本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种光疗和化疗协同作用的双受体靶向给药系统及其制备和应用。
背景技术：
现如今，恶性肿瘤已经严重威胁人类的生命健康，有效治疗并提高肿瘤患者的生存质量是目前全球肿瘤研究领域的热点问题。目前对癌症的传统治疗主要是以手术与化疗的综合治疗为主，其中化疗是不可缺少的治疗手段。因其药力强大、可快速杀伤或杀死肿瘤细胞，在临床治疗中发挥着重要作用。但化疗药物普遍存在细胞选择性差、毒副作用大、不良反应严重和多药耐药等问题，致使化疗效果不理想。光动力学疗法(photodynamictherapy,pdt)是近20年发展起来的一种新型恶性肿瘤治疗方法。利用外加光敏剂或光敏剂前体，增加肿瘤内光敏剂的聚集，随后给予特定波长的激发光激活光敏剂，从而引发细胞氧化应激反应导致肿瘤细胞的死亡。与传统的手术、放疗、化疗相比，具有相对的选择特异性，毒副作用小，非侵入性，无累加毒性等特点，在肿瘤治疗中具有良好的应用前景。
但常用的光敏剂多为疏水性分子，易团聚，且对肿瘤部位缺乏靶向性，在体内难以递送至肿瘤部位，并富集达到有效浓度，从而影响治疗效果。透明质酸-聚乳酸-rgd制备双受体介导的两亲性自组装纳米胶束，用于包载疏水性的化疗药物和光敏剂，降低其对正常组织的副作用，提高在同时通过自身降解控制药物的释放。
透明质酸(hyaluronicacid，ha)是一种天然的多糖大分子，可以通过交联、酯化和复合等方法进行修饰之后，再将其与药物进行结合，在透明质酸被降解或被细胞摄入时释放出主要药物，从而达到缓释和控释的作用。cd44是一种跨膜受体糖蛋白，透明质酸与其特异性的相互作用已作为透明质酸靶向治疗恶性肿瘤的研究基础，cd44在多种恶性瘤细胞表面都有过度表达，所以利用透明质酸作为载体，将小分子药物搭载其上，可以在增强药物选择性，降低药物对正常细胞的杀伤作用，提高药物的溶解性和稳定性。因此利用ha作为药物的靶向基团连接到药物或其载体表面，可以通过受体介导作用将药物导入细胞中杀伤或抑制肿瘤细胞，达到主动靶向治疗的目的。聚乳酸(polylacticacid，pla)有良好的生物相容性，可以生物降解、能被机体吸收，获得fda授权用于生物医学领域。聚乳酸对人体无毒且具有高度安全性并自发被组织吸收，以二氧化碳和水的形式随代谢排出体外，在生物医药领域应用广泛。rgd(环)肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)能与肿瘤内皮细胞上的整合素受体αvβ3特异性结合，但与血小板整合素以及普遍存在的细胞受体无交叉反应。利用外源rgd肽竞争结合整合素受体，不仅可以抑制肿瘤迁移和肿瘤新血管生成，同时还可以靶向输送抗肿瘤药物，实现给药系统的肿瘤新生血管靶向性，达到更有效、精确和安全治疗的目的。
苯丁酸氮芥(chlorambucil,，clb)属于芳香氮芥衍生物，具有双功能烷化剂作用，通过形成具有反应活性高的亚乙基亚胺中间体，进一步与dna双链发生交联而发挥其细胞毒性作用，从而干扰dna和rna的功能而杀死癌细胞。临床上主要对慢性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤、何杰金病和卵巢癌有较好疗效。但除了对肿瘤细胞有杀灭作用外,还可引起淋巴细胞下降、全血下降、肝功能损伤和黄疸等副作用。因此可以将苯丁酸氮芥与靶向载体结合制得苯丁酸氮芥前药，提高化学药治疗肿瘤的疗效，降低化疗药物的毒副作用。
光敏剂二氢卟吩e6(chlorine6，ce6)是叶绿素稳定降解产物中与生物活性联系最广的成分之一，它的吸收光谱为600～800nm，最大吸收波长为660nm，使得波长较长的激发光能够达到部位较深的肿瘤组织来激活光敏剂，产生治疗作用，另外单线态氧产率较高，在体内清除速度快，皮肤存留时间短等特点，二氢卟吩e6已成为光动力治癌新药研究中倍受瞩目的研究对象。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种光疗和化疗协同作用的双受体靶向给药系统及其制备方法和应用，该给药系统具有对正常组织细胞毒副作用小、对过表达cd44和整合素受体αvβ3肿瘤部位靶向性强、光疗-化疗协同治疗提高作用疗效等特点。
本发明解决上述问题采用的技术方案：多功能协同的双受体介导靶向给药系统，其为透明质酸—聚乳酸—多肽—苯丁酸氮芥/二氢卟吩e6复合物(ha-pla-rgd-clb/ce6)，其中聚乳酸的分子量为8000da，各组分含量按重量份数计为：透明质酸(ha)100-2000重量份，聚乳酸(pla)1500-10000重量份，n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)21-450重量份，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)12-240重量份，多肽(rgd)1-30重量份，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)20-400重量份，苯丁酸氮芥(clb)100-1000重量份，二氢卟吩e6(ce6)50-600重量份。
本发明所述的多功能协同的双受体介导靶向给药系统的制备方法，包括有以下步骤：
1)ha-pla的制备
将100-2000重量份透明质酸改性得到透明质酸四丁基铵盐ha-tba，使所得ha-tba能够溶于有机溶剂；将1500-10000重量份聚乳酸用过量的n,n'-二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活化，得到聚乳酸活性酯pla-nhs；
取得到的ha-tba白色固体，向其中加入无水有机试剂a，在氮气保护下使其充分溶解，缓慢升温至40℃，待温度稳定后，加入微量二乙胺作催化剂。将得到的pla-nhs溶于少量无水有机试剂a，再逐滴滴入ha-tba溶液中，氮气保护下反应得到ha-tba-pla，然后用阳离子交换树脂交换ha-tba-pla中的tba+，将溶液在有机试剂b中沉淀，用有机试剂b洗涤多次，洗去未反应的pla-nhs，透析，冷冻干燥得ha-pla白色固体；
2)ha-pla-rgd的制备
取上一步制备得到的ha-pla白色固体，向其中加入去离子水，搅拌溶解，然后加入4-80重量份n-羟基琥珀酰亚胺和20-400重量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，调节溶液的ph5～6，缓慢搅拌后加入rgd1-30重量份，室温反应24～48h，将反应后的溶液用去离子水透析2～3天，冷冻干燥得ha-pla-rgd；
3)ha-pla-rgd-clb的制备
称取100-1000重量份苯丁酸氮芥，向其中加入有机试剂a，再加入21-450重量份n,n'-二环己基碳二亚胺和12-240重量份n-羟基琥珀酰亚胺活化后，再将步骤2)的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反应24～48h，将反应后的溶液逐滴滴入有机溶剂b中，沉淀，离心过滤，真空干燥得ha-pla-rgd-clb；
4)ha-pla-rgd-clb/ce6的制备
将步骤3)所得的ha-pla-rgd-clb溶于去离子水中，称取50-600重量份二氢卟吩e6溶于有机溶剂b中，两溶液混合，搅拌反应24～48h，将反应后的溶液用去离子水透析2～3天，冷冻干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
其中有机试剂a为二甲亚砜、二甲基甲酰胺的一种或混合物；有机试剂b为甲醇，乙醇，冰乙醚，丙酮，乙腈的一种或混合物。
所述的多功能协同的双受体介导靶向给药系统在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明制备工艺所涉及的化学方程式如下：
本发明的有益效果在于：
(1)光疗-化疗协同作用
将光敏剂二氢卟吩e6和化疗药物苯丁酸氮芥共同携载在同一种载体上，能够联合化疗和光动力疗法，使其达到协同作用，提高对肿瘤细胞的抑制效应，减少药物的用量，降低药物的毒副作用；
(2)多重靶向性
透明质酸可以特异性识别肿瘤细胞上的cd44受体，rgd能与肿瘤内皮细胞上的整合素受体αvβ3特异性结合，使得药物主动靶向至肿瘤部位，减少对正常细胞的毒副作用，解决了光敏剂缺乏靶向性，由于脂溶性导致在循环系统中易团聚等问题，可根据肿瘤的部位进行照射，增强了抗肿瘤疗效，有效减轻了光敏剂的毒副作用；
(3)良好的血液稳定性
两亲性聚合物纳米胶束提高了药物在体循环的稳定性，延长其在体内的循环时间；
(4)体系的毒性小、安全性高
所选用的ha、pla均为生物相容性好，可生物降解的高分子材料，适合用于药物载体的构建。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
1.ha-pla-rgd-clb/ce6组分的制备
1)ha-tba的制备
将阳离子交换树脂进行活化后，加入300mg透明质酸钠，搅拌反应12h，此时溶液ph约为3，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph为7，搅拌反应2h，将反应后的溶液冷冻干燥，即得白色絮状物ha-tba，ftir、nmr等表征。
2)聚乳酸活性酯的制备
称取3.967g聚乳酸溶于30ml无水二氯甲烷中，室温下氮气保护，并加入0.204gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.114gn-羟基琥珀酰亚胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反应后的溶液加入冰乙醚中沉淀，将沉淀过滤并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制备
称取300mg上述制备的ha-tba溶于无水二甲亚砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制备的pla-nhs溶于无水二甲亚砜中，在1h内逐滴加入ha-tba溶液中，氮气保护下40℃反应24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的阳离子交换树脂交换tba+，将溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗涤多次，洗去未反应的pla-nhs，用质量体积分数为5％的氯化钠溶液透析3天，再用去离子水透析2天，冷冻干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制备
取上述制备的ha-pla溶于双蒸水中，搅拌溶解，然后加入0.068gn-羟基琥珀酰亚胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应2h后加入30mgrgd，调节溶液的ph5.8，缓慢搅拌，室温反应24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制备
称取0.18g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亚砜，再加入0.245gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.136gn-羟基琥珀酰亚胺活化2h，再将上述制备的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反应24h，将反应后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，离心过滤，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制备
将上述制备的ha-pla-rgd-clb溶于水中，称取20mg二氢卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下搅拌24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
2.多功能协同双受体介导靶向给药系统的细胞毒性实验(卵巢癌skov3细胞)
(1)收集对数期skov3细胞，调整细胞悬浮浓度，铺96孔板，每孔加入100μl细胞培养液，边缘孔用无菌pbs填充。
(2)将培养板置37℃，5％浓度的co2培养箱中培养24h后，弃去上清液，分别加入各个细胞样品对应的药物血清、生理盐水血清以及稀释好的药物，浓度梯度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每个浓度平行接种3个孔，用空白的细胞培养液(无材料加入)作为对照。用激光(λ＝700～1000nm)连续照射20min，37℃，5％浓度的co2培养箱中再培养24h。
(3)将培养液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％浓度的co2培养箱中继续培养4h，置平板摇床上低速振荡10min，酶标仪测定光吸收值(od值)，按公式计算样品的细胞存活率。
细胞毒性实验结果
实施例2
1.ha-pla-rgd-clb/ce6组分的制备
1)ha-tba的制备
将阳离子交换树脂进行活化后，加入300mg透明质酸钠，搅拌反应12h，此时溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph为7，搅拌反应2h，将反应后的溶液冷冻干燥，即得白色絮状物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制备
称取3.174g聚乳酸溶于30ml无水二氯甲烷中，室温下氮气保护，并加入0.2163gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.091gn-羟基琥珀酰亚胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反应后的溶液加入冰乙醚中沉淀，将沉淀过滤并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制备
称取300mg上述制备的ha-tba溶于无水二甲亚砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制备的pla-nhs溶于无水二甲亚砜中，在1h内逐滴加入ha-tba溶液中，氮气保护下40℃反应24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的阳离子交换树脂交换tba+，将溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗涤多次，洗去未反应的pla-nhs，用质量体积分数为5％的氯化钠溶液透析3天，再用去离子水透析2天，冷冻干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制备
取上述制备的ha-pla溶于双蒸水中，搅拌溶解，然后加入0.068gn-羟基琥珀酰亚胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应2h后加入30mgrgd，调节溶液的ph5.8，缓慢搅拌，室温反应24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制备
称取0.18g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亚砜，再加入0.245gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.136gn-羟基琥珀酰亚胺活化2h，再将上述制备的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反应24h，将反应后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，离心过滤，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制备
将上述制备的ha-pla-rgd-clb溶于水中，称取30mg二氢卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下搅拌24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
2.多功能协同双受体介导靶向给药系统的细胞毒性实验(卵巢癌skov3细胞)
(1)收集对数期skov3细胞，调整细胞悬浮浓度，铺96孔板，每孔加入100μl细胞培养液，边缘孔用无菌pbs填充。
(2)将培养板置37℃，5％浓度的co2培养箱中培养24h后，弃去上清液，分别加入各个细胞样品对应的药物血清、生理盐水血清以及稀释好的药物，浓度梯度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每个浓度平行接种3个孔，用空白的细胞培养液(无材料加入)作为对照。用激光(λ＝700～1000nm)连续照射20min，37℃，5％浓度的co2培养箱中再培养24h。
(3)将培养液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％浓度的co2培养箱中继续培养4h，置平板摇床上低速振荡10min，酶标仪测定光吸收值(od值)，按公式计算样品的细胞存活率。
细胞毒性实验结果
实施例3
1.ha-pla-rgd-clb/ce6组分的制备
1)ha-tba的制备
将阳离子交换树脂进行活化后，加入300mg透明质酸钠，搅拌反应12h，此时溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph为7，搅拌反应2h，将反应后的溶液冷冻干燥，即得白色絮状物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制备
称取2.380g聚乳酸溶于30ml无水二氯甲烷中，室温下氮气保护，并加入0.098gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.068gn-羟基琥珀酰亚胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反应后的溶液加入冰乙醚中沉淀，将沉淀过滤并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制备
称取300mg上述制备的ha-tba溶于无水二甲亚砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制备的pla-nhs溶于无水二甲亚砜中，在1h内逐滴加入ha-tba溶液中，氮气保护下40℃反应24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的阳离子交换树脂交换tba+，将溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗涤多次，洗去未反应的pla-nhs，用质量体积分数为5％的氯化钠溶液透析3天，再用去离子水透析2天，冷冻干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制备
取上述制备的ha-pla溶于双蒸水中，搅拌溶解，然后加入0.068gn-羟基琥珀酰亚胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应2h后加入30mgrgd，调节溶液的ph5.8，缓慢搅拌，室温反应24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制备
称取0.5g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亚砜，再加入0.679gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.379gn-羟基琥珀酰亚胺活化2h，再将上述制备的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反应24h，将反应后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，离心过滤，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制备
将上述制备的ha-pla-rgd-clb溶于水中，称取20mg二氢卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下搅拌24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
2.多功能协同双受体介导靶向给药系统的细胞毒性实验(卵巢癌skov3细胞)
(1)收集对数期skov3细胞，调整细胞悬浮浓度，铺96孔板，每孔加入100μl细胞培养液，边缘孔用无菌pbs填充。
(2)将培养板置37℃，5％浓度的co2培养箱中培养24h后，弃去上清液，分别加入各个细胞样品对应的药物血清、生理盐水血清以及稀释好的药物，浓度梯度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每个浓度平行接种3个孔，用空白的细胞培养液(无材料加入)作为对照。用激光(λ＝700～1000nm)连续照射20min，37℃，5％浓度的co2培养箱中再培养24h。
(3)将培养液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％浓度的co2培养箱中继续培养4h，置平板摇床上低速振荡10min，酶标仪测定光吸收值(od值)，按公式计算样品的细胞存活率。
细胞毒性实验结果
实施例4
1.ha-pla-rgd-clb/ce6组分的制备
1)ha-tba的制备
将阳离子交换树脂进行活化后，加入300mg透明质酸钠，搅拌反应12h，此时溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph为7，搅拌反应2h，将反应后的溶液冷冻干燥，即得白色絮状物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制备
称取3.174g聚乳酸溶于30ml无水二氯甲烷中，室温下氮气保护，并加入0.216gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.091gn-羟基琥珀酰亚胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反应后的溶液加入冰乙醚中沉淀，将沉淀过滤并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制备
称取300mg上述制备的ha-tba溶于无水二甲亚砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制备的pla-nhs溶于无水二甲亚砜中，在1h内逐滴加入ha-tba溶液中，氮气保护下40℃反应24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的阳离子交换树脂交换tba+，将溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗涤多次，洗去未反应的pla-nhs，用质量体积分数为5％的氯化钠溶液透析3天，再用去离子水透析2天，冷冻干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制备
取上述制备的ha-pla溶于双蒸水中，搅拌溶解，然后加入0.068gn-羟基琥珀酰亚胺和0.092g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应2h后加入15mgrgd，调节溶液的ph5.8，缓慢搅拌，室温反应24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制备
称取0.5g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亚砜，再加入0.679gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.379gn-羟基琥珀酰亚胺活化2h，再将上述制备的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反应24h，将反应后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，离心过滤，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制备
将上述制备的ha-pla-rgd-clb溶于水中，称取30mg二氢卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下搅拌24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。2.多功能协同双受体介导靶向给药系统的细胞毒性实验(卵巢癌skov3细胞)
(1)收集对数期skov3细胞，调整细胞悬浮浓度，铺96孔板，每孔加入100μl细胞培养液，边缘孔用无菌pbs填充。
(2)将培养板置37℃，5％浓度的co2培养箱中培养24h后，弃去上清液，分别加入各个细胞样品对应的药物血清、生理盐水血清以及稀释好的药物，浓度梯度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每个浓度平行接种3个孔，用空白的细胞培养液(无材料加入)作为对照。用激光(λ＝700～1000nm)连续照射20min，37℃，5％浓度的co2培养箱中再培养24h。
(3)将培养液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％浓度的co2培养箱中继续培养4h，置平板摇床上低速振荡10min，酶标仪测定光吸收值(od值)，按公式计算样品的细胞存活率。
细胞毒性实验结果
实施例5
1.ha-pla-rgd-clb/ce6组分的制备
1)ha-tba的制备
将阳离子交换树脂进行活化后，加入300mg透明质酸钠，搅拌反应12h，此时溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph为7，搅拌反应2h，将反应后的溶液冷冻干燥，即得白色絮状物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制备
称取2.380g聚乳酸溶于30ml无水二氯甲烷中，室温下氮气保护，并加入0.098gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.068gn-羟基琥珀酰亚胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反应后的溶液加入冰乙醚中沉淀，将沉淀过滤并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制备
称取300mg上述制备的ha-tba溶于无水二甲亚砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制备的pla-nhs溶于无水二甲亚砜中，在1h内逐滴加入ha-tba溶液中，氮气保护下40℃反应24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的阳离子交换树脂交换tba+，将溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗涤多次，洗去未反应的pla-nhs，用质量体积分数为5％的氯化钠溶液透析3天，再用去离子水透析2天，冷冻干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制备
取上述制备的ha-pla溶于双蒸水中，搅拌溶解，然后加入0.068gn-羟基琥珀酰亚胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应2h后加入15mgrgd，调节溶液的ph5.8，缓慢搅拌，室温反应24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制备
称取0.5g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亚砜，再加入0.679gn,n'-二环己基碳二亚胺和0.379gn-羟基琥珀酰亚胺活化2h，再将上述制备的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反应24h，将反应后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，离心过滤，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制备
将上述制备的ha-pla-rgd-clb溶于水中，称取20mg二氢卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下搅拌24h，将反应后的溶液用去离子水透析48h，冷冻干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。2.多功能协同双受体介导靶向给药系统的细胞毒性实验(卵巢癌skov3细胞)
(1)收集对数期skov3细胞，调整细胞悬浮浓度，铺96孔板，每孔加入100μl细胞培养液，边缘孔用无菌pbs填充。
(2)将培养板置37℃，5％浓度的co2培养箱中培养24h后，弃去上清液，分别加入各个细胞样品对应的药物血清、生理盐水血清以及稀释好的药物，浓度梯度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每个浓度平行接种3个孔，用空白的细胞培养液(无材料加入)作为对照。用激光(λ＝700～1000nm)连续照射20min，37℃，5％浓度的co2培养箱中再培养24h。
(3)将培养液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％浓度的co2培养箱中继续培养4h，置平板摇床上低速振荡10min，酶标仪测定光吸收值(od值)，按公式计算样品的细胞存活率。
细胞毒性实验结果