（质粒小提纯化柱，详细步骤按Qiagen/Tiagen说明书进行），洗涤缓冲液（含70% EtOH 的2M NaI液）洗柱两次，加40 μ L dH20洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液 须加1/10体积的3M乙酸钠（pH5. 2)和2. 5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。
[0057] PEG沉淀方法：取血清100 μ L，加100 μ L的16 % PEG沉淀液，涡流混匀，高速离心 10分钟，弃上清，剩余浓缩沉淀中加入50 μ L煮沸裂解液，轻混，置沸水或金属浴中煮沸10 分钟，高速离心10分钟，上清即提取的DNA溶液。
[0058] 微磁珠方法：采用盐酸胍/异硫氰酸胍裂解，核酸在高浓度4Μ胍盐条件下结合至 聚苯乙稀微磁球硅烷化表面羟基（Melzak et al，1996)，用小于ρΗ6.0的缓冲液洗涤，大于 ΡΗ8. 5缓冲液洗脱。微磁球法已经越来越多地取代酚-氯仿抽提液体方法和硅吸附膜离心 柱方法。
[0059] 取血清100 μ L于I. 5mLEP管中，加等体积的胍盐裂解液5分钟，加0. 8mL稀释中 和液后再加25 μ L顺磁纳米硅化微球结合，将试管置于磁分离试管架吸附固定磁微球，弃 液后，加0. 8mL洗液洗涤一次，最后磁微球加50 μ L洗脱液收集DNA。
[0060] (2) TaqMan 实时荧光 PCR 反应：
[0061] 由于TaqMan探针PCR每个模板每次循环最多释放一个荧光基团，其反应荧光强度 远低于SYBR Green I荧光染料法（每3-4bp DNA能结合一个SYBR Green I分子），所以 TaqMan法必须采用较大体积的50 μ L反应体系，以使PCR仪器能接受到足够强度的荧光信 号。
[0062] 首先每个PCR反应管加2 μ L缓释引物R(2. 5 μ Μ)，缓释引物热启动和防产物气雾 胶污染。再按表3配方取I. 5mL的EP管配制不含待测樽板和引物R的反应混合液。
[0064] 产探针荧光会逐渐衰减，旧标记探针可相应多加一些。所用引物、dNTPs，Taq DNA 聚合酶，荧光探针，引物F/引物R等均购自上海生工生物工程有限公司，10 X PCR buffer有 本公司自主生产。）
[0065] 所配的反应混合液共0. 95mL分装于预加缓释引物的PCR反应管/或8联排管，每 管38 μ L分装25管。其中一管加10 μ L纯化水ClH2O作为PCR系统阴性对照，其余管按顺 序加入10 μ L待检DNA后，表面再小心、缓慢地沿管壁加上50 μ L矿物油封闭，短瞬离心，切 记不要混匀！以防破坏缓释。为了检测结果的可靠性，每次检测必须设立实验阳性阴性对 照和定量校准品（根据是否定量需要）。
[0066] 每个检测可平行2-3份X 50 μ L计平均Ct值，分析统计结果。
[0067] 标准曲线：
[0068] 以 pUC-HBcore (3. 36kb，分子量 Mff = 2.1X 106，计 1 μ g = 2· 8 X IO11Copy 分 子）计算，相应标准品梯度分子拷贝数为：2· 8Χ 109copies/mL，2· 8Χ 10scopies/mL， 2· 8X107copies/mL，2. 8X106copies/mL，2. 8Χ 105copies/mL，2· 8 X 104copies/mL 和 2· 8X 103copies/mL。
[0069] 反应管上实时荧光PCR仪（调整仪器激发光波长FAM :480nm，检测光波长FAM : 520nm)。按使用说明书设置运行程序，首先进行一个预反应50°C 2分-94°C 3分钟；然后 PCR扩增40个热循环：94°C 30秒，58°C 60秒；于58°C读取荧光值。
[0070] (3)实验结果分析：
[0071] HBV核心抗原质粒对照pUC-HBcore标准定量曲线的最左边第一条扩增曲线约为 2. 8X 109C〇pieS/mL，随之作10倍稀释，最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照，结果本 底对照Ct值在40循环内基本为一直线，在PCR反应内几乎没有扩增Ct值（图6)。
[0072] 购买中检所乙型肝炎病毒（HBV)核酸定量标准品（批号0711)线性灵敏度参考品 (图7)及阳性参考品（图8)检测结果基本一致，阴性参考品全为基线反应（图9)。线性 灵敏度参考品的灵敏度可达Ct35-37。
[0073] (4)临床试验结果：
[0074] 临床研究对比上海克隆生物高技术有限公司检测700份临床样本，包括慢性乙型 肝炎332例，急性乙型肝炎156例，乙型肝炎带原者56例，肝癌6例，其中B基因型103例， C基因型436例，D基因型11例；肝硬化8例，肝囊肿7例，丙型肝炎8例，甲肝3例，戊肝 2例，健康人102例，糖尿病等其他疾病20例。本研究共包含干扰样本10例（溶血样本4 例，脂血样本3例，甘油三酯样本3例），检测结果均为阴性，表明干扰物质对检测结果无显 著影响。
[0075] 与上海克隆生物高技术有限公司试剂相比，阳性符合率为99. 64%，阴性符合率为 98. 01 %，总体符合率为99. 29%。经Kappa检验，kappa值为0· 966,大于0· 8,说明两种试 剂的检测结果高度一致。本试剂试剂测量值为Y变量，对比试剂测量值为X变量拟合线性 回归方程，Y = 0. 969X+0. 373,其斜率为（95%可信区间）为0. 969，P < 0. 001，线性回归方 程具有统计学意义（F值46518. 951，P < 0.001)，相关系数（R)为0.993, P < 0.001，R2为 0.985。说明两试剂检测结果具有高度相关性。
【主权项】
1. 所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征是借鉴MolecularBeacon首尾自 身结合的一种两两相互结合并随扩增产物解链的TaqMan荧光探针及PCR技术；其关键是探 针5'端荧光基团标记的常规碱基序列仍能被Taq酶的外切酶活性水解产生荧光，3'端靶序 列外添加5~8个与5'端3~14个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭 荧光基团的新性能探针实时荧光PCR检测技术，以减少实时荧光定量PCR的本底非特异性。2. 根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的解链 式探针是指模板序列探针5'末端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解； 3'端靶结合序列外添加5~8个与5'端4~10个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱 基再标记淬灭荧光基团，由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探 针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引 物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特 异的优点。3. 根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的荧 光探针设计策略原则是：首先选取一段小于40nt的靶荧光探针序列并遵守一般常规荧光 探针设计所有原则，再在其3'末端多加5-8个与5'端4~10个碱基之后的中部序列反 向互补的人为碱基，且在最末端标记淬灭剂TAMRA(6_羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)、 DABCYL或BHQ1等，则探针Y端可选择标记荧光素FAM、HEX或TET。4. 根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的实验 条件同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系；为了更进一步增加扩增特异性和减 少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加 热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善本发明一种解链式水解探针实 时荧光PCR质量。5. 根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的引物 采用中部5-8个碱基同序的引物对以减少引物二聚体ro程度，从而减少对靶扩增的竞争性 抑制，提尚灵敏度。6. 根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的PCR 反应液加等体积的矿物油单独使用，封闭反应液，不联用热盖条件。7. 根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的技术 用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，5mMdNTPs，TaqDNA聚合酶及其缓冲液， 荧光探针，上游引物F/下游引物R，标准对照物，纯化水dH20,矿物油。
【专利摘要】一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征是一种能两两相互结合的TaqMan水解探针，随着特异PCR产物竞争结合而解链、水解而产生荧光；其荧光PCR技术特征是常规5’荧光探针的3’末端添加5-8个与探针中部序列反向互补的碱基后再添上淬灭基团，一探针尾部与另一探针中部互补结合，同时其中部又与另一尾部也结合的二聚体，探针相互结合规避了与过量引物的非特异性聚合扩增，间接也降低了反应基线荧光值。整合无引物二聚体的中部同序引物策略，无热盖的矿物油密闭措施来控制PCR非特异性反应。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105400886
【申请号】CN201510961208
【发明人】岳素文, 何玉贵, 江洪
【申请人】北京泰格瑞分子检验有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月22日