异吲哚硼杂荧光染料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光染料领域，具体地，涉及异吲哚硼杂荧光染料及其制备方法和应用。

背景技术：

近红外荧光染料由于具有优异的性能在生物成像、光动力疗法光伏和光电子学中有着广泛的应用，近年来受到人们的广泛关注(chem.rev.,2012,112,4391)。例如，近红外荧光染料可用于生物成像，具有背景干扰低、样品穿透性强等优点，能够实现对一些生物样品如活体组织的细胞和亚细胞进行实时原位在线无损伤检测，并可用于监控活细胞与活体中的生物分子以及它们的运动过程，在化学生物学和临床检验诊断等方面显示了较好的应用前景。目前真正适合产业化应用的具有摩尔消光系数大、荧光量子效率、光稳定性好并且可以进行修饰衍生调控吸收发波段等诸多优点于一身的近红外荧光染料分子种类非常有限。因此，设计开发具有实用价值的功能性近红外荧光染料分子具有十分重要的意义。

1999，burgess课题组首次提出合成了n2o2-bodipys，与bodipy相比n2o2-bodipys中的芳环不能围绕芳基-吡咯键旋转，约束之后导致环的刚性以及共轭增大，所以该类染料吸收发射红移的同时荧光也得到增强(chem.commun.,1999,1889.)。

而目前，大多数的的异吲哚硼杂近红外荧光染料的制备过程繁琐、方法复杂，且制得的异吲哚硼杂近红外荧光染料的光谱选择性差，量子产率低且水溶性不好，不利于更进一步的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种异吲哚硼杂荧光染料及其制备方法和应用，本发明提供的制备方法制得的异吲哚硼杂荧光染料不仅有良好的光谱选择性、优异的荧光量子产率和溶解性，而且可以通过脑文格缩合反应进行衍生，由于成盐之后具有良好的水溶性和渗入细胞的能力，同时还可以应用于定位线粒体的成像。

为了实现上述目的，本发明提供了一种异吲哚硼杂荧光染料，所述异吲哚硼杂荧光染料的结构如式(i)所示，

其中，r1、r2、r3、r4各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或c1-c12的烷氧基；

r5、r6、r7、r8各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素、c1-c12的烷氧基、环烷基或芳基；

r9为氢、烯基或c1-c12的烷基；

r10、r11各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或烯基；

r12为氢、c1-c12的烷基、卤素、烯基或c1-c12的烷氧基；

r13为c1-c12的烷基，x为卤素。

本发明还提供了一种上述异吲哚硼杂荧光染料制备方法，其中，所述制备方法包括如下步骤：在溶剂存在下，将卤代烃(r13-x)与如式(ii)所示结构的的化合物按照1：5-10的摩尔比在20-25℃、黑暗中搅拌12-15h、纯化，即得到如式(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料；

其中，r1、r2、r3、r4各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或c1-c12的烷氧基；

r5、r6、r7、r8各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素、c1-c12的烷氧基、环烷基或芳基；

r9为氢、烯基或c1-c12的烷基；

r10、r11各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或烯基；

r12为氢、c1-c12的烷基、卤素、烯基或c1-c12的烷氧基；

所述r13为c1-c12的烷基，x为卤素。

本发明还提供了一种上述异吲哚硼杂荧光染料的在荧光标记和生物成像中的应用。

通过上述技术方案，本发明中制得的异吲哚硼杂荧光染料不仅有良好的光谱选择性、优异的荧光量子产率和溶解性，而且可以通过脑文格缩合反应进行衍生，由于成盐之后具有良好的水溶性和渗入细胞的能力，同时还可以应用于定位线粒体的成像。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是检测例2中的紫外吸收光谱图；

图2是检测例3中的荧光发射光谱图；

图3是应用例1中的细胞成像图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明中提供了异吲哚硼杂荧光染料，所述异吲哚硼杂荧光染料的结构如式(i)所示，

其中，r1、r2、r3、r4各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或c1-c12的烷氧基；

r5、r6、r7、r8各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素、c1-c12的烷氧基、环烷基或芳基；

r9为氢、烯基或c1-c12的烷基；

r10、r11各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或烯基；

r12为氢、c1-c12的烷基、卤素、烯基或c1-c12的烷氧基；

r13为c1-c12的烷基，x为卤素。

本发明中，所述基团r1-r13和x均可以各自独立地在很宽的范围内选择，但是为了提高反应物的转换率以及所制得产物的水溶性，优选地，所述r1、r2、r3、r4各自独立为氢、甲基、乙基、丙基、叔丁基、氯、溴、碘、甲氧基或乙氧基；

r5、r6、r7、r8各自独立为氢、甲基、乙基、丙基、叔丁基、正庚基、氟、氯、溴、碘、甲氧基、乙氧基、环戊基、环己基或苯基；

r9为氢、甲基、乙基、丙基、叔丁基、环戊基、环己基、乙烯基；

r10、r11各自独立为氢、甲基、乙基、丙基、氯、溴、碘或4-甲基苯乙烯基；

r12为氢、甲基、乙基、丙基、氟、氯、溴、碘、环戊基、环己基、4-甲基苯乙烯基或4-甲氧基苯乙烯基；

r13为c1-c7的烷基，x为氯、溴、碘。

在本发明的一种具体的实施方式中，为了进一步提高所制得异吲哚硼杂荧光染料的水溶性和光谱选择性，优选地，所述r1-r9为氢，r10为甲基、r11为乙基，r12为甲基或4-甲氧基苯乙烯基，r13为甲基，x为碘。

在另一种具体的实施方式中，所述的异吲哚硼杂荧光染料的具体结构如式(g)或(i)所示；

本发明还提供了一种上述异吲哚硼杂荧光染料的制备方法，其中，所述制备方法包括如下步骤：

在溶剂存在下，将卤代烃(r13-x)与如式(ii)所示结构的的化合物按照1：5-10的摩尔比在20-25℃、黑暗中搅拌12-15h、纯化，即得到如式(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料；

其中，r1、r2、r3、r4各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或c1-c12的烷氧基；

r5、r6、r7、r8各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素、c1-c12的烷氧基、环烷基或芳基；

r9为氢、烯基或c1-c12的烷基；

r10、r11各自独立为氢、c1-c12的烷基、卤素或烯基；

r12为氢、c1-c12的烷基、卤素、烯基或c1-c12的烷氧基；

所述r13为c1-c12的烷基，x为卤素。

本发明提供的制备方法中还包括了化合物(ii)的制备方法：

1)在溶剂存在下，将如式(ii-1)所示结构的化合物与如式(ii-2)所示结构的化合物进行第一接触反应得到第一产物；

2)在溶剂存在下，所所述第一产物中添加4-吡啶硼酸进行第二接触反应，得到如式(ii)所示结构的化合物；

在上述的制备方法中，所述式(ii)、(ii-1)和(ii-2)中的各基团和x均可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高各步骤产物的产率以及制得的异吲哚硼杂荧光染料的水溶性和光谱选择性，优选地，所述r1、r2、r3、r4各自独立为氢、甲基、乙基、丙基、叔丁基、氯、溴、碘、甲氧基或乙氧基；

r5、r6、r7、r8各自独立为氢、甲基、乙基、丙基、叔丁基、正庚基、氟、氯、溴、碘、甲氧基、乙氧基、环戊基、环己基或苯基；

r9为氢、甲基、乙基、丙基、叔丁基、环戊基、环己基、乙烯基；

r10、r11各自独立为氢、甲基、乙基、丙基、氯、溴、碘或4-甲基苯乙烯基；

r12为氢、甲基、乙基、丙基、氟、氯、溴、碘、环戊基、环己基、4-甲基苯乙烯基或4-甲氧基苯乙烯基；

r13为c1-c7的烷基，x为氯、溴、碘；

在本发明的一种优选实施方式中，为了提高所制得的异吲哚硼杂荧光染料的产率、水溶性和光谱选择性，优选地，所述r1-r9为氢，r10为甲基、r11为乙基，r12为甲基或4-甲氧基苯乙烯基；r13为甲基，x为碘。

在本发明的制备方法中，各原料的具体用量可以根据需要在宽的范围内进行调节，但是为了提高反应物的转换率，促进反应进行同时从降低成本的角度考虑，优选地，相对于1mmol的如式(ii-1)所示的化合物，如式(ii-2)所示的化合物的用量为1.5-2.3mmol，所述4-吡啶硼酸的用量为2-10mmol；

本发明中各步骤所用的溶剂可以在宽的范围内选择，但是为了促进反应的进行，提高各步产物的产率，优选地，所述溶剂各自独立为二氯甲烷或甲苯。

在本发明中，所述第一接触反应和第二接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得第一接触反应和第二接触反应能够充分进行，优选地，所述第一接触反应的反应条件为：反应温度为0-20℃，反应时间为4-5h；

所述第二接触反应的反应条件为：反应温度为20-120℃，反应时间为2-12h。

另外，本发明还提供了一种上述异吲哚硼杂荧光染料在荧光标记和生物成像中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，核磁测定采用瑞士bruker公司的av-300型核磁共振仪进行；质谱的测定采用美国仪器集团的hplc/esi-ms型质谱仪进行；紫外光谱的测定采用日本岛津公司的uv-2450型紫外/可见分光光度计进行，荧光光谱的测定日本日立公司的·-4500fl荧光分光光度计进行，相对荧光量子产率的测定采用荧光光谱的测定日本日立公司的f-4500fl荧光分光光度计进行，单晶衍射的测定采用德国brukeraxs公司的smarapexⅱx-单晶衍射仪进行，其中λmax表示最大吸收波长、εabs表示摩尔消光系数，λem^max表示最大荧光发射波长，φf表示相对荧光量子产率和stokes-shift表示stokes位移；相对荧光量子产率(φf)的测定是以其中相对荧光量子产率φf的测定以cv(φ＝0.54，在甲醇溶液中)为标准染料，根据公式φf＝φs*(ix/is)*(as/ax)*(nx/ns)²计算所得，其中φs为标准物cv的荧光量子产率，i为谱图积分面积，a为吸光度，n为溶剂的折光率，下角标s为标准物，x为待测物。

以下实施例中使用的原料：三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、乙二醇、无水乙醚、哌啶是上海凌峰化学试剂有限公司的产品，三乙胺、二氯甲烷、甲苯是国药集团化学试剂有限公司的产品，三溴氧磷、三氯氧磷、冰醋酸、是无锡亚盛化学试剂有限公司的产品，盐酸是扬州沪宝化学试剂有限公司的产品，氢氧化钠是西陇化工股份有限公司的产品，邻苯二甲酰亚胺、对甲氧基苯甲醛、甲基硼酸、苯硼酸、4-甲氧基苯硼酸和4-二甲基氨基苯硼酸是安耐吉化学公司的产品，4-吡啶硼酸、2-羟基-苯硼酸、2-萘硼酸和1-蒽硼酸是苏州苏凯路有限公司的产品。

制备例1

原料1-(3-溴-1h-异吲哚-1-亚基)-n,n-二甲基甲胺的制备：将1.5g(5.24mmol)pobr3置于于250ml圆底烧瓶中，加50ml二氯甲烷，冷却至0℃，在搅拌下向溶液中滴加0.27ml(3.49mmol)dmf，5min内滴完，然后将反应置于20℃下搅拌0.5小时，冷却至0℃，称取1.0g(7.5mmol)异吲哚-1-酮用二氯甲烷溶解后置于恒压滴液漏斗滴加到上述混合物中。滴加完成后移入60℃油浴中加热回流，tlc点板。2.5h反应完全，待冷却至室温加入100ml冰水，用碳酸钠调节ph值至8，萃取，浓缩，过柱子，重结晶得淡黄色固体。

制备例2

原料(2-羟基苯基)-2h-异吲哚-1-甲醛的制备：称取1-(3-溴-1h-异吲哚-1-亚基)-n,n-二甲基甲胺400mg(1.66mmol)，2-羟基苯硼酸331mg(3.5mmol)na2co3(1m,5ml)于100mlschlenk反应器中，在三冲三放后在通氩气的条件下加入pd(pph3)460mg,(0.05mmol)，再次三冲三放后，移至75℃油浴中加热搅拌12h。冷却至室温后用水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪旋蒸得黄色固体。用无水乙醇溶解后，加入饱和氢氧化钠溶液加热回流3h。除去乙醇后，用水与乙酸乙酯萃取，用稀hcl(3m)中和至ph值为7，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪旋蒸，重结晶得黄色固体

(2-羟基苯基)-2h-异吲哚-1-甲醛的核磁氢谱检测结果如下：¹hnmr(300mhz,d6-dmso)δ13.39(s,1h),10.18(s,1h),9.85(s,1h),8.12(s,1h),7.77(d,j＝8.3hz,1h),7.56(d,j＝7.3hz,1h),7.34-7.25(m,2h),7.17-7.13(m,1h),7.03(d,j＝7.9hz,1h),6.98-6.93(m,1h).

制备例3

如式(ii’)所示化合物的制备：

称取(2-羟基苯基)-2h-异吲哚-1-甲醛30mg(0.13mmol)用20ml二氯甲烷溶解，接着向溶液中加入2,4-二甲基-3-乙基吡咯32mg(0.26mmol)。在冰浴(温度为0℃)条件下加入稀释过的pocl30.01ml(0.13mmol)，恢复至25℃并搅拌4小时后通过硅胶柱色谱法提纯制得第一反应产物；用甲苯溶解第一产物后并加入4-吡啶硼酸160mg(1.3mmol)、回流2小时。蒸发溶剂后，残余产物通过硅胶柱色谱法(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到蓝色粉末即为式(ii’)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料(重量产率为49％)。

如式(ii’)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料的的核磁氢谱和核磁碳谱参数如下所述：

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)δ8.36(d,j＝8.3hz,1h),8.25(d,j＝8.0hz,1h),8.18(d,j＝5.8hz,4h),7.63(t,j＝7.5hz,1h),7.48-7.66(m,2h),7.30(d,j＝8.2hz,1h),7.05(t,j＝7.5hz,1h),6.96(d,j＝5.3hz,2h),2.43(s,3h),2.37(q,j＝7.0hz,2h),2.29(s,3h),1.00(t,j＝7.4hz,3h).¹³cnmr(125mhz,d6-dmso)δ155.9,150.3,148.4,142.4,135.0,134.6,133.8,131.8,130.2,129.4,127.7,126.9,126.3,126.2,125.5,123.7,120.7,120.0,118.3,118.2,16.9,14.8,12.9,9.4.hrms(apci)calcd.forc28h24bn3o[m+h]⁺:430.2085,found:430.2084。

制备例4

如式(ii”)所示化合物的制备：

用15ml甲苯溶解化合物80mg(0.19mmol)的如式(ii’)所示的异吲哚硼杂荧光染料于50mlschlenk反应器中，然后用注射器向上述体系中加入对甲氧基苯甲醛59mg(1.9mmol)、哌啶(1.5ml)和乙酸(0.5ml)得到混合溶液。将所述混合溶液在140℃油浴中回流48小时，并且通过使用含有无水cacl2的索格利特萃取器除去反应期间形成的任何水。停止反应后，在真空下除去溶剂。粗产物通过硅胶柱色谱法(硅胶，洗脱液：乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到绿色粉末即如式(ii”)所示的异吲哚硼杂荧光染料(重量产率为29％)；

如式(ii”)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料的的核磁氢谱和核磁碳谱参数如下所述：

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.17(t,j＝6.0hz,3h),8.01(d,j＝3hz,1h),7.95(d,j＝3hz,1h),7.81(d,j＝16.7hz,1h),7.54(d,j＝8.2hz,3h),7.43(m,3h),7.31(d,j＝8.2hz,1h),7.18-7.08(m,3h),7.00(t,j＝7.8hz,3h),3.89(s,3h),2.70(q,j＝6.0hz,2h),2.31(s,3h),1.20(t,j＝7.4hz,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ159.9,156.8,148.04,147.8,143.9,135.1,134.4,133.6,133.4,131.6,130.7,129.1,128.9,128.1,127.1,126.6,126.5,126.1,123.7,120.4,120.2,120.0,118.8,118.5,114.7,114.5,55.4,18.8,14.1,9.3.hrms(apci)calcd.forc36h30bn3o2[m+h]⁺:548.2504,found:548.2524.

实施例1

式(g)所示的异吲哚硼杂荧光染料的制备：

用1ml氯仿溶解15mg(0.03mmol)如式(ii’)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料于10ml的离心管制得溶液，将ch3i159mg(1.12mmol)加入上述溶液并在20℃、黑暗中搅拌12h。收集沉淀，并用石油醚洗涤三次，得到蓝色粉末即为如式(g)所示的异吲哚硼杂荧光染料(重量产率为90％)。

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)δ8.49(d,j＝6.0hz,2h),8.39(d,j＝8.1hz,1h),8.30(d,j＝9.2hz,2h),8.21(d,j＝7.7hz,1h),7.67(d,j＝7.7hz,1h),7.62(d,j＝5.8hz,2h),7.56-7.46(m,2h),7.41(d,j＝8.1hz,1h),7.09(d,j＝7.4hz,1h),4.07(s,3h),2.46(s,3h),2.20-2.31(m,5h),1.00(t,j＝7.3hz,3h).¹³cnmr(125mhz,d6^-dmso)δ155.0,150.2,143.5,142.8,135.6,135.2,134.3,131.5,130.6,130.0,129.1,127.7,127.2,126.7,125.6,123.9,121.4,121.0,120.2,118.7,118.0,47.2,16.9,14.7,12.9,9.5.hrms(esi)calcd.forc29h27bin3o[m-i]⁺:444.2242,found:444.2229。

实施例2

式(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料的制备：

用1ml氯仿溶解15mg(0.03mmol)如式(ii”)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料于10ml的离心管制得溶液，将ch3i159mg(1.12mmol)加入上述溶液并在20℃、黑暗中搅拌12h。收集沉淀，并用石油醚洗涤三次，得到蓝色粉末即为如式(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料(重量产率为90％)。

如式(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料的磁氢谱和核磁碳谱参数如下所述：

¹hnmr(300mhz,d6-dmso)δ8.41(t,j＝6.8hz,3h),8.33-8.22(m,3h),7.78-7.58(m,6h),7.53-7.44(m,4h),7.23(d,j＝16.9hz,2h),7.12-7.03(m,3h),3.98(s,3h),3.82(s,3h),2.66(q,j＝6hz,2h),2.31(s,3h),1.10(t,j＝7.2hz,3h).¹³cnmr(125mhz,d6-dmso)δ160.1,147.1,143.5,136.1,134.7,134.1,131.5,130.2,128.7,128.4,127.4,127.2,127.1,124.2,121.7,121.3,120.2,117.9,117.2,116.7,114.9,79.3,55.4,47.2,18.2,13.9,9.2.hrms(esi)calcd.forc37h33bin3o2[m-i]⁺:562.2660,found:562.2654。

检测例1

对实施例1和实施例2制得的如式(g)和(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料在甲醇和dmso中的的光谱性质；

其中，式(g)所示的异吲哚硼杂荧光染料的测试结果如表1所示，

式(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料的测试结果如表2所示；

表1-2中：stokes-shift＝λem^max-λmax(nm)＝1/λmax–1/λem^max(cm^-1)。

表1

表2

检测例2

对式(g)和(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料进行紫外吸收表征，结果见图1所示。其中，实线代表的是如式(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料的紫外吸收曲线；虚线代表的是如式(i)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料的紫外吸收曲线。

检测例3

对式(g)和(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料进行表征荧光发射光谱表征，结果见图2所示。其中，实线代表的是如式(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料的紫外吸收曲线；虚线代表的是如式(i)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料的紫外吸收曲线。

应用例1

将实施例1制得的如式(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料进行细胞荧光成像应用：小鼠细胞(b16-wt)首先用浓度为2μmol/l的如式(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料和罗丹明b(rh123)共染色后在37℃，20％co2气氛中孵育45,min。然后用pbs(ph为7.2-7.4)洗涤三次将细胞与细胞染剂(dapi)(0.5μm)在37℃，20％co2气氛中孵育30分钟，再用pbs洗涤三次。在替换培养基后，使用激光共聚焦显微镜进行细胞成像，具体结果见图3所示。

图3中：左图(1)是式子(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料、rh123和dapi细胞共染色的细胞成像图，其中，式子(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料呈现红色荧光，rh123呈现绿色荧光，dapi呈现蓝色荧光。中图(2)是rh123与dapi细胞共染色的细胞成像图，其中，rh123呈现绿色荧光、dapi呈现蓝色荧光。右图(3)是式子(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料和dapi细胞共染色的细胞成像图，其中，式子(g)所示结构的异吲哚硼杂荧光染料呈现红色荧光，dapi呈现蓝色荧光。

图1中是对式(g)和(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料进行紫外吸收表征的结果，结果显示见图1所示。由图可看出(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料较(g)所示的异吲哚硼杂荧光染料的紫外吸收光谱红移了接近77nm.

图2中是对式(g)和(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料进行荧光发射光谱表征的结果，结果显示见图2所示。由图可看出(i)所示的异吲哚硼杂荧光染料较(g)所示的异吲哚硼杂荧光染料荧光发射波长红移了接近84nm。

从图3可以看出如式(g)所示结构的异吲哚硼杂荧染料进行细胞共染色的结果可以得出本发明提供的异吲哚硼杂荧染料能够用作近红外线粒体靶向荧光探针。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。