专利名称：不对称吲哚菁染料的固相合成方法
技术领域：
本发明涉及近红外不对称吲哚菁染料的固相合成方法。
背景技术：
吲哚菁染料(简称Cy)是一类重要的菁染料。由于其具有摩尔消光系数大，荧光性能良好，与基质结合后荧光效率增大，最大吸收波长可调协范围大，且有相对较高的稳定性等优点，在红外激光染料，光盘存储材料，生物分析，核酸和蛋白质标记等方面得到了广泛的应用。常见的吲哚菁染料的基本结构如式(1)所示。
根据分子中次甲基数目的多少可分为吲哚单菁(一甲川菁)，吲哚碳菁(三甲川菁)，吲哚二碳菁(五甲川菁)，吲哚三碳菁(七甲川菁)等；另外根据分子中两个杂环及其杂环上取代基的相同与否，将其分为结构对称和不对称吲哚菁染料。
目前合成吲哚菁染料的方法主要是液相合成法。对称吲哚菁染料的制备通常是用1-位取代的2-甲基吲哚分子中2-位的亲核性甲基与具有亲电性的次甲基缩合剂进行反应实现的。不对称吲哚菁染料的制备则是先用次甲基缩合剂与等摩尔的2-位上带有亲核活性甲基的1-取代吲哚反应得到中间产物；然后再将中间产物与另一结构不同的2-位上带有活性甲基的1-取代吲哚反应得到不对称吲哚菁染料[RatnakarB.Mujumdar，Lauren A.Ernst，Swati R.Mujumdar，Christopher J.Lewis，andAlan S.Waggoner.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111]。这种液相合成方法操作复杂，产率低，最后得到的是对称与不对称吲哚菁染料的混合物，难以提纯。尤其是对于以高纯度不对称吲哚菁染料为合成目标的制备过程中，所得产物的分离纯化十分困难，需要利用繁锁的色谱分离才可得到较纯的产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不对称吲哚菁染料液相制备方法的缺点，提供一种产品纯度高、成本低、生产周期短、产品易于纯化的不对称吲哚菁染料的固相合成方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是以聚乙二醇共价负载的苯胺为起始反应物，通过与原甲酸酯或1，1，3，3-四甲氧基丙烷反应生成聚乙二醇负载的次甲基亲电试剂；用该负载的亲电试剂与亲核性1-位取代2-甲基吲哚或其衍生物反应形成聚乙二醇负载的半菁染料；而另一具有亲核性的1-位取代2-甲基吲哚或其衍生物进攻负载的半菁染料时，生成用化学结构通式(1)表示的不对称吲哚菁染料。
通式(1)中，R1、R2为-SO3H、-SO-3、-SO3K、-COOH、-COO-、-COOK、H的一种，R1、R2相同或不相同，R1、R2在吲哚结构单元的4-、5-、6-、7-位中一处，R3、R4为C1～10烷基或m为0～8的-CH2(CH2)mCOOH基或m为0～8的-CH2(CH2)mSO3H基，R3与R4为不相同的基团，n为1或2，该合成方法包括下述步骤步骤1制备聚乙二醇负载的次甲基亲电试剂将结构式为(2)的聚乙二醇负载的苯胺、原甲酸酯或1，1，3，3-四甲氧基丙烷按摩尔比为1∶15～50的配比加入其总量为1.4～3倍的冰醋酸中，搅拌下30～60℃反应1～5.5小时，冷至0～30℃加入反应液体积0.9～4倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得结构式为(3)或(4)的聚乙二醇负载的次甲基亲电试剂，化学反应方程式如下 上反应式中的PEG为聚乙二醇载体。
步骤2制备聚乙二醇负载的半菁染料将结构式为(3)或(4)的聚乙二醇负载的次甲基亲电试剂、结构式为(5)吲哚化合物以1∶0.5～2的摩尔比溶于其总量1.0～10倍量的无水乙醇或冰醋酸中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，搅拌下70～110℃反应1～5小时，冷至0～30℃加入反应液体积2.5～10倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得结构式为(6)的聚乙二醇负载的半菁染料；化学反应方程式如下 上反应式中R1、R3和n与通式(1)相同。
步骤3制备不对称吲哚菁染料将结构式为(6)的聚乙二醇负载的半菁染料、结构式为(7)的吲哚化合物按摩尔比为1∶0.45～1溶于其总量为1.4～6倍的醋酸酐和吡啶的混合溶剂中，在混合溶剂中醋酸酐与吡啶的体积比为2∶1，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，搅拌下20～110℃反应15～60分钟，冷至室温，加入反应液总体积7～15倍量的乙酸乙酯得沉淀物，用二氯甲烷洗涤沉淀物至二氯甲烷洗液为无色，得不对称吲哚菁染料，化学反应方程式如下 上述不对称吲哚菁染料通式(1)中，R1、R2优选为-SO-3，R1、R2在吲哚结构单元的5-位，R3优选为乙基，R4优选为-CH2(CH2)4COOH基，n为1或2，为结构式(8)所示的化合物 (8)式中n是1时为不对称吲哚菁染料Cy3，n是2时为不对称吲哚菁染料Cy5。
本发明所用的载体聚乙二醇的平均分子量为1000～8000。
本发明的工艺步骤1中，将结构式为(2)的聚乙二醇负载的苯胺、原甲酸酯或1，1，3，3-四甲氧基丙烷优选按摩尔比为1∶20～45的配比加入其总量为1.4～3倍的冰醋酸中。
本发明的工艺步骤2中，次甲基亲电试剂优选为一次甲基亲电试剂或三次甲基亲电试剂。
本发明利用聚乙二醇可溶于大多数有机溶剂，而在乙醚中不溶能以固体析出的特点，以其作为不对称吲哚菁染料合成的载体，既兼顾了不溶性高分子材料做载体时产品易于分离纯化、载体可循环使用的特点，又使反应具有均相反应的特点。反应进程可用常规分析方法，如紫外光谱、红外光谱、核磁共振和薄层色谱等方法进行检测，无需将制备过程中的产物从聚乙二醇上解脱下来。在反应的最后一步通过具有亲核性甲基碳的吲哚杂环化合物的亲核性进攻，使半菁染料易于从负载物上裂解下来，生成结构不对称吲哚菁染料；在该步反应中使用不足量的吲哚化合物进行反应，避免了副产物的生成，使最终所得不对称吲哚菁染料的提纯过程简化，产品纯度增高。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步说明本发明，但并不是本发明内容范围的任何限制。
实施例中所用聚乙二醇负载的苯胺按文献[Hongchao Guo，Zheng Wang，andKuiling Ding.Synthesis，2005，(7)，1061-1068]方法制备；1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐和1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐按文献[Ratnakar B.Mujumdar，Lauren A.Ernst，Swati R.Mujumdar，Christopher J.Lewis，and Alan S.Waggoner.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111]方法制备；其它化学试剂均为分析纯。化合物结构鉴定所用的核磁共振仪为BrukerAM-300超导核磁共振仪，TMS作为内标；红外光谱采用Nicolet 170SX FT-IR红外光谱仪测定；产品纯度分析利用Agilent 1100LC高效液相色谱仪，检测波长为280nm，250mm×4.6mm RP-C18柱。
制备实施例1不对称吲哚菁染料Cy3的合成步骤如下步骤1.制备聚乙二醇-2000负载的一次甲基亲电试剂聚乙二醇-2000负载的苯胺3.02g(1.35mmol)、原甲酸三乙酯10ml(60mmol)溶解在27ml冰醋酸中，电磁搅拌下55℃反应5.5小时。冷至冷至室温，向反应液中加入50ml乙醚，电磁搅拌5分钟后静置10～20分钟，过滤得淡黄色固体物聚乙二醇-2000负载的一次甲基亲电试剂2.43g，收率80.1％。IR(KBr)v3446，2884，1701，1638，1604，1529cm-1.1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.53(s，1H)，8.14(d，4H)，7.27(d，4H)，3.3-4.5(m，聚乙二醇)。反应式如下 上反应式中的PEG为聚乙二醇载体。
步骤2.制备聚乙二醇-2000负载的二次甲基半菁染料聚乙二醇-2000负载的一次甲基亲电试剂2.35g(1.05mmol)，1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.28g(1.05mmol)和原甲酸三乙酯0.34mL(2.08mmol)溶解在5mL无水乙醇中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min。电磁搅拌下回流反应2.5小时。冷至室温加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得黄色固体物聚乙二醇-2000负载的二次甲基半菁染料1.83g，收率69.3％。IR(KBr)v3430，2881，1701，1638，1603，1534cm-1。反应式如下 步骤3制备不对称吲哚菁染料Cy3聚乙二醇-2000负载的二次甲基半菁染料0.592g(0.24mmol)、1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.038g(0.11mmol)溶解在由2mL醋酸酐和1mL吡啶形成的混合溶剂中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，电磁搅拌下110℃反应15分钟。冷至室温后加入40mL乙酸乙酯得深红色沉淀。该沉淀用二氯甲烷洗涤至二氯甲烷洗液为无色后得0.015g红色固体不对称吲哚菁染料Cy3，收率21.6％。高效液相色谱纯度分析，流动相甲醇，流速1.0mL/min，保留时间2.19min，纯度大于98％。1H NMR(300MHz，D2O)δ8.31(dd，1H，次甲基桥上的β-H)，7.70(m，4H，4-H，4’-H，6-H，6’-H)，7.16(m，2H，7-H，7’-H)，6.19(m，2H，次甲基桥上的α-，α’-H)，3.91(m，4H，α-，α’-CH2)，2.03(t，2H，-CH2COOH)，1.15-1.64(m，21H，3CH2，1CH3和2(CH3)2).13C NMR(300MHz，D2O)δ183.5，175.8，175.5，151.9，144.1，143.7，141.7，141.5，139.7，139.60，126.8，119.8，111.5，111.3，103.4，49.3，44.3，39.6，37.3，27.1，27.0，26.6，26.1，25.6，11.9。反应式如下
制备实施例2不对称吲哚菁染料Cy5的合成步骤如下步骤1制备聚乙二醇-2000负载的三次甲基亲电试剂聚乙二醇-2000负载的苯胺2.02g(0.90mmol)、1，1，3，3-四甲氧基丙烷3.7mL(22.2mmol)溶解在9mL冰醋酸中，电磁搅拌下55℃反应5.5小时。冷至室温后向反应液中加入30mL乙醚，电磁搅拌5分钟后静置10～20分钟，过滤得黄色固体物聚乙二醇-2000负载的三次甲基亲电试剂1.56g，收率73.0％。IR(KBr)v3437，2886，1706，1639，1601，1465cm-1.1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.06(m，3H)，7.85(d，1H)，7.11(d，2H)，6.65(dd，1H)，3.3-4.5(m，聚乙二醇)。反应方程如下 步骤2制备聚乙二醇-2000负载的四次甲基半菁染料聚乙二醇-2000负载的三次甲基亲电试剂0.810g(0.34mmol)，1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.090g(0.34mmol)加于7.5ml冰醋酸中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min。在电磁搅拌下80℃反应1小时。冷至室温后加入30mL乙醚，电磁搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤得褐色固体物聚乙二醇负载的四次甲基半菁染料0.812g，收率83.9％。IR(KBr)v3436，2886，1712，1638，1599，1463cm-1。反应式如下 步骤3制备不对称吲哚菁染料Cy5
聚乙二醇-2000负载的四次甲基半菁染料0.501g(0.18mmol)、1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.033g(0.09mmol)溶解在由2ml乙酸酐和1mL吡啶形成的混合溶剂中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，电磁搅拌下110℃反应15分钟。冷至室温后加入40mL乙酸乙酯得蓝色沉淀。该沉淀用二氯甲烷洗涤至二氯甲烷洗液为无色后得0.014g蓝色固体不对称吲哚菁染料Cy5，收率23.7％。高效液相色谱纯度分析，流动相甲醇∶水＝85∶15(V/V)，流速1.0ml/min，保留时间1.98min，纯度大于98％。1H NMR(300MHz，D2O)δ7.70-7.86(m，6H，4-H，4’-H，6-H，6’-H，次甲基桥上的β-，β’-H)，7.26(m，2H，7-H，7’-H)，6.38(dd，1H，次甲基桥上的γ-H)，6.06(m，2H，次甲基桥上的α-，α’-H)，3.98(m，4H，α-，α’-CH2)，2.18(t，2H，-CH2COOH)，1.27-1.72(m，21H，3CH2，1CH3和2(CH3)2).13C NMR(300MHz，D2O)δ183.1，173.9，173.7，154.3，144.2，143.7，141.9，141.8，139.4，139.3，126.6，119.8，111.1，110.9，104.0，103.8，49.1，49.0，44.1，39.4，37.1，26.8，26.7，26.1，25.6，11.7。反应式如下 制备实施例3不对称吲哚菁染料Cy3的合成步骤如下步骤1制备聚乙二醇-1000负载的一次甲基亲电试剂聚乙二醇-1000负载的苯胺1.67g(1.35mmol)、原甲酸三乙酯10mL(60mmol)溶解在27mL冰醋酸中，电磁搅拌下55℃反应5.5小时。冰浴冷却至0～5℃，再向反应液中加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟后继续在冰浴中静置10～20分钟，过滤得淡黄色固体物聚乙二醇-1000负载的一次甲基亲电试剂1.20g，收率71.2％。
步骤2制备聚乙二醇-1000负载的二次甲基半菁染料聚乙二醇-1000负载的一次甲基亲电试剂1.31g(1.05mmol)，1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.28g(1.05mmol)和原甲酸三乙酯0.34mL(2.08mmol)溶解在5mL无水乙醇中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min。在电磁搅拌下加热至回流，反应2.5小时。反应完毕后冰浴冷却至0～5℃加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟后继续在冰浴中静置10～20分钟，过滤得黄色固体物聚乙二醇-1000负载的二次甲基半菁染料1.07g，收率67.2％。
步骤3制备不对称吲哚菁染料Cy3聚乙二醇-1000负载的二次甲基半菁染料0.364g(0.24mmol)、1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.038g(0.11mmol)溶解在由2mL醋酸酐和1mL吡啶形成的混合溶剂中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，电磁搅拌下110℃反应15分钟。冷至室温后加入40mL乙酸乙酯得深红色沉淀。该沉淀用二氯甲烷洗涤至二氯甲烷洗液为无色后得0.014g红色固体不对称吲哚菁染Cy3，收率20.2％。
制备实施例4不对称吲哚菁染料Cy3的合成步骤如下步骤1制备聚乙二醇-8000负载的一次甲基亲电试剂聚乙二醇-8000负载的苯胺11.12g(1.35mmol)，原甲酸三乙酯10mL(60mmol)溶解在30mL冰醋酸中，电磁搅拌下55℃反应5.5小时。冷至室温向反应液中加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟后静置10～20分钟，过滤得淡黄色固体物聚乙二醇-8000负载的一次甲基亲电试剂8.39g，收率75.3％。
步骤2制备聚乙二醇-8000负载的二次甲基半菁染料聚乙二醇-8000负载的一次甲基亲电试剂8.66g(1.05mmol)，1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.28g(1.05mmol)和原甲酸三乙酯0.34mL(2.08mmol)溶解在10mL无水乙醇中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min。在电磁搅拌下加热至回流，反应2.5小时。冷至室温加入50mL乙醚，电磁搅拌5分钟后静置10～20分钟，过滤得黄色固体物聚乙二醇-8000负载的二次甲基半菁染料5.83g，收率65.2％。
步骤3制备不对称吲哚菁染料Cy3聚乙二醇-8000负载的二次甲基半菁染料2.044g(0.24mmol)、1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐0.042g(0.12mmol)溶解在由2mL醋酸酐和1mL吡啶形成的混合溶剂中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，电磁搅拌下110℃反应15分钟。冷至室温后加入40mL乙酸乙酯得深红色沉淀。该沉淀用二氯甲烷洗涤至二氯甲烷洗液为无色后得0.016g红色固体不对称吲哚菁染料Cy3，收率21.2％。
权利要求
1.一种不对称吲哚菁染料的固相合成方法，该不对称吲哚菁染料的化学结构通式为 通式(1)中，R1、R2为-SO3H、-SO-3、-SO3K、-COOH、-COO-、-COOK、H的一种，R1、R2相同或不相同，R1、R2在吲哚结构单元的4-、5-、6-、7-位中一处，R3、R4为C1～10烷基或m为0～8的-CH2(CH2)mCOOH基或m为0～8的-CH2(CH2)mSO3H基，R3与R4为不相同的基团，n为1或2，其特征在于该方法包括下述步骤步骤1制备聚乙二醇负载的次甲基亲电试剂将结构式为(2)的聚乙二醇负载的苯胺、原甲酸酯或1，1，3，3-四甲氧基丙烷按摩尔比为1∶15～50的配比加入其总量为1.4～3倍的冰醋酸中，搅拌下30～60℃反应1～5.5小时，冷至0～30℃加入反应液体积0.9～4倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得结构式为(3)或(4)的聚乙二醇负载的次甲基亲电试剂，化学反应方程式如下 上反应式中的PEG为聚乙二醇载体；步骤2制备聚乙二醇负载的半菁染料将结构式为(3)或(4)的聚乙二醇负载的次甲基亲电试剂、结构式为(5)吲哚化合物以1∶0.5～2的摩尔比溶于其总量1.0～10倍量的无水乙醇或冰醋酸中，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，搅拌下70～110℃反应1～5小时，冷至0～30℃加入反应液体积2.5～10倍量的乙醚，搅拌5分钟，静置10～20分钟，过滤，得结构式为(6)的聚乙二醇负载的半菁染料，化学反应方程式如下 上反应式中R1、R3和n与通式(1)相同；步骤3制备不对称吲哚菁染料将结构式为(6)的聚乙二醇负载的半菁染料、结构式为(7)的吲哚化合物按摩尔比为1∶0.45～1溶于其总量为1.4～6倍的醋酸酐和吡啶的混合溶剂中，在混合溶剂中醋酸酐与吡啶的体积比为2∶1，通入氮气，氮气的流速为0.2～0.3L/min，搅拌下20～110℃反应15～60分钟，冷至室温，加入反应液总体积7～15倍量的乙酸乙酯得沉淀物，用二氯甲烷洗涤沉淀物至二氯甲烷洗液为无色，得不对称吲哚菁染料，化学反应方程式如下
2.按照权利1所述的不对称吲哚菁染料的固相合成方法，其特征在于所说的不对称吲哚菁染料通式(1)中，R1、R2其中为-SO-3，R1、R2在吲哚结构单元的5-位，R3其中为乙基，R4其中为-CH2(CH2)4COOH基，n为1或2，为结构式(8)所示的化合物 (8)式中n是1时为不对称吲哚菁染料Cy3，n是2时为不对称吲哚菁染料Cy5。
3.按照权利1所述的不对称吲哚菁染料的固相合成方法，其特征在于所说的载体聚乙二醇的平均分子量为1000～8000。
4.按照权利1所述的不对称吲哚菁染料的固相合成方法，其特征在于在工艺步骤1中，将结构式为(2)的聚乙二醇负载的苯胺、原甲酸酯或1，1，3，3-四甲氧基丙烷其中按摩尔比为1∶20～45的配比加入其总量为1.4～3倍的冰醋酸中。
5.按照权利1所述的不对称吲哚菁染料的固相合成方法，其特征在于在工艺步骤2中，所说的次甲基亲电试剂其中为一次甲基亲电试剂或三次甲基亲电试剂。
全文摘要
一种不对称吲哚菁染料的固相合成方法，包括制备聚乙二醇为载体负载次甲基亲电试剂；用该负载的亲电试剂与亲核性1－位取代2－甲基吲哚或其衍生物反应制成负载的半菁染料；而另一具有亲核性碳原子的1－位取代2－甲基吲哚或其衍生物进攻负载的半菁染料时，发生亲核反应得到高纯度的结构不对称吲哚菁染料。反应中被聚乙二醇负载的各物质，具有在多数有机溶剂中可溶，而在乙醚中不溶的特点，使得过程中的每一反应，具有均相、易反应的优点，又具有固相反应生成产物易于分离的特点。采用本发明所制备的不对称吲哚菁染料成本低、生产周期短、产品易于纯化、纯度高，无需使用色谱方法分离纯化。
文档编号C09B23/00GK101029179SQ20071001732
公开日2007年9月5日 申请日期2007年1月30日 优先权日2007年1月30日
发明者李宝林, 窦丽芳, 蒋林玲 申请人:陕西师范大学