本发明属医药
技术领域：
：，涉及白细胞介素(il-22)抗体新的药用用途，具体涉及白细胞介素(il-22)抗体用于制备治疗子宫腺肌症的药物中的用途。经体外实验和体内动物试验发现，所述il-22中和性抗体可有效抑制子宫腺肌症病灶血管生成和内膜增殖，进一步可用于制备治疗子宫腺肌症的药物。
背景技术：
：：据统计报道，子宫腺肌病(adenomyosis，ad)是一种常见的妇科疾病，在育龄期妇女中的发病率约为8-27％，该疾患多发生于30-50岁妇女，其中，约15％同时合并子宫内膜异位症，约半数合并子宫肌瘤。近年来，ad的发病率有上升和年轻化的趋势。ad的定义是子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层形成弥漫或局限性的病变；实践显示，ad虽为良性病变，但却有增生、种植浸润及复发等恶性行为，致使其成为难治之症。临床实践显示，患者多呈现渐进性加重痛经和慢性盆腔痛，继发性不孕或原发性不孕以致严重影响罹患该病的广大女性的身心健康和生活质量，乃至整个家庭和社会的和谐。国内外的研究认为其病因可能与子宫缺乏黏膜下层有关，子宫黏膜下层缺乏可能引起子宫内膜基底层细胞增殖、侵袭至子宫肌层，并伴有周围肌层细胞代偿性增大从而形成了病灶，然而，迄今，对于ad的发病机制仍有太多的未解之谜。药物和手术治疗仍是目前主要的治疗措施，但是单纯病灶切除后疼痛缓解率低，复发率高。血管生成，从现有的血管网络新生毛细血管的形成是营养物质和氧气从现有的血管向远处输送的关键。血管生成属生理过程(例如，胚胎发育和伤口愈合)以及病理过程(例如，心肌缺血、糖尿病视网膜病变、肿瘤的生长和转移)的重要组成部分；新生血管已被认为是ad的主要病理特征，有研究发现ad患者子宫内膜和肌层的血管生成活性显著升高；此外，宫腔镜检查发现近50％的ad患者内膜有异常血管生成。因此，研究者认为，血管生成在子宫内膜组织异位植入和随后增殖生长过程中发挥着重要的作用。另研究显示，在众多的促血管因子中，vegf(血管内皮生长因子)是最有力的血管生长因子，它通过和血管内皮细胞的特异性受体结合，具有强大的促内皮增殖和促血管生长作用，其主要生物学功能有：通过活化磷脂酶c和刺激第二信使的形成直接促进血管内皮c的有丝分裂，在核酸和蛋白水平诱导纤溶酶原的降解，参与细胞外蛋白水解和基膜的降解，有利于血管内皮细胞的迁移和增生；增强血管通透性，促进包括纤维蛋白原在内的血浆蛋白的渗出，形成纤维素网络，为血管芽延伸生长提供良好基质；大量研究已经证实ad异位内膜及在位内膜组织中vegf表达均明显高于正常内膜。积累的证据表明，ad患者异位内膜可产生的多种细胞因子，在ad的发病过程中发挥着重要作用，如白细胞介素(il)-6，il-8，ccl2(也被称为单核细胞趋化蛋白-1)和il-22。il-22是il-10细胞因子家族的成员，它参与抗微生物防御、保护和修复组织损伤及急性期反应，其受体由il-22r1和il-10r2两个亚基组成，广泛表达于各种器官和细胞类型。本发明人既往研究已经发现ad患者病灶间质细胞高表达il-22及其受体，可以自分泌的方式促进子宫内膜间质细胞(endometrialstromalcells,escs)的活力和生长。还有研究显示，il-22刺激esc产生促血管因子il-6、vegf和il-8，这些促血管因子在血管生成中发挥重要作用，并有助于子宫腺肌病发病和进展。鉴于现有技术的现状，本申情的发明人拟通过拮抗il-22可能具有抑制ad内膜esc的促血管生成能力，进而抑制ad的发病和进展的研究实验，进一步评估拮抗il-22(如il-22中和性抗体)在治疗ad中的潜在价值，进而提供白细胞介素(il-22)抗体在制备子宫腺肌症(ad)药物中新的用途。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供白细胞介素(il-22)抗体在制备子宫腺肌症(ad)药物中新的用途。本发明通过拮抗il-22可能具有抑制ad内膜esc的促血管生成能力，进而抑制ad的发病和进展的研究实验，进一步评估拮抗il-22(如il-22中和性抗体)在治疗ad中的潜在价值，并制备治疗ad的药物。本发明经体外实验和体内动物试验结果显示，il-22中和性抗体能有效抑制子宫腺肌症病灶血管生成和内膜增殖，表明il-22中和性抗体对子宫腺肌症具有显著的治疗作用，可进一步用于制备治疗子宫腺肌症的药物。本发明的目的通过下述技术方案实现：首选通过体外实验建立ad内膜esc与huvecs(人脐静脉内皮细胞系)的体外共培养体系，在培养体系中加入或不加入抗人il-22中和性抗体(5ug/ml，r&d公司)后，结果显示，il-22中和性抗体明显抑制esc对huvecs细胞活力和活化(cd105)的促进效应(如图2所示，。此外，il-22中和性抗体显著抑制esc培养上清对huvecs的血管形成的促进作用(如图3和图4所示)；进一步，本发明构建ad小鼠模型(如图5所示)，腹腔注射抗鼠il-22中和性抗体(5ug/ml，r&d公司)，结果显示，相对于对照组，il-22抗体注射组小鼠子宫重量明显降低(table)、ad病灶血管密度明显下降、且病灶内膜ki-67(增殖相关抗原)阳性水平明显降低(如图6所示)。本发明提供了il-22抗体用于制备治疗子宫腺肌症药物的中用途，经体外实验和动物实验证实，il-22中和性抗体显著抑制ad内膜血管形成和内膜增殖，可进一步用于制备治疗子宫腺肌症的药物。本发明的优点在于，公开了一种通过拮抗细胞因子il-22的生物学作用，进而发挥抗ad内膜血管生成和esc增殖生长能力，为临床实践提供了ad的新的干预方案和新的治疗药物法。附图说明图1是il-22受体在ad异位病灶中表达，其中，箭头所指是血管内皮细胞；originalmagnification:×400.。图2是il-22抗体明显抑制esc对huvecs细胞活力和活化的促进效应，其中，α-il-22：抗人il-22中和性抗体，esc：与子宫内膜间质细胞间接共培养组，esc+α-il-22：与子宫内膜间质细胞间接共培养+抗人il-22中和性抗体，*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001。图3是il-22抗体显著抑制esc培养上清对huvecs的促血管生成能力，其中，tubeformation:成管指数(5个随机视野下平均成管数量)，以对照组为1，各组成管指数＝1*实验组平均成管数量/对照组平均成管数量，sesc：子宫内膜间质细胞培养上期处理组，esc+α-il-22：子宫内膜间质细胞培养上清+抗人il-22中和性抗体处理组，rhvegf：重组人vegf细胞因子处理组(阳性对照)。图4是il-22抗体显著抑制huvecs对esc细胞活力的促进作用，其中，ctrl-h：与huvecs间接共培养组，co-h：与经esc共培养后的huvecs间接共培养组，co+α-il-22-h：与经esc共培养并经抗人il-22中和性抗体刺激后的huvecs间接共培养组，esc+α-il-22：子宫内膜间质细胞培养上清+抗人il-22中和性抗体处理组，###p<0.001；$p<0.05and$$$p<0.001。图5是免疫组织鉴定ad小鼠模型，其中，a：对照组小鼠，b：ad模型组，g：腺上皮细胞，s：内膜基质细胞，m：肌纤维细胞，箭头所指：异位病灶。图6是免疫组化染色证实il-22抗体明显降低ad病灶血管密度和内膜增殖，a：对照ad小鼠组，b：ad小鼠+腹腔注射抗小鼠il-22中和性抗体(5ug/ml)组，箭头：病灶红色实心三角：病灶血管棕色染色：ki-67(核增殖抗原)，血管密度指数(theindexofvasculardensity)(5个随机视野下平均血管数量)，以对照组为1，各组血管密度指数＝1*实验组平均血管数量/对照组平均血管数量；leicaqwin图像软件系统分析ki-67+区域面积，以对照组为100，各组病灶ki-67+区域面积＝100*实验组病灶平均ki-67+区域面积/对照组病灶平均ki-67+区域面积。具体实施方式实施例1体外实验1)il-22受体在ad异位病灶中表达首先通过免疫组化(免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司)染色发现ad病灶内膜高表达和血管内皮中等程度表达il-22受体，il-22r1和il-10r2(il-22受体均购自r&d公司)(如图1所示)；2)il-22抗体明显抑制esc对huvecs细胞活力和活化的促进效应收集ad患者的内膜组织，通过iv胶原酶(sigma)消化并原代分离培养esc。建立esc和huvecs的间接共培养(transwell小室，corning),在共培养体系中加入或者不加入il-22中和性抗体(r&d公司)，并培养48小时。cck8(东仁化学公司)实验显示esc明显促进huvecs细胞活力(如图2a所示)和活化(cd105表达升高，如图2b-2c所示)，但是il-22中和性抗体可明显抑制这些效应；3)il-22抗体显著抑制esc培养上清对huvecs的促血管生成能力收集esc培养72小时上清，利用matrigel成管实验检测esc培养上清及其il-22中和性抗体对huvecs成管的调节作用，如图3所示，rhvegf(阳性对照)明显促进血管形成，相对于对照组，esc培养上清显著促进huvecs的血管形成，但是培养体系中加入il-22中和性抗体将明显抑制这一作用，提示利用il-22抗体阻断il-22信号可明显抑制esc培养上清对huvecs的促血管生成效应，4)il-22抗体显著抑制huvecs对esc细胞活力的促进作用收集与esc共培养或者同时加入il-22中和性抗体刺激48小时后的huvecs，将其与新鲜esc再进行间接共培养48小时，以未共培养处理的huvecs为对照，随后流式检测esc中增殖相关抗原ki-67和pcna的表达，如图4所示，与未经共培养的huvecs相比，经esc共培养后的huvecs进一步上调esc中ki-67和pcna的表达，然后il-22抗体预刺激可抑制这一效应，提示il-22通过抑制esc和huvecs间交互对话，进而抑制huvecs对esc增殖的促进作用；本发明的体外实验结果显示il-22抗体明显抑制内膜esc对血管内皮细胞活力、活化和血管生成的促进效应，并抑制esc增殖。实施例2构建ad小鼠模型健康新生雌性icr小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，在出生后2-5日，口服给药tamoxifen(他莫昔芬2.7umol/kg，溶于花生油/卵磷脂/浓缩牛奶混合液，体积比：2:0.2:3；复旦复华有限公司，上海)，给药体积是5ul/g；对照组予以溶媒(花生油/卵磷脂/浓缩牛奶混合液)处理；90天后苏木素染色检测，结果显示，ad小鼠肌层见内膜组织浸润(如图5b所示，箭头所示异位病灶)，表明ad小鼠模型建立成功，对照组未见该现象(如图5a所示)。实施例3动物实验1)il-22中和性抗体处理组ad小鼠子宫重量降低建模成功后ad小鼠(90天)，继续予以tamoxifen处理，实验组腹腔注射给于抗鼠il-22中和性抗体(5ug/ml,总体积15ul/g)，每7天加强一次，共4次后，对照组给于生理盐水处理，约d120，常规处理小鼠，并称重小鼠子宫的重量，结果显示，il-22抗体处理组ad小鼠子宫重量明显降低，表明il-22抗体显著缩小ad小鼠子宫大小如表1所示；表1：各组小鼠体重组别鼠龄(天)子宫重量(mg)对照ad组120±5221.98±7.03ad+α-il-22组120±5233.73±7.08*mean±sd；n＝6；*p<0.052)il-22中和性抗体处理组ad小鼠子宫血管密度和内膜增殖水平降低同上法处理ad小鼠，d120检测两组小鼠的血管密度和内膜增殖水平，如图6所示，免疫组化染色显示il-22抗体可明显降低ad病灶的血管密度(如图6a-c所示)；此外，采用leicaqwin图像软件系统分析各组ki-67阳性区域显示，il-22抗体显著下调病灶内膜ki-67水平(如图6a，6b，6d所示)，表明il-22显著抑制ad小鼠病灶血管生成和病灶生长；动物实验结果证实，所述的il-22中和性抗体显著抑制ad病灶血管密度和内膜增殖。本发明的体外和体内试验结果证实，所述的il-22中和性抗体能明显抑制ad病灶血管形成和内膜增殖生长，表明，所述的il-22中和性抗体具有的抗ad治疗机制。当前第1页12当前第1页12