一类以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医用材料领域，涉及一类以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料及其制备方法与应用。

技术背景

随着成像技术的发展，近红外荧光成像由于其对生物体损伤小，组织穿透能力强，生物背景干扰低等优点已广泛应用于生物成像领域。作为近红外荧光探测的有机染料主要包括菁染料类（如cy系列）、bodipy类、罗丹明类、方酸类和卟啉类等。菁染料具有光谱范围广、摩尔吸光系数高、荧光量子产率高、灵敏度高以及细胞毒性低等特点，其中吲哚菁绿（icg）作为fda唯一批准的近红外荧光染料已广泛应用于临床诊断。但是菁染料存在光稳定性较差的缺陷。

近年来，恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。目前，常用的治疗手段主要包括手术切除、放射治疗、化学药物治疗和生物治疗。手术切除的方法适用于肿瘤早期，效果明显，但对患者损伤较大，易产生手术并发症，而且对于重要的组织或器官，即使被肿瘤侵及也不能切除。放射治疗是一种重要的辅助性治疗手段，术前放疗可缩小肿瘤，有利于切除，术后放疗可抑制残存肿瘤细胞的生长。但放疗只能用于局部治疗而且会对周围正常组织造成不可逆的损伤。化学药物治疗能有效杀死肿瘤细胞，是一种全身性治疗手段。但是化疗药物存在选择性低，体内半衰期短，溶解性差等问题。生物治疗尤其是基因治疗作为一种新兴的治疗手段倍受关注。基因治疗是将外源基因引入病变细胞，通过外源基因的表达，抑制或沉默致病基因的表达，从根本上控制肿瘤细胞的增值或转移，通过纠正或补偿的方式，使病变细胞恢复正常细胞的功能。常用的基因载体主要包括病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体转染效率高，但同时也具有较高的免疫原性和致癌性并且易引发炎症。考虑到安全性，病毒类载体在临床应用中受到很大限制。非病毒类载体，如聚合物胶束、脂质体以及树枝状大分子等，存在转染效率相比病毒类载体低的缺陷。另一方面，目前能够很好的实现诊疗一体化的载体尚不多见。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，在已有工作的基础上，提供一类以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料及其制备方法与应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一类以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料，其结构通式如下：

（i）

其中，x为c(ch3)2、o、s或se，y为f、cl、br或i，z为nh、o或s，r0为h、na或k，r1为氢、卤素、甲基、芳香基、硝基、磺酸基、醛基、羧基或苄基，r2为甲基、羧基、磺酸基或苄基，m和n均为0-18。

作为可选方式，在上述近红外荧光染料中，所述x为c(ch3)2，所述y为br，所述z为o，所述r0为na，所述r1为h，所述m=0，所述r2为甲基，所述n=2。

本发明还提供了一种上述以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料的制备方法，包括以下步骤：

（1）以甲苯为溶剂，130℃下回流，制备化合物ii

（ii）

（2）以二氯甲烷为溶剂，60℃下回流，制备化合物iii

（iii）

(3)以醋酸酐为溶剂，65℃下回流，避光，制备化合物iv

（iv）

（4）室温下，制备化合物v

（v）

（5）以dmso作溶剂，65℃下回流，避光，制备化合物i

作为可选方式，在上述制备方法中，反应在保护气氛下进行。进一步的，保护气体为氮气、氩气或氦气。

作为可选方式，在上述制备方法中，后处理方法为反应结束后，旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷重新溶解，分别用饱和碳酸氢钠洗，饱和磷酸二氢钠或饱和稀盐酸洗，饱和食盐水洗，用无水硫酸镁或无水硫酸钠干燥，用硅胶柱提纯，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，得到目标产物。

本发明还提供了上述以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料的一种应用，其特征在于，将其用于制作体内外生物成像试剂。进一步的，所述体内外生物成像为干细胞成像、组织成像以及活体成像等。

本发明还提供了上述以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料的另一种应用，其特征在于，将其用于制备药物和\或基因的载体。进一步的，所述应用具体为以所述的近红外荧光染料作为疏水端与生物相容性好的亲水分子通过环境敏感键相结合并自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。

本发明还提供了一种脂质材料，其是以上述的近红外荧光染料作为疏水端与生物相容性好的亲水分子通过环境敏感键相结合并自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。所述脂质材料作为药物和\或基因的载体。所述脂质材料可具有荧光开关功能，还可具有治疗和成像双重功能，可实现诊疗一体化。所述脂质材料与传统的脂质体或胶束或囊泡包载染料的方式相比，染料担载量更大，从而使得荧光强度更高，而且在亲水外壳的保护下，进一步降低了光漂白的风险。

作为可选方式，在上述脂质材料中，所述亲水端与疏水端通过含有还原敏感的二硫键或二硒键的分子连接，或含有ph敏感的酰腙键或肟键或希夫碱键等分子连接，或含有酶敏感的酯键分子或短肽连接。

作为可选方式，所述脂质材料可与基因复合并自组装形成脂质体或胶束或囊泡，使荧光发生淬灭，在特定环境中释放出基因后荧光恢复，从而实现荧光开关功能。

作为可选方式，所述脂质材料的结构通式如下：

其中，k为树状分子的重复单元，g1和gn分别表示一代和n代树状分子，n为2或3或4或5，x为具有微环境敏感响应功能的连接分子，x为二硫键或二硒键或酰腙键或肟键或希夫碱键或酶敏感的酯键或短肽，r1为本发明所述的以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料，r2为亲水性基团。

作为可选方式，在上述脂质材料中，所述亲水端为二代以上的胺类树状分子，其重复单元为氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）。

本发明还提供了一种载体系统，其特征在于，包括上述的脂质材料以及复合在其中的药物和\或基因。在特定环境中材料上的微环境敏感键断裂，发生解组装释放出药物和\或基因从而达到治疗目的。作为可选，所述药物和\或基因在自组装过程中被包裹在所述脂质体或胶束或囊泡中。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1、本发明所述一类以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料，通过在其长甲川链中插入环烃基团，使其光稳定性大大提高。

2、本发明所述的近红外荧光染料荧光量子产率高，可用于干细胞成像、组织成像以及活体成像等体内外生物成像。

3、本发明所述的近红外荧光染料可作为疏水端与生物相容性好的亲水分子通过环境敏感键相结合并自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡，与传统的脂质体或胶束或囊泡包载染料的方式相比，染料担载量更大，从而使得荧光强度更高，而且在亲水外壳的保护下，进一步降低了光漂白的风险。

4、本发明所述脂质材料可与基因复合并自组装形成脂质体或胶束或囊泡，使荧光发生淬灭，在特定环境中释放出基因后荧光恢复，从而实现荧光开关功能。近红外荧光染料作为疏水端位于载体系统内部，导致染料局部浓度升高，同时由于菁染料分子间强的范德瓦尔斯力使其产生自聚集，结果使光谱带发生迁移，呈荧光淬灭状态。而当载体系统进入靶点细胞，处于特定环境中时，材料上的微环境敏感键断裂，发生解组装，释放出药物和\或基因，发挥治疗作用，同时聚集在内部的菁染料也被释放出来，使得荧光恢复，从而实现荧光开关功能，进而实现诊疗一体化。

5、本发明所述脂质材料可作为药物和\或基因的载体，在特定环境中，材料上的微环境敏感键断裂，发生解组装释放出药物和\或基因从而达到治疗目的，实现诊疗一体化。

6、本发明所述一类以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料及其脂质材料制备方法简单，原料易得，细胞毒性低，基因转染效率高。

附图说明：

图1为本发明实施例1中所制备的化合物5的紫外吸收光谱图。

图2为本发明实施例4中所制备的化合物9的ms质谱图。

图3为本发明实施例4中所制备的化合物9的¹hnmr400m核磁图。

图4为本发明实施例3中所制备的化合物8的ms质谱图。

图5为本发明实施例3中所制备的化合物8的¹hnmr400m核磁图。

图6为本发明实施例4中所制备的化合物11的ms质谱图。

图7为本发明实施例4中所制备的化合物11的¹hnmr400m核磁图。

图8为本发明实施例4中所制备的化合物12的电泳图。

图9为本发明实施例4中所制备的化合物12的dls图。

图10为本发明实施例4中所制备的化合物12荷载pegfp质粒对hela细胞的转染效果图。

图11为本发明实施例4中所制备的化合物12的体内荧光成像图。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明所述内容作进一步详细说明。下面实例选用本发明的优选实施方式，本领域技术人员很容易将其推广到其他材料。此处所描述的具体实例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的内容。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1

以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料的制备

（1）化合物1合成路线如下：

具体步骤：在100ml封管中，将2,3,3-三甲基吲哚10g（63mmol,1eq）溶于30ml甲苯，再加入7.72g（63mmol,1eq）1-溴丙烷。130℃下反应72h，冷却后，静置一段时间，倒掉上层溶液。下层红色固体用乙醚洗两次，旋干，称重得15g化合物1，产率84.7%，密封后于-20℃冰箱保存。

（2）化合物2合成路线如下：

具体步骤：在250ml圆底烧瓶中，将40mldmf与20ml二氯甲烷混合，冰水浴下，再将20ml二氯甲烷与37ml三氯氧磷的混合液滴加入上述溶液中。然后滴加入10g（0.10mol,1eq）环己酮，加热至60℃回流反应3h。待反应液冷却至室温后，缓慢倒入200ml冰水中，分层后收集水相。加入100ml冷冻的饱和nacl溶液，析出沉淀，抽滤得到14.6黄色固体即为化合物2，产率84.8%。

（3）化合物3合成路线如下：

具体步骤：在100ml圆底烧瓶中，将2.45g(8.72mmol,3eq)化合物1，0.50g(2.91mmol,1eq)化合物2以及0.48g(5.82mmol,2eq)无水乙酸钠分散于20ml醋酸酐中。加热至65℃，n2保护下避光反应5h。减压浓缩醋酸酐后，加乙醚沉淀，抽滤后，得1.75g绿色固体即为化合物3，产率97.2%。

（4）化合物4合成路线如下：

具体步骤：在100ml圆底烧瓶中，将对羟基苯丙酸10g（60.24mmol,1eq）溶于20ml水，将4.8g（0.12mol,2eq）氢氧化钠溶于20ml水后滴加入对羟基苯丙酸溶液中。室温下反应6h后，将反应液分别用乙酸乙酯和二氯甲烷洗一次，收集水相，减压浓缩后得12g黄色固体即为化合物4，产率94.8%。

（5）化合物5合成路线如下：

具体步骤：在100ml圆底烧瓶中，将1g(1.60mmol,1eq)化合物3和0.67g（3.20mmol,2eq）化合物4溶于20ml二甲基压砜（dmso），65℃下，n2保护避光反应6h。待反应液冷却至室温后，加入大量甲基叔丁基醚，搅拌数分钟后，倒掉上层溶液。用甲基叔丁基醚重复洗三次，抽干，得到1.13g绿色固体即为化合物5，产率92.2%。

实施例2

含有还原敏感键的连接分子的制备

化合物6合成路线如下：

具体步骤：在1l的圆底烧瓶中，将胱胺二盐酸盐8g（35mmol,1eq）溶于300ml甲醇，再加入三乙胺7.07g（70mmol,2eq）。然后将二碳酸二叔丁酯6.7g（31mmol,0.88eq）溶于200ml甲醇，搅拌下，冰水浴中，用滴液漏斗将二碳酸二叔丁酯的甲醇溶液缓慢滴加入胱胺二盐酸盐的甲醇溶液中。30℃反应过夜，然后用旋转蒸发仪旋掉甲醇，加100ml二氯甲烷重新溶解。用50ml饱和nacl溶液洗两次，用无水硫酸钠干燥，抽滤后，旋干。称重得到7.2g粗产品，粗产率为92.3%。用硅胶柱提纯，以二氯甲烷/甲醇体系作为洗脱液，分离得到3.6g化合物6纯产品。

实施例3

二代赖氨酸-精氨酸树状分子的制备

（1）化合物7合成路线如下：

具体步骤：将boc-arg(pbf)-oh11.3g(21.45mmol,2.5eq)和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)9.76g(25.74mmol,3eq)分别溶于20mln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，在250ml圆底烧瓶中混合后，加入n,n-二异丙基乙胺(diea)3.33g（25.74mmol,3eq）反应一段时间。将l-赖氨酸甲酯盐酸盐2g（8.58mmol,1eq）溶于20mldmf中，搅拌下滴加入上述反应液中。30℃，n2保护下反应48h。反应结束后用旋转蒸发仪旋掉dmf，加200ml二氯甲烷重新溶解。分别用100ml饱和碳酸氢钠（nahco3），100ml饱和磷酸二氢钠（nah2po4）和100ml饱和氯化钠溶液（nacl）各洗两遍。收集有机相，用无水硫酸镁干燥，抽滤后，旋干。通过重结晶的方法提纯，将粗产品溶于少量dcm后，加入大量石油醚中，析出白色晶体，抽滤后得到纯产品7.12g即为化合物7，产率71.2%。

（2）化合物8合成路线如下：

具体步骤：将5.2g（4.42mmol）化合物7溶于10ml甲醇中，然后取0.6g氢氧化钠溶于5ml水中。搅拌下，将氢氧化钠水溶液滴加入化合物7的甲醇溶液中，使氢氧化钠的终浓度为1m。30℃下反应过夜，用旋转蒸发仪旋掉甲醇后，加入20ml水溶解。搅拌下，用1m的盐酸调ph至2-3，析出大量白色沉淀，加入200ml乙酸乙酯溶解。收集有机相，分别用100ml饱和nahco3，100ml饱和nah2po4和100ml饱和nacl溶液各洗两遍。然后用无水硫酸镁干燥，抽滤后旋干。称重得到5.06g化合物8，产率98.4%。

实施例4

以所述近红外荧光染料为疏水端的环境响应型脂质材料的制备

（1）化合物9合成路线如下：

具体步骤：将100mg（0.14mmol,1eq）化合物5溶于10ml二氯甲烷，将69.36mg(0.22mmol,1.5eq)o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯（tbtu）溶于10mldmf，将上述两种溶液置于100ml圆底烧瓶中，再加入27.92mg(0.22mmol,1.5eq)diea搅拌一段时间。取27.47mg（0.14mmol,1eq）化合物6溶液10ml二氯甲烷后，滴加入上述反应液中。30℃，n2保护下避光反应过夜。减压旋掉有机相，再加50ml二氯甲烷重新溶解，分别用20ml饱和nah2po4和饱和nacl溶液洗一次。无水硫酸镁干燥，抽滤后旋干，得到114mg绿色固体即为化合物9，产率82.4%。用硅胶柱提纯，以二氯甲烷\甲醇体系作为洗脱液。

（2）化合物10合成路线如下：

具体步骤：在50ml圆底烧瓶中，取70mg（0.07mmol）化合物9溶液2ml二氯甲烷，再加入2ml三氟乙酸，室温下避光反应4h。减压旋掉有机相，再加50ml二氯甲烷重新溶解，分别用20ml饱和nahco3和饱和nacl溶液洗一次，无水硫酸钠干燥，抽滤后旋干，得50mg绿色固体即化合物10，产率80.9%。

（3）化合物11合成路线如下：

具体步骤：将48.2mg（0.04mmol,1eq）化合物8溶于10ml二氯甲烷，将25.7mg（0.08mmol,2eq）tbtu溶液5mldmf，将上述两种溶液置于100ml圆底烧瓶中，再加入16.07mg（0.12mmol,3eq）diea反应一段时间。取50mg(0.06mmol,1.5eq)化合物10溶于10ml二氯甲烷，滴加入上述溶液中。30℃，n2保护下避光反应48h。减压旋掉有机相，再加50ml二氯甲烷重新溶解，分别用20ml饱和nahco3，20ml饱和nah2po4和20ml饱和nacl溶液洗一次。用无水硫酸镁干燥，抽滤后旋干，得到66mg绿色固体即为化合物11，产率82.2%。

（4）化合物12合成路线如下：

具体步骤：在50ml圆底烧瓶中，取60mg（0.029mmol）化合物11溶于2ml二氯甲烷，再加入2ml三氟乙酸，室温下避光反应4h。减压旋掉有机相，加20ml乙醚沉淀，3000rpm离心3min收集沉淀，得到35mg绿色固体，即为化合物12，产率89.4%。本实施例中制得的环境响应型脂质材料与传统的脂质体或胶束或囊泡包载染料的方式相比，染料担载量更大，从而使得荧光强度更高，而且在亲水外壳的保护下，进一步降低了光漂白的风险。本发明是所述纸质材料与传统包载方式的染料担载量对比见表1。

实施例5

取1mg化合物5溶于10ml甲醇，稀释10倍后测紫外吸收（uv-1800,shimadzu,japan），得最大紫外吸收波长为766nm。

实施例6

基因载体的制备

方案一

（1）将质粒dna或rna溶于无菌的hbg缓冲溶液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸20毫摩尔，5%葡萄糖）中，配制成0.1mg/ml的基因溶液（记为溶液a）；将实施例4中制备的以所述近红外荧光染料为疏水端的环境响应型脂质材料（优选如化合物12所示的脂质材料）用乙醇注入法加入hbg缓冲溶液中，配制成0.1~10mg/ml的自组装体溶液，溶液b；

（2）将上述步骤中得到的溶液b与基因溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到二元复合物，其中基因通过静电吸附作用结合在自组装体外围。所述自组装体作为压缩基因的阳离子载体，进一步的，在上述二元复合物外围还可通过电荷吸附作用引入遮蔽体系，形成三元复合物。

方案二

将质粒dna溶于无菌的hbg缓冲溶液中，配制成0.1mg/ml的dna溶液（溶液a）；将实施例4中制备的以所述近红外荧光染料为疏水端的环境响应型脂质材料用乙醇注入法或者薄膜超声法加入溶液a中，自组装得到高效装配基因的载体系统。

作为可选，在上述两种方案中，所述脂质材料与基因的质量比例为0.1:1~50:1。

作为可选，还可在上述步骤（2）中加入药物或磁性纳米粒子制得三元或四元化合物。

实施例7

体外基因转染实验

（1）取实施例4中制备的以所述近红外荧光染料为疏水端的环境响应型脂质材料按照实施例6中所述方法制成基因载体系统。

制备得到转pegfp质粒的基因载体系统，并取聚乙烯亚胺压缩的pegfp质粒作为对比。

（2）hela细胞的培养：取人宫颈癌细胞hela细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的胎牛血清的dmem培养基中，在含5%（体积分数）co2，温度为37℃的培养箱中培养24h。

转染前24h内，取对数生长期的hela细胞，胰酶消化后用dmem稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，置于含5%（体积百分数）的co2，温度为37℃的孵箱中继续培养至80-90%融合，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用pbs洗涤两次后，将荷载pegfp质粒的复合物颗粒用无血清或者含有10%（质量/体积百分数）的小牛血清的dmem培养基（ph用1mhcl调至6.8）至终体积2ml，继续培养48h。

（3）体外转染效率的测定：取出培养板，用倒置荧光显微镜照相，结果如图10所示，图中亮点为转染成功的带绿色荧光的细胞。

有益结果：本发明所述含有近红外荧光染料结构的环境响应型脂质材料制成的基因载体系统，具有优异的转染效率，其转染效率超过商品化pei25k，在有血清条件下转染优势更为突出。

实施例8

体内成像实验

建立肿瘤模型：雄性近交系裸小鼠，4～5周龄，体重15g～17g，在无特定病原体spf级动物合格环境下饲养，自由摄取水分和食物，各实验均在无菌超净工作台中进行，无菌条件下，取对数生长期人宫颈癌细胞hela细胞，制备细胞悬液，浓度为2×10⁶个/ml，裸鼠右腋下接种0.1ml/只，建立人宫颈癌细胞hela细胞裸鼠移植瘤模型。

待裸鼠皮下包块长至约100mm³时，通过尾静脉注射的方式将50μg以所述近红外荧光染料为疏水端的环境响应型脂质材料制成的基因载体系统注射入裸鼠体内（对照组注射pei25k/dna和lip2000/dna）。

静脉注射8小时后，于小鼠腹腔注射100μl,5%水合氯醛进行麻醉，利用小动物成像系统中进行图像采集。采用卤素灯进行荧光照片采集，激发光滤光片波长为730nm，发射光滤光片波长为760nm。活体图像采集完毕后，小鼠立即被断颈处死，摘除肿瘤和主要脏器（心、肝、脾、肺、肾），进行各组织的图像采集。

有益结果：本发明所述一类以所述近红外荧光染料为疏水端的环境响应型脂质材料制成的基因载体系统在小鼠体内转染8h后，在肿瘤部位发现了明显的高于对照组的近红外荧光信号，离体组织的结果相似。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的并不用于限制本发明。对于本领域普通技术人员来说，在本发明权利要求所限定的精神和范围内还可对其进行许多改进和变型，甚至等效变更，但都应视为本发明的保护范围。