专利名称：水溶性3h－吲哚菁染料的制作方法
技术领域：
本发明属于精细化工高新技术功能染料。
背景技术：
3H-吲哚菁染料是于二十世纪八十年代才被发现其具有较好的荧光性能，可用作生物荧光标示剂应用在DNA自动测序中。该类染料具有与生物基质结合后荧光增强，最大吸收波长可调谐范围大(300nm-1800nm)等特点，可根据各类需要合成得到各种适直波段吸收的系列产品，尤其是近红外荧光染料。近红外染料可避免检测时荧光背景的干扰，使检测灵敏度大幅提高，成为荧光标示剂的重要发展方向。而3H-吲哚菁染料是目前使用最广泛的近红外染料。作为嵌入剂及荧光标示剂在生物芯片，DNA测序，免疫检测等方面有重要应用，但各方面性能良好的水溶性荧光染料品种较少。
Waggoner等设计开发的商品化水溶性荧光染料Cy3，Cy5，Cy7的结构如下 其结构特点是吲哚环5位上有磺酸基存在，其中一个N原子上的取代基为羧戊基，另一个N原子上的取代基与之相同或为短链烷基。因其荧光及水溶性等各方面性能良好，是目前应用最好的水溶性荧光探针。故以其为新化合物母体结构。光稳定性差是该类荧光探针的最大弱点。
姚祖光等研究了吲哚环N原子上引入各种取代基对吲哚菁染料化合物光稳定性的影响。其研究的吲哚菁染料与Waggoner等设计开发的不同之处在于吲哚环的5位上无磺酸基存在。绝大多数为非水溶性染料，主要用作CD-R光盘上的光记录介质。研究结果表明N原子上为苄基取代时，吲哚菁染料的稳定性高于相应的链烷基取代的染料。
Patonay，陈萍，A.J.G.Mank，姚祖光等研究了六元或五元环，方酸残核，克酮酸残核等甲川链吲哚菁染料，结果证明这些刚性环的引入使吲哚菁染料的光稳定性大幅提高。但他们研究的吲哚菁染料5位上也无磺酸基存在，且N原子上取代基也不含邻或间或对羧苄基。
随着科学术的进步，荧光标示技术得到了飞速发展，使荧光标示剂—荧光染料在DNA自动测序、免疫分析、临床诊断、新药设计和开发中得到了重要应用。尤其近年来以荧光染料为标示剂具有多功能的生物芯片的出现，使荧光染料有了更加广阔的应用前景。荧光性能、光稳定性、溶解性、成本价格是荧光染料在生物领域中应用的重要影响因素。我国在水溶性生物荧光标记探针新产品开发方面研究较少，国外已有部分产品商品化。但光稳定性差，合成难，分离提纯更难，价格昂贵是目前使用的荧光探针存在的主要问题。通过吲哚环N原子上取代基的更换及甲川链中刚性环的引入，对目前主要使用的进口商品化生物探针Cy3，Cy5，Cy7进行结构改造，使新染料化合物的光稳定性、荧光性能提高，成本降低。并简化分离方法，使之适合于工业化生产。
发明内容
本发明对称或非对称水溶性3H-吲哚菁染料的分子结构具有如下通式 其中Y＝-CH-，-CHCH＝CH-，-CHCH＝CHCH＝CH-， Z＝O，S，Se，Te，CR2R3(R2，R3＝H，CH3，CF3，C2H5)；R1＝(CH2)mCH3，(CH2)mCOOH，(CH2)mSO3-， m＝0-18R4，R5，R6，R7＝H，F，(CH2)pCF3，(CH2)pCN，SO3-，SO3H，(CH2)pCH3，OH，O(CH2)pCH3，(CH2)pCOOH；P＝0-4不难看出水溶性3H-吲哚菁染料最大的结构特征是在带有水溶性基的2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐的1位N原子上连接着邻或间或对-羧苄基，使新染料上的羧基可与生物基质中NH2共价结合，加上甲川链中刚性环的引入，使整个染料增加了光稳定性，提高了荧光性能，降低了生产成本。
水溶性3H-吲哚菁染料的合成，首先是制备该类染料的中间体，即由2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾盐与邻或间或对-氯甲基苯甲酸反应，两者的摩尔比为1∶1-2，在邻二氯苯中回流反应8-16小时，可制得1-邻或间或对-羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾中间体 其次，将制得的2分子1-邻或间或对-羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾使其自身在缩合剂的参与下进行缩合反应，可制得对称性的具有上述通式的水溶性3H-吲哚菁染料。也可将1-邻、间或对-羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾与其它不同结构的中间体在缩合剂的参与下进行缩合，制得不对称的水溶性3H-吲哚菁染料。这两类染料，均是由两者两端的氮杂环通过共轭甲川链使它们连接在一起，因而，将这些染料按共轭甲川链形式的不同，大致可分为五种类型A型，B型，C型，D型，E型。A型为线性甲川链吲哚菁染料；B型为方酸残核甲川链吲哚菁染料；C型为克酮酸残核甲川链吲哚菁染料；D型为六元或五元环甲川链吲哚菁染料；E型为异佛尔酮残核甲川链吲哚菁染料。
它们的基本结构式及合成条件如下 上述五类反应原料及产物中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，Z的代表含义与前述相同。
本发明水溶性3H-吲哚菁染料的特点为(1)新染料化合物的结构特点是分子为大的π共轭体系，最大吸收在540-800nm之间；吲哚环5位上有磺酸基存在，使分子具有水溶性，增大了分子的稳定性，减少了分子的聚集程度；两个N原子上至少有一个羧苄基取代基，其中的羧基可与生物基质中的NH2共价结合。
(2)本产品通过吲哚环N原子上羧苄基及甲川链中刚性环的引入，对目前主要使用的进口商品化生物探针Cy3，Cy5，Cy7进行结构改造，使新染料的光稳定性能提高。同时由于N原子上的取代基的更换，也使染料的荧光性能有所改善，染料中间体的合成原料变得相对易得，价格低廉，反应活性提高，从而使染料合成容易，成本降低。
(3)可以采用普通硅胶柱，用适宜比例的正丁醇、吡啶、乙醇和水为洗脱剂进行分离，使原来仅靠RP-C18或RP-C8柱仪器分离变得更加简单、成本低、批处理量大，适合于工业化生产。
(4)新染料产品可应用于生物分析(如DNA的嵌入剂及DNA芯片中的荧光标示剂)、药物设计与开发、太阳能电池(光敏剂)、光盘(如可录型光盘的光记录介质)、照相感光(增感剂如感红剂)、纺织等领域，有着广阔的产业化前景。
具体实施例方式
实施例11-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾染料中间体的合成4.0mmol2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾盐和4.8mmol对氯甲基苯甲酸在10ml邻二氯苯中混合，并加热到105-110℃，反应10小时后，冷却，移去溶剂，残渣固体用异丙醇研磨，得到中间体固体颗粒。
实施例2(A型n＝1，Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)在已加热至回流的2.8mmol的1-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾的吡啶溶液中，滴入5.0mmol原甲酸三乙酯。然后继续反应约2-2.5h后，冷却至室温。反应液用乙醚稀释，静置，倾去上层清液，暗红色固体凝结在瓶底，用甲醇溶解，然后加入异丙醇使沉淀再次析出，过滤，得粗固体产品，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液正丁醇∶吡啶∶乙醇∶水＝3-2∶1∶1∶0-0.5洗脱，收集紫粉色组分，收率40％。
实施例3(A型n＝2，Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2CH3；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)3.0mmol的1-乙基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾和3.4mmol的缩合剂(PhNHCH＝CHCH＝NPhHCl)溶于12ml醋酸和醋酐中，然后在110℃下反应2h。冷却，旋转蒸发除去溶剂。固体残渣用乙酸乙酯洗涤，然后将之溶于醋酐和吡啶中，再加入3.0mmol1-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾，于110℃下反应约2-3h。冷却，加乙醚稀释，静置。过滤，得黑蓝色固体。硅胶柱分离，洗脱液为正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1。
实施例4(A型n＝3，Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)0.5mmol缩合剂(PhNHCH＝CHCH＝CHCH＝NPh)溶于热的4ml醋酐和1ml吡啶混合物中，然后加入1.0mmol1-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾，再升温回流10分钟，冷却，加乙醚稀释，静置。过滤，沉淀物用甲醇溶解，再用异丙醇析出，得黑绿色固体。硅胶柱分离，洗脱液为正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1。
实施例5(B型Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)将1.4mmol的1-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾的8ml吡啶溶液和0.7mmol方酸的10ml苯和正丁醇(1∶1)溶液分别加入到三口瓶中，加热回流4h后冷却至室温。加乙醚稀释，静置。过滤，得蓝色固体。硅胶柱分离，洗脱液为正丁醇∶吡淀∶乙醇＝3-1∶1∶1∶0-0.5。
实施例6(C型Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)1.4mmol的1-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾的8ml吡啶溶液和0.7mmol克酮酸的10ml苯和正丁醇(1∶1)溶液混合后，加热回流4h，冷却至室温。加乙醚稀释，静置。过滤，得绿色固体。硅胶柱分离，洗脱液为正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1。
实施例7(D型Z＝CR2R3；R2，R3＝CH3；R1＝CH2C6H4COOH；R4，R6R7＝H；R5＝SO3K)3.0mmol的1-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾和2.0mmol五元或六元环缩合剂，以30ml醋酸酐溶解，再加入5.0mmol无水醋酸钠，于氮气室温下搅拌6h。加入乙醚稀释，静置。过滤，沉淀物用甲醇溶解，滤去不溶物，减压浓缩。硅胶柱分离，洗脱液为正丁醇∶吡啶∶乙醇＝3-1∶1∶1或三氯甲烷∶乙醇＝4∶1，收集绿色组分。
实施例8(E型Z＝S；L＝SCH3；R1＝(CH2)4SO-3；R4，R5R6R7＝H；X＝CH3C6H4SO-3)3.0mmol的1-对羧苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾，9.0mmol异佛尔酮加入到35ml醋酸酐中，加热至110℃，反应约15h，冷却，析出固体后，过滤。滤饼和6.0mmolN-(δ-磺丁基)-2-甲硫基杂环季铵盐加入到10ml吡啶中，回流2h。冷却至室温。加乙醚稀释，静置。过滤得染料固体。
权利要求
1.一类由2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉磺酸衍生物与其结构相同或不同的另一个中间体，经缩合剂的连接制得的水溶性3H-吲哚菁染料，其特征在于该对称或非对称的水溶性3H-吲哚菁染料的分子结构具有如下通式 其中Y＝-CH-，-CHCH＝CH-，-CHCH＝CHCH＝CH-， Z＝O，S，Se，Te，CR2R3(R2，R3＝H，CH3，CF3，C2H5)；R1＝(CH2)mCH3，(CH2)mCOOH，(CH2)mSO3-， m＝0-18R4，R5，R6，R7＝H，F，(CH2)pCF3，(CH2)pCN，SO3-，SO3H，(CH2)pCH3，OH，O(CH2)pCH3，(CH2)pCOOH；P＝0-4
2.一类按照权利要求1所述水溶性3H-吲哚菁染料的分离方法，其特征在于染料合成后，经过冷却，过滤，采用硅胶柱作为分离载体，用正丁醇∶吡啶∶乙醇∶水＝1-3∶1∶1∶0-0.5(体积比)作为洗脱液，得到染料。
全文摘要
本发明提供了一类对称或非对称的水溶性3H－吲哚菁染料,它的分子结构具有如下通式:其中:见右式。该类染料由于羧苄基的引入,增加了光稳定性,提高了荧光性能,降低生产成本。可用于生物分析、药物设计与开发,太阳能电池、光盘、照相感光等领域。
文档编号C09B23/00GK1364829SQ0210292
公开日2002年8月21日 申请日期2002年1月30日 优先权日2002年1月30日
发明者彭孝军, 王丽秋 申请人:大连理工大学