本申请是申请号为201280034022.9、申请日为2012年5月3日、发明名称为“由人巨细胞病毒感染的细胞制造致密体(db)”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及致密体(db)的制造和含有db的药学组合物。
背景技术：
还被称为人类疱疹病毒5的人巨细胞病毒(hcmv)为一种覆膜的双股dna病毒，其属于疱疹病毒。hcmv对于健康的成人是通常无害的。然而在妊娠中该病毒是特别危险的，并且可以对未出生的胎儿甚至是危及生命的。对于具有虚弱的免疫系统的人，也可能由被hcmv感染发展成严重的疾病。因此，特别有危险的是艾滋病患者、移植受者、干细胞移植后的白血病患者、以细胞抑制剂治疗的患者等等。
对于具有虚弱的免疫系统的患者，在hcmv感染时使用病毒抑制剂，例如更昔洛韦、膦甲酸、西多福韦、并且也可能是阿昔洛韦。
此外，从多年前起已经致力于抗hcmv的痘苗或疫苗的发展。因此例如尝试了，以削弱的或减毒的活痘苗引发所期望的免疫力。然而由此仅仅可以获得有限的保护。
另外的方式在于，借助于所谓的致密体(db)实现接种疫苗。在这种情况下涉及由hcmv派生出的、在电子显微镜中可见的结构。db为在其被膜中膜围绕的亚病毒颗粒，被膜由细胞脂质膜派生而出、嵌入病毒糖蛋白。这些病毒蛋白很有可能以天然的构象存在于病毒脂质膜中。类似于病毒颗粒，db在被感染的细胞的细胞质中形成并且最终由细胞排出。db的90％db蛋白质量由病毒编码为所谓的pp65(ul83)蛋白组成。此外在db中，还可以探测到病毒蛋白pp150(ul32)、gh(ul75)、gm(ul100)以及gb(ul55)。因为db不含有病毒dna和病毒壳体，所以其是非感染性的。
在现有技术中描述了，db由于其高度近似于hcmv抗原特性的抗原特性，适合作为抗hcmv感染或在hcmv感染时作用的痘苗。这种痘苗被证明是特别有效的。因为db是非感染性的，所以风险方面和副作用与活痘苗的情况相比明显较少受批评的。因此，含有db的、名称为“vmp2001”的痘苗已经存在于临床试验中。以db接种疫苗的原则和优点例如在wo00/5372中进行了描述。
由于db在hcmv的正常侵染循环中：i)仅以微小的量形成并且因此仅以有限的量提供；并且ii)db制剂可能在一定情况下被感染性的hcmv污染，存在对以下方法的需求，即，通过该方法db的形成可以有针对性地提高并且防止通过感染性的hcmv而污染。
reefschlaeger等(2001,journalofantimicrobialchemotherapy(抗菌化学疗法杂志)48,757-767)和buerger等(2001,journalofvirology(病毒学杂志)75,9077-9086)描述了一种名称为bay38-4766的物质，其应当提升所形成的db的量。
hwang等(2007,journalofvirology81,11604-11611)和hwang等(2009,antimicrobialagentsandchemotherapy(抗微生物制剂与化学疗法)53,5095-5101)描述了苯并咪唑基-d核糖核苷，其同样能够适用于所形成的db的量的提升。
然而，迄今所描述的用于db形成优化的所谓适用的物质都没有在实践中得以证明。
技术实现要素：
在这个背景下，本发明的任务在于：提供另外的物质，该物质作为在生产db时的添加物i)防止db制剂被感染性的hcmv污染；ii)在db生产的范畴下提升db的产率。
这个任务通过如下物质的用途解决，该物质选自以下物质：
本发明的另外的任务在于，提供一种用于制造db的新颖的方法。
这个另外的任务通过具有以下步骤的方法解决(1)提供在适当的介质中的被人巨细胞病毒(hcmv)感染的生物细胞，以及(2)以选自以上所列出的物质(a)到(d)的物质培养受感染的生物细胞。
发明人认识到，以上的鉴定证明的物质极其良好地适应于制造db。可以特别地注意到的是：被hcmv感染的生物细胞，例如原代成纤维细胞，在存在这些化合物的情况下在细胞质中富集高浓度的db并且释放到介质中。在此，作为特别的优点表明的是，物质(a)到(d)防止完好的病毒颗粒在细胞核中组合，并且因此导致，没有感染性的hcmv由已感染的细胞中排出。因此可以容易地由介质或已感染的细胞的裂解液分离db，而无需担心被感染性的病毒颗粒污染。
根据本发明，这些允许hcmv的生物细胞是适用于使用在该方法中的。
根据本发明对于“适当的介质”理解为常见的细胞培养基。在此优选涉及根据各个使用的细胞种类所用的介质。适当的介质例如为：伊格尔(氏)最低限度必需介质(emem)+10％胎牛血清(fcs)+2mml-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素(pen/strep；青霉素g钠10000μg/ml；0.85％硫酸链霉素)；emem+10％fcs+2mml-谷氨酰胺+1mm丙酮酸钠(nap)+1％非必需氨基酸+1％pen/strep或者带有100μg/ml庆大霉素的rpmi1640；5u/ml肝素；50μg/ml血管内皮细胞生长因子；15％人血清(对于hcmv呈血清阴性)和12μg/ml西普乐(cibrobay)，等等。
在此，根据本发明当生物细胞为原代细胞时是优选的，其优选地选自由以下所构成的组：人内皮细胞、人成纤维细胞、人树突状细胞、人上皮细胞和人巨噬细胞。
这种措施具有以下优点，即，使用这些允许hcmv并且因此特别适用于制造db的细胞。
此外，当利用物质在浓度约1nmol/l到约100μmol/l的介质中进行培养生物细胞时，是优选的。
这种措施具有以下优点，即，选择这些根据发明人的认识导致特别良好的结果的浓度范围。确切的浓度依赖于所使用的生物细胞以及感染用的hcmv株(stamm)。浓度可以由本领域技术人员通过简单的滴定列没有困难地在单个情况下测定。因此，发明人可以通过物质(a)和以hcmv株ad169感染的人包皮成纤维细胞(hff)在浓度为50nmol/l的情况下获得最优的结果。在同样的方式下对于物质(b)、(c)和(d)，5nmol/l、500nmol/l以及500nmol/l的浓度导致最优的结果。在通过出自人脐静脉内皮细胞(huvec)(以hcmv株tb40/e感染)培养的情况下，对于物质(a)、(b)、(c)和(d)，300nmol/l、300nmol/l、3μmol/l以及30μmol/l的浓度导致最优的结果。在使用被hcmv的临床分离物感染的hff的情况下(在共培养中带有未感染的hff)，300nmol/l、300nmol/l、3μmol/l以及30μmol/l的浓度同样导致良好的结果。
此外，当培养进行1天到14天的持续时间时是优选的，优选为3至10天，最优选的为5天。
这种措施具有以下优点，即，在培养时在所给出的时间范围内得到足够高的db量。
此外根据本发明，当在以所述物质培养生物细胞之后进行db的分离时，是优选的。
这种措施具有以下优点，即，db可以以能够直接再处理的形式(例如疫苗配方)提供。db的分离根据本领域技术人员公知的方法进行。例如离心无细胞的介质并在此沉淀db。然后db可以容易地由上清液分出。
在这种背景下，本发明还涉及一种用来制造优选为疫苗的药学组合物的方法，其具有以下步骤：(1)制造致密体(db)；(2)提供(bereitstellen)在步骤(1)中制造的db；以及(3)把在步骤(2)中提供的db配制到药学上可接受的载体中，其中，在步骤(1)中的制造以根据之前所描述的、根据本发明的方法实现。
药学上可接受的载体在现有技术中一般公知，这些载体例如包括：结合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂以及粉末、盐和其他适用于药品配方的物质；可参见rowee.等的handbookofpharmaceuticalexcipients,5thedition,pharmaceuticalpress(药用辅料手册，第5版，医药出版社)，2006；或者bauer等的lehrbuchderpharmazeutischentechnology,6.auflage,wissenschaftlicheverlagsgesellschaftstuttgartmbh(制药技术教科书，第6版，斯图加特科学出版有限责任公司),1999。以上公开出版物的内容引用成为本申请的组成部分。
此外在制造疫苗时，可以设置引起免疫反应增强的佐剂。佐剂可以为油-水混合物、脂多糖、氢氧化铝等等。在现有技术中全面的描述了佐剂。
在这种背景下，本发明还涉及一种优选为疫苗的药学组合物，其根据以上所描述的方法制造。
关于根据本发明的用来制造db的用途和根据本发明的用来制造db的方法所描述的特征、性质和优点，同样适用于根据本发明的制造药学组合物的方法以及适用于根据本发明的药学组合物。
附图说明
接着描述本发明的优选实施例，优选实施例是纯为解释性的并且不对本发明的范围产生限制。在此，参照附图：
图1示出了以物质(a)、(b)、(c)和(d)培养的、并且在之前以hcmv感染的细胞的电子显微镜拍照，该细胞与未经处理的细胞(e)相比较在其细胞质中富集较大量的db(箭头)。
具体实施方式
1.根据本发明的物质(a)到(d)
在wo2004/096778的72页和73页上的实施例14和15中详尽描述了物质a的合成，物质a为(4s)-{8-氟-2-[4-(3-甲氧基苯基)-1-哌嗪基]-3-[2-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-4-喹唑啉基}乙酸。
在wo2006/089664的39页和40页上的实施例2中详尽描述了物质b的合成，物质b为n-{1-甲基-2-[(4-(5-甲基-吡啶-2-基)-哌嗪-1-基)羰基]-1h-咪唑-4-基}-n'-[4-(三氟甲氧基)苯基]脲。
在wo2007/090579的96页和97页上的实施例47中详尽描述了物质c的合成，物质c为1-[6-氟-8-甲氧基-3-({[2-甲基-4-(三氟甲氧基)苄基]氨基}羰基)-4-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氢喹啉-7-基]哌啶-4-羧酸。
在wo2007/101573的49页上的实施例1中详尽描述了物质d的合成，物质d为n-{3-[({4-[5-(6-氨基吡啶-2-基)-1,2,4-恶二唑-3-基]苯基}磺酰基)氨基]-5-氟苯基}-1-氰基环丙烷甲酰胺。
上述文献wo2004/096778、wo2006/089664、wo2007/090579和wo2007/101573的内容，特别是涉及到的鉴定证明性的合成描述，引用成为本公开的组成部分。
2.制造致密体(db)
2.1在以hcmv株ad169感染的成纤维细胞中的制造
人包皮成纤维细胞(“humanforeskinfibroblasts；hff”)在感染前一天以1×106细胞每瓶的量加入到5个t75细胞培养瓶中。提供hcmv株ad169作为冷冻的、不含细胞的病毒制剂，其从在晚期感染阶段的细胞提取。根据本发明的物质(a)、(b)、(c)和(d)作为各50mmol/l的在dmso中的原液提供。
原液以1:1000稀释到50μmol/l的最终浓度。溶液如下地进一步稀释：a:1:1000(50nmol/l)在12mlmem中为12μml；
b:1:10000(5nmol/l)在12mlmem中为1.2μml；
c:1:100(500nmol/l)在12mlmem中为120μml；
d:1:100(500nmol/l)在12mlmem中为120μml。
hff细胞通过病毒制剂在m.o.i.(multiplicityofinfection；感染复数)为：≥≥1个tcid50(50％组织培养感染剂量)/细胞的(1:20稀释)的条件下感染一个小时。接着病毒抛弃病毒上清液并且以在以下浓度下的根据本发明的物质培养受感染的细胞：
a:50nmol/l；
b:5nmol/l；
c:500nmol/l；
d:500nmol/l。
细胞被培养5天，其中，在第一天和第四天之后更新含有该物质的介质。在培养后，用电子显微方法对受感染的细胞进行db形成的检测。
结果在附图1中示出。在此表明的是，所有以根据本发明的物质(a)、(b)、(c)和(d)处理的细胞都富集了高浓度的db(箭头)，而未处理的细胞(e)在其细胞质中几乎没有富集db。db以箭头标识。此外，在处理过的细胞的细胞质中没有发现任何感染性病毒颗粒，而在未处理的细胞的细胞质中检测到了相当大数量的相应颗粒。
2.2在以hcmv株tb40/e感染的内皮细胞中的制造
在另外的试验中出自人脐静脉内皮细胞(huvec)以由在晚期感染阶段的细胞分离出hcmv株tb40/e感染。试验设计与在2.1下所示出的相应，其中，以在以下浓度下的根据本发明的物质对细胞进行培养：
a:300nmol/l；
b:300nmol/l；
c:3μmol/l；
d:30000μmol/l。
在电子显微方法检测中，在受感染细胞的细胞质中同样表现出了强烈的db富集，该受感染的细胞以根据本发明的物质(a)、(b)、(c)和(d)培养。在对照组(e)中仅可以确定少量的db。与在2.1中所描述的发现相似地，在经处理的细胞的细胞质中同样没有检测到病毒。
2.3在以临床hcmv分离物感染的人成纤维细胞中的制造，其中，感染的人成纤维细胞与没有感染的人成纤维细胞共培养
如以上在2.1所描述的那样，hff以临床hcmv分离物(其由晚期感染阶段的细胞分离)感染。感染的hff与未感染的hff在迷你托盘(minitrays)中(2000细胞/凹槽)共培养。制造三种不同的感染细胞/未感染细胞的比例：未稀释；1:2稀释；1:4稀释。根据本发明的物质以以下浓度与细胞一起培养：
a:300nmol/l；
b:300nmol/l；
c:3μmol/l；
d:30μmol/l。
在37℃下培养5天之后，进行电子显微检测。在此表明的是，在存在最高份额的感染细胞的组中，确切地说“未稀释”的组中，在以根据本发明的物质培养后的细胞在其细胞质中积累非常大量的db。以未感染的细胞稀释得越严重，那么在细胞质中积累的db就越少。在没有根据本发明的物质的对照组中，仅能够确定非常少的db。此外，通过加入根据本发明的物质，还避免了感染性颗粒由细胞核中排出。
3.分离致密体
在现有技术中，例如pepperl等在(2000)journalofvirology(病毒学杂志)74,6132-6146中和irmiere,a.与w.gibson在(1993)virology(病毒学)130,118-133中，详尽地描述了分离。以上所述的公开出版物的内容引用成为本申请的组成部分。
相应地，颗粒按照以下描述从受感染细胞的培养基纯化：受感染的细胞在感染后6天由细胞培养容器底部刮去并且再次悬浮到介质中。悬浮液以低速离心，例如在1500g时在4°进行10分钟。所获得的无细胞的介质加入到酒石酸钾-甘油梯度(在0.05ml三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(trishcl)、ph7.4、0.1mnacl(tn缓冲液中；talbot与almeda，1997))上，并且在40000rpm的情况下，在使用beckman转子sw41和sorvall超速离心机otd-50下，在低加速度和在“raking(粗筛)”模式下在4°进行15分钟离心。含有db的带在梯度中通过特有的散射光的特性而确定。该带通过在使用32号规格针头通过离心管壁的抽取而取出。在必要时，db可以通过再次的相应的沉淀或者更长的、直至平衡的离心过程(确切的说为18小时)，在使用相同的梯度/和离心条件的情况下进一步纯化。
4.结论
发明者可以证明，通过物质(a)、(b)、(c)和(d)可以极其有效地制造高的db量，其例如在进行分离和纯化之后可以作为疫苗使用。特别有利的是，借助于以上所列出的物质可以以高纯度分离db。