一类两亲性吲哚方酸菁染料及其长效标记溶酶体的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学合成及生物标记技术领域，特别涉及一类两亲性吲哚方酸菁染料 的合成及其在特异性溶酶体标记方面的应用。
【背景技术】
[0002] 随着人们对生命科学探索的不断深入，细胞甚至亚细胞层次上的生命活动更加引 人关注。溶酶体是一种存在于真核生物细胞内的重要亚细胞器，是细胞的"消化器官"。溶 酶体与生物体健康息息相关，人类的许多疾病如矽肺、肺结核等都与溶酶体有关。因此利用 生物荧光成像技术，对细胞溶酶体进行观察与监测有着重要意义。
[0003] 目前的能够实现溶酶体靶向物质主要分为抗体及荧光染料。其中，抗体的价格昂 贵且在生物体内容易失活；荧光染料的染色稳定性差，仅可在较短时间内标记溶酶体，不能 用于对溶酶体的长时间观察。
[0004] 吲哚菁染料是生物荧光标记中一类重要的成像剂。与常用的罗丹明、荧光素等有 机染料相比，吲哚菁的紫外吸收和荧光发射位于近红外区，这可以有效避免成像时生物体 自身的背景干扰，从而提高检测的灵敏度。目前商业化的吲哚菁染料的应用范围仅限于静 态的细胞膜标记且标记时间很短，并不能标记其他亚细胞器或用于长时间动态监测细胞。 而且商业化染料多为油溶性，在生物体内易聚集而导致荧光猝灭。同时，对有机助溶剂的依 赖也进一步增加了其生物毒性。因此为了更好的研究细胞的生命活动，开发一种能水溶、标 记时间更长并且能够监测细胞动态的成像试剂具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一类两亲性吲哚方酸菁染料及其合成方法，该类染料可用于活细胞 溶酶体标记，并能够实现对活细胞长时间动态监测。
[0006] 本发明使用4号位由溴、氢或甲基取代的苯肼盐酸盐为原料，制备得到带有上述 三种取代基且带有羧基功能化的吲哚方酸菁染料，然后通过羧基与伯胺的缩合反应进一步 将氨基引入染料分子。由于方酸基团的引入，染料具有较好的光稳定性，染料结构包含疏水 部分及带有伯胺的亲水部分，具有两亲性，无需有机助溶剂即可直接用于细胞标记，因此具 有较低的细胞毒性。染料的疏水部分可通过疏水作用嵌插到溶酶体膜中；亲水端的氨基质 子化后带正电荷，可与细胞膜表面的负电基团静电相吸。在活细胞中，由于溶酶体内为弱酸 性，氨基在此会完全质子化，静电作用更加强烈，因此染料与溶酶体膜的结合力更强。
[0007] 本发明所述的两亲性吲哚方酸菁染料结构式为：
[0008]
[0009] 其中，R为H，Br，或CH3。
[0010] 上述的两亲性吲哚方酸菁染料的合成方法为：
[0011] 1).将10-20mmol4-R基苯肼盐酸盐及10-24mmol3-甲基-2-丁酮加入到5-20mL 的冰醋酸中，回流反应8-20小时，悬蒸除去溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用饱和NaHC03水溶 液洗涤至水相无色、pH中性，取有机相旋蒸除去溶剂，得到5-R基-2, 3, 3-三甲-3H-基吲 噪；
[0012] 2).将3-10臟〇1的5-1?基-2,3,3-三甲-3!1-基吲哚与3-12111111〇1的对卞溴基苯甲 酸加入10_20mL乙腈中，回流反应10-20小时，旋蒸除去溶剂后用乙醚沉淀并洗涤，干燥后 得到中间产物吲哚啉衍生物；
[0013] 3).将1-5111111〇1步骤2)合成的吲哚啉衍生物与0.5-2.5111111〇1的3,4-二羟基-3-环 丁烯-1，2-二酮加入10-20mL甲苯和正丁醇的混合溶液中，甲苯和正丁醇的体积比为 1:0. 8-1. 5,并加入5-10mL吡啶；在氮气保护下，缓慢升温至100-120°C，15-30小时后用乙 醚沉淀得到中间产物吲哚方酸菁衍生物；
[0014] 4).将0.5-lmmol步骤3)合成的吲哚方酸菁衍生物、2-4mmol的2-(7-偶氮苯并三 氮挫）-N,N,Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯和2_4mmol二异丙基乙胺加入5-10mmolN,N-二 甲基甲酰胺中，室温下反应15-30分钟后加入N-叔丁氧羰基-1，2-乙二胺4-5mmol，继续室 温下反应2-8小时后用乙醚沉淀得到叔丁氧羰基保护的吲哚方酸菁衍生物；
[0015] 5).将0.1-lmmol叔丁氧羰基保护的吲哚方酸菁衍生物与5-10mL三氟乙酸加入至 5-10mL二氯甲烷中，室温下反应2-10小时后旋蒸除去溶剂并用乙醚沉淀，得到两亲性吲哚 方酸菁染料；
[0016] 步骤1)和2)中的R为H，Br，或CH3。
[0017] 上述的两亲性吲哚方酸菁染料在活细胞中标记溶酶体的应用。
[0018] 本发明具有如下有益效果：
[0019] 1.本发明设计合成的两亲性吲哚方酸菁染料紫外吸收和荧光发射均位于近红外 区，在生物成像过程中可大大降低背景荧光的干扰；
[0020] 2.本发明设计合成的两亲性B引噪方酸菁染料具有水溶性，不依赖有机助溶剂可直 接用于生物成像，有较低的生物毒性；
[0021] 3.本发明设计合成的两亲性吲哚方酸菁染料中的氨基在溶酶体酸性环境下充分 质子化，与溶酶体膜的静电作用更加强烈，因而可以标记活细胞的溶酶体，标记持续时间可 达48小时以上。吲哚菁类染料在溶酶体标记方面的应用还属首次。
[0022] 4.本发明提供的两亲性吲哚方酸菁染料合成工艺成熟，产品稳定性好，毒性低，该 两亲性吲哚方酸菁染料可长时间特异性标记活细胞的溶酶体，实现对活细胞溶酶体长时间 动态监测。
【附图说明】
[0023] 图1合成两亲性吲哚方酸菁染料的反应流程图。
[0024] 图2实施例1中产物的核磁氢谱表征。
[0025] 图3实施例1中产物的核磁碳谱表征。
[0026] 图4实施例1中产物的质谱表征。
[0027] 图5为实施例1中两亲性吲哚方酸菁染料D1的表观颜色及光谱性能。
[0028] 图6为实施例1中D1标记活Cos7细胞溶酶体的荧光显微镜照片。
[0029] 图7为实施例1中D1与商业化细胞膜染料Dil及溶酶体染料LysoTracker的毒 性对比，可以看出在高浓度下D1仍保持较低的细胞毒性。
[0030] 图8为实施例1中D1与商业化溶酶体染料LysoTracker用于活细胞溶酶体动态监 测，图中可看出D1的标记时间长达48小时（A)，而Lysotracker仅在两小时内有效果（B)。
[0031] 图9为实施例1中D1与LysoTracker标记焚光强度随时间的变化，D1可用于长 效溶酶体标记。
[0032]图10为两亲性吲哚方酸菁染料与溶酶体膜结合的示意图，染料嵌插入膜结构的 磷脂分子后可用于长效标记溶酶体。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体的实施例，对本发明做进一步阐述。本发明不限于这些具体的实施 例。
[0034] 实施例1 :
[0035] 1.将2. 23g(10mmol)4_溴苯肼盐酸盐及0· 86g(10mmol)3_甲基-2-丁酮加入到 10mL的冰醋酸中，回流反应12小时，悬蒸除去溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用饱和NaHC03 水溶液反复洗涤至水相无色、pH中性，取有机相旋蒸除去溶剂，得到5-溴-2,3,3-三 甲-3H-基吲哚L88g(7.9mmol)，产率 79%;
[0036] 4NMR(400MHz，CDC13)δ7. 40 (s，3H)，2. 27 (s，3H)，1. 30 (s，6H) ·
[0037] 2.将1.198(5臟〇1)5-溴-2,3,3-三甲-3!1-基吲哚与1.088(5臟〇1)的对卞溴基 苯甲酸加入15mL乙腈，回流反应20小时，旋蒸除去溶剂后用乙醚沉淀并多次洗涤，干燥后 得到中间产物吲哚啉衍生物1. 72g(3. 8mmol)，产率76% ;
[0038]NMR(400MHz,MeOD)δ8. 10 (s, 3H), 7. 76 (s, 1H), 7. 67 (s, 1H), 7. 49 (s, 2H), 5. 93 ( s, 2H), 1. 72 (s, 6H).
[0039] 3.将 1. 35g(3mmol)吲噪啉衍生物与 171mg(1. 59mmol)的 3, 4-二羟基-3_ 环丁 烯-1，2-二酮（方酸）加入10mL甲苯正丁醇（体积比为1 :1)混合液中，并加入5mL吡啶， 在氮气保护下，缓慢升温至115°C，24小时后用乙醚沉淀得到中间产物吲哚方酸菁衍生物 80511^(0.98臟〇1)，产率65% ;
[0040]HRMS(ESI-TOF):Calcdfor[M+H]+,821. 08,Found,821. 07.
[0041] 4.将411mg(0. 5mmol)吲噪方酸菁衍生物、1. 9g(5mmol)2-(7-偶氮苯并三氮 唑）-N,N,Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)和1. 65mL(10mmol)二异丙基乙胺（DIPEA)加 入5mmolN，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，室温下反应15分钟后加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙 二胺644mg(10mm〇l)，继续室温下反应2小时后用乙醚沉淀得到叔丁氧羰基（Boc)保护的吲 哚方酸菁衍生物404mg(0. 37mmol)，产率73% ;
[0042] HRMS(ESI-TOF) :m/zcalcdfor[M+H]+, 1105. 30 ；found, 1105. 3 12 1 ； [M+Na]+, 1127. 30 ;found, 1127. 294L
[0043] 5.将331mg(0. 3mmol)Boc保护的吲噪方酸菁衍生物与5mL三氟乙酸加入至5mL二 氯甲烷中，室温下反应2小时后旋蒸除去溶剂并用乙醚沉淀，得到两亲性吲哚方酸菁染料 Dl(250mg，产率92% )，结构式为：
[0044]
[0045] NMR(400MHz,MeOD)δ7. 89 (s, 2Η), 7. 70 (s, 1Η), 7. 48 (s, 1H), 7. 38 (s, 2H), 7. 15 ( s, 1H), 5. 98 (s, 1H), 5. 45 (s, 2H), 3. 66 (s, 3H), 3. 16 (s, 2H), 3. 04 (s, 3H), 1. 80 (s, 6H) ·13CNM R(100MHz,MeOD,δ) 178. 85, 172. 37, 170. 63, 145. 27, 143. 00, 140. 12, 134. 68, 132. 34, 129. 29, 127. 85, 127. 02, 118. 60, 113. 16, 105. 20, 88. 50, 64. 92, 50. 88, 43. 36, 41. 06, 40. 36, 38. 79, 27. 33, 18. 57, 15. 62.HRMS(ESI-TOF) :m/zcalcdfor[M+H]+, 905. 2026 ；found, 905. 2025 ；[M+Na]+, 927. 1845 ；found, 929. 1827.
[0046] 两亲性吲哚方酸菁染料对活细胞溶酶体的特异性标记：
[0047] 将两亲性吲哚方酸菁染料