性。仅仅引物与非特异模板结合扩 增是为线性扩增，远赶不上指数放大，所以引物二聚体指数扩增才是非特异主要原因。引物 二聚体的形成是因为过量的一对引物3'末端存在互补序列而杂交、并互为引物延伸产生引 物二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板非特异性指数扩增，大量产生引物二聚体DNA。 引物对3'末端存在的多个连续互补碱基可通过常规引物设计原则而避免，但由于核酸DNA 仅由4种碱基排列组合，核酸Oligo末端有1-2个互补碱基就无法避免；由于DNA单链易弯 曲转向，引物对3'末端1-2个互补碱基虽不够独立形成稳定氢键，但仍可借助引物转向后 3'末端外的多个互补碱基包括多个不连续互补碱基的氢键合力而结合，延伸数个碱基后产 生稳定的互补序列，进而产生完整的引物二聚体。引物二聚体虽不直接干扰TaqMan探针工 作，但其竞争性地消耗PCR试剂成份包括引物、聚合酶、酶底物等，显著降低扩增效率，进一 步减低TaqMan实时荧光PCR检测灵敏度。
[0018] TaqMan等探针实时焚光PCR反应中，过量的一对引物还会与过量的较长探针杂交 聚合，首先产生两种引物与探针序列杂交、部分延伸的不完整二聚体，两种不完整二聚体再 在PCR热循环反应中互为引物而杂交、延伸并被大量非特异性指数扩增，产生带部分探针 序列的"引物-部分探针-引物"三聚体。一般探针序列两末端的标记率均只有70% -80% 左右，剩余20%的3'末端羟基游离的探针Oligo会直接与两种引物3'末端杂交、延伸并大 量指数式扩增，产生非特异性扩增的"引物-探针"聚合及假阳性反应（夏乾峰.二聚体突 变引物定量PCR技术的研发及其临床应用[D].重庆医科大学，2011.)，见表2。带部分探针 序列的二聚体、三聚体将与特异性靶分子竞争结合荧光标记TaqMan探针，部分探针序列的 竟争结合并不能使其5'端标记荧光基团被水解，但是减少了 TaqMan探针与特异性靶分子 结合几率从而也就减少了 TaqMan探针5'端特异性水解，降低了系统检测灵敏度，造成弱阳 性标本不被检出、有漏检的可能。TaqMan探针法中引物二聚体的竞争性抑制作用可引起浓 度低一个数量级的靶分子出现假阴性（陆中奎.热带医学杂志，2013,13 (6) :752-755)。
[0019] 水解探针TaqMan是一种实时荧光PCR检测寡核苷酸探针，它设计为与目标序列 上游引物和下游引物之间的序列配对并尽量靠近一端引物，但又不重叠（间隔一个碱基以 上）的一段寡核苷酸（< 40nt)，其5'末端标记报告荧光基团，淬灭剂TAMRA(6-羧基-四 甲基-罗丹明rhodamine)则连接在3'末端。当探针完整时，通过FSrster共振能量转移 (FRET)作用，因荧光基团发射的荧光与淬灭剂的接近而被抑制、产生荧光淬灭效应。当PCR 反应时，完整的探针先与目标序列配对杂交，当引物退火延伸，新合成的DNA链接近探针杂 交位置时，DNA聚合酶利用其所带的外切酶活性将探针切开，使报告荧光基团释放到反应缓 冲液中，当荧光基团与淬灭基团分离时就发出荧光，DNA链合成继续进行，直到扩增循环结 束。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，荧光强度与扩增产物的数量呈 正比关系。
[0020] 分子信标（Molecular Beacon)是一段双重标记的寡核苷酸（25_40nt)，形成具有 一个环（探针）和一个自身末端互补的莖（添加序列）的发夹结构。焚光报告分子标在5' 末端，抑制作用范围小的淬灭基团Dabcyl [4_(4' -二甲氨基苯基偶但氮）安息香酸]标在 3'末端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，焚光报告分子和淬灭基团通过信标自身互补 形成的茎结构紧密靠近在一起，因而抑制了荧光信号。当PCR变性后退火时，分子信标遇到 靶DNA链，根据热力学原理，信标探针将与靶DNA结合而不是形成发夹结构。由于茎结构破 坏，荧光报告基团与弱作用淬灭基团相对分离开，报告基团得以发射荧光。
[0021] 综合水解探针和分子信标技术原理，本发明"一种解链式水解探针实时荧光PCR" 是互补的部分推后至中部的水解荧光探针及其实时荧光PCR。探针Y端具有与水解荧光 探针TaqMan的相同作用机理，利用Taq酶5' -3'外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而 切割释放报告荧光基团；探针3'端靶序列外添加5~8个与离5'端3~14个后面的中 部序列反向互补的碱基再标记淬灭荧光基团。由于环状结合部分较短杂交使自身较难形 成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光， 也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了 Molecular beacon 本底低和TaqMan灵敏、特异的优点，从而消除或减少了引物和探针聚合出现指数扩增而 干扰检测结果。同时根据Hands(Nucleic Acids Res.，Vol.25-16p3215)技术完全同序 引物绝没有ro扩增，又根据中国专利（一对部分同序引物减少其二聚体的方法：中国， CN201010105371. 8)部分同序引物部分减少程度，同序放在引物中部的关键部位能最大 程度地减少ro。
[0022] 本专利使用上海生工生物工程有限公司生产的引物、dNTPs，Taq DNA聚合酶，荧光 探针，上游引物/下游引物等PCR成分配制PCR反应液，在西安天隆TL-988II和上海宏石 SLAN-96P实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR反应，并对实验结果进行分析。
[0023] 本专利采用SYBR Green I染料法检测普通引物对和中部同序引物对的扩增发 现，普通引物对的本底Ct值在30左右，中部同序引物对的本底Ct值在38左右，中部同序引 物对的ro非特异性扩增明显低于普通引物对（图2)。采用一种解链式水解探针实时荧光 PCR法检测普通引物对和中部同序引物对结合解链式水解探针检测系列稀释的β -globin 模板，结果显示，普通引物对可以检测到3X103C〇pieS/mL稀释度（如图3A)，中部同序