一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗及制备方法与流程

本发明涉及一种纳米疫苗的制备方法，尤其涉及一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗。

背景技术：

随着社会老龄化和人们生活方式的改变，恶性肿瘤已成为人类的“第一杀手”。大量的临床研究结果证实，旨在直接破坏和清除肿瘤细胞的肿瘤常规治疗手段，如手术切除、化疗及放疗等手段，不可能彻底地清除体内所有肿瘤细胞，往往由于残存微小肿瘤转移灶的存在，引起肿瘤复发而导致治疗失败。和上述肿瘤常规治疗手段不同，肿瘤免疫疗法针对的靶标不是肿瘤细胞和肿瘤组织，其目的旨在激活机体免疫系统，是希望依靠自身免疫机能杀灭肿瘤细胞的抗肿瘤疗法。诱发机体内在的抗肿瘤免疫反应，在肿瘤治疗效应中起着关键作用，尤其对防止残存肿瘤细胞的复发具有非常重要的意义。

随着肿瘤免疫疗法的深入研究，肿瘤疫苗的发展备受关注。现代生物技术开发的新型多肽疫苗，多数不能激发细胞免疫效应，成为绝大多数新型多肽疫苗研发中的瓶颈问题。利用光敏剂的光化学内化作用，可以调控外源性多肽抗原在抗原提呈细胞内的呈递途径，进而激活抗原特异性的细胞免疫反应，提高免疫抗肿瘤疗效。光敏剂是光化学内化作用的核心物质，但现有的光敏剂常存在水溶性差，易聚集等缺点，限制其在临床上的广泛应用。另外，目前研究中多采用将光敏剂和多肽抗原通过简单物理混合的方式给药，由于光敏剂和多肽抗原的理化性能差异，通常会导致无法获得理想的治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗。

本发明的第二个目的是提供一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将抗原蛋白水溶液与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液等体积混合，所述抗原蛋白与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:1～50，在20～30℃下反应18～48小时，使吲哚菁绿通过酰胺键连接在所述抗原蛋白上；

(2)将步骤(1)制备的产物加入到水中，制成质量百分比浓度为0.001％～1％的溶液，在20～30℃下孵育18～48小时；调节温度至4～10℃，以15000～30000rpm转速离心20～40min，收集纳米粒，冷冻干燥后得到吲哚菁绿自组装纳米疫苗。

上述方法制备的吲哚菁绿自组装纳米疫苗。

本发明的优点：

本发明的疫苗，合成工艺简单方便，在应用时，吲哚菁绿不易聚集、稳定性良好；所述吲哚菁绿自组装纳米疫苗联合近红外激光照射，可以实现吲哚菁绿和多肽抗原的共递送，可以激活抗原特异性cd8⁺细胞毒性t细胞反应，增强抗肿瘤免疫应答，解决了传统多肽疫苗不能激活细胞免疫反应的技术问题。

附图说明

图1为本发明吲哚菁绿自组装纳米疫苗的原子力显微镜图。

图2为本发明吲哚菁绿自组装纳米疫苗对荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤细胞模型小鼠的抑瘤效果曲线图。

图3为荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤细胞模型小鼠接种本发明吲哚菁绿自组装纳米疫苗后，小鼠脾脏内cd8⁺inf-γ⁺t细胞的比例分析。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明各实施例所用抗原蛋白为模拟蛋白卵清蛋白(ovalbumin，ova)，是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，凡是具有抗肿瘤的抗原蛋白，都可以用于本发明。

实施例1

一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将模拟蛋白模型抗原ova水溶液与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液等体积混合，所述模拟蛋白ova与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:25，在25℃下反应32小时，使吲哚菁绿通过酰胺键连接在模拟蛋白ova上；

(2)将步骤(1)制备的产物加入到水中，制成质量百分比浓度为0.01％的溶液，在25℃下孵育32小时；调节温度至7℃，以22500rpm转速离心30min，收集纳米粒，冷冻干燥后得到吲哚菁绿自组装纳米疫苗，见图1，图2和图3。

图1为本实施例获得的吲哚菁绿自组装纳米疫苗的原子力显微镜图。由图1可以看出该吲哚菁绿自组装纳米颗粒的粒径在80nm左右，粒径分布均匀。

图2是本实施例获得的吲哚菁绿自组装纳米疫苗对荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤细胞模型小鼠的抑瘤效果曲线图。

本实验中涉及到的eg.7-ova小鼠t淋巴瘤细胞购买于美国细胞培养收藏中心(americantypecellculture，atcc)，在该肿瘤模型小鼠中，ova可以作为肿瘤抗原产生抗肿瘤免疫效应。图中显示了生理盐水组，游离抗原蛋白组，吲哚菁绿自组装纳米疫苗组。实验表明在相同抗原剂量下，吲哚菁绿自组装纳米疫苗组同游离抗原蛋白组相比较具有明显的抑瘤效果。

图3是荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤细胞实体瘤模型小鼠接种本实施例的吲哚菁绿自组装纳米疫苗后，小鼠脾脏内cd8⁺inf-γ⁺t细胞的比例分析，其中显示了生理盐水组，游离抗原蛋白组，吲哚菁绿自组装纳米疫苗组。流式细胞术结果显示，在相同抗原剂量下同游离抗原蛋白组相比较，吲哚菁绿自组装纳米疫苗组显著促进了疫苗接种小鼠淋巴结中cd8⁺t细胞的增殖活化。

实施例2

一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将模拟蛋白ova水溶液与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液等体积混合，所述模拟蛋白ova与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:1，在30℃下反应18小时，使吲哚菁绿通过酰胺键连接在模拟蛋白ova上；

(2)将步骤(1)制备的产物加入到水中，制成质量百分比浓度为0.001％的溶液，在30℃下孵育18小时；调节温度至10℃，以30000rpm转速离心20min，收集纳米粒，冷冻干燥后得到吲哚菁绿自组装纳米疫苗，

粒径在50nm左右，粒径分布均匀。

实验证明，本实施例吲哚菁绿自组装纳米疫苗对荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤细胞模型小鼠的抑瘤效果与实施例1相似。

实施例3

一种吲哚菁绿自组装纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将模拟蛋白ova水溶液与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液等体积混合，

所述模拟蛋白ova与吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:50，在20℃下反应48小时，使吲哚菁绿通过酰胺键连接在模拟蛋白ova上；

(2)将步骤(1)制备的产物加入到水中，制成质量百分比浓度为1％的溶液，在20℃下孵育48小时；调节温度至4℃，以15000rpm转速离心40min，收集纳米粒，冷冻干燥后得到吲哚菁绿自组装纳米疫苗。

粒径在120nm左右，粒径分布均匀。

实验证明，本实施例吲哚菁绿自组装纳米疫苗对荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤细胞模型小鼠的抑瘤效果与实施例1相似。