一种酶纳米复合物及其可控自组装方法和在免疫分析中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种酶纳米复合物及其可控自组装方法和复 合物在免疫分析中的应用。
【背景技术】
[0002] 酶联免疫分析（Enzyme-Linked TmmunoSorbent Assay, ELISA)是临床、科研中应 用广泛的特异性目标分子分析方法，其主要通过抗原-抗体分子间的特异性识别和酶分子 的高效催化来实现对复杂混合物中目标分子的检测，传统的ELISA方法，通过在抗体分子 上进行酶分子修饰来进行信号输出，通常是一对抗原抗体复合物对应一个酶分子，检测范 围在0. lng/ml-100ng/ml之间。随着技术的发展，该灵敏度已经不能够满足临床检测和科 学研究中的需求，因此亟需发展新型的高灵敏分析方法。
[0003] 目前，现有技术为了增加检测灵敏度，常见的方法是增加修饰的酶分子的数量从 而提高检测灵敏度。主要包括以下几种方法：
[0004] 1.层层自组装生物素化蛋白网络，例如现有技术"Layer by layer assembly of biotinylated protein networks for signal amplification"，Chem. Commun.，2013, 49, 2397,该技术通过多生物素标记的蛋白分子与亲和素反复的结合形成大 的复合物，从而使生物素增多，结合大量亲和素修饰的酶分子，提高免疫分析灵敏度。但是， 该方法存在步骤多，检测时间长，复合物表面酶分子数量不可控等问题，会造成信号不稳定 或者批次间操作的差异等问题。
[0005] 2.酶信号循环放大法，例如现有技术CN 102809648 A公开了一种酶信号循环放 大高灵敏免疫检测方法，该方法主要是通过使用抗HRP的抗体与HRP交联，两者间相互结合 形成大的酶分子复合物，来提高灵敏度。然而该方法交联会破坏HRP或抗体的活性，相互结 合形成大团复合物后，尺寸、酶分子数量完全不可控，会造成信号输出不稳定等问题，而且 制备过程复杂。
[0006] 3.纳米自组装法，如现有技术"Seeding-induced self-assembling protein nanowires dramatically increase the sensitivity of immunoassaysNano Lett. 9(6):2246-50. 2009 An auto-biotinylated bifunctional protein nanowire for ultra-sensitive molecular biosensing. Biosens Bioelectron，'，26 (4) : 1137-41. 2010。 纳米自组装方法是通过自组装的方法将酶分子和特异性结合分子整合在蛋白纳米线上，提 高最终结合在抗原-抗体复合物上的酶分子数量，提高检测灵敏度。但是该方法也存在制 备不可控的问题，酶分子数量不确定，最终导致信号不稳定，无法应用于定量检测。且制备 过程繁琐、成本高。
[0007] 4.纳米管、纳米颗粒法，在纳米材料（如金纳米颗粒、碳纳米管等）上修饰酶分子 和抗体分子，通过提高酶分子数量来提高检测灵敏度的。但是该方法中修饰过程不可控，会 导致蛋白分子功能失活，修饰数量和质量难以控制，批次间重现性差。
【发明内容】
[0008] 本发明为了克服现有技术酶分子数量不可控、重现性差、信号不稳定等缺点，提供 了一种酶纳米复合物及其可控自组装方法，复合物所含有的酶分子数量基本一致，并且通 过调整组装比例，可以得到具有不同酶分子数量的酶纳米复合物。
[0009] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 本发明提供一种酶纳米复合物，包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物 素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自 组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述 M彡12,且M为整数。
[0011] 优选的，酶纳米复合物（简称ENC)中所含有的酶分子数量可通过以下公式进行简 略计算：
[0012] X = nXM-iXn/2
[0013] 其中，X代表ENC中酶分子的数量，M代表纳米颗粒的亚基数目，η代表ENC中所整 合的生物素化的蛋白纳米颗粒（简称NP)的数量，i代表每个NP与相邻颗粒共享的亲和素 修饰的酶分子的数量。
[0014] 优选的，所述纳米颗粒为蛋白纳米颗粒；本领域技术人员知晓，所述纳米颗粒还可 为病毒纳米颗粒。更为优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，其中，每个铁蛋白纳米颗 粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。本领域技术人员知晓，铁蛋白纳米颗粒还可为 小铁蛋白，其中，每个小铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接12个生物素。
[0015] 优选的，所述酶纳米复合物为单体，其中，所述单体表面修饰有M个酶分子。更为 优选的，所述单体表面修饰有24个酶分子。
[0016] 优选的，所述酶纳米复合物为多聚体；优选的，所述多聚体可为二聚体至十聚体 (包括二、三、四、五、六、七、八、九、十聚体），更为优选的，所述多聚体可为二聚体、三聚体 或四聚体。当所述酶纳米复合物为二聚体时，两个纳米颗粒共用一个生物素，当纳米颗粒为 铁蛋白纳米颗粒时，二聚体表面修饰有47个酶分子；当复合物为三聚体时，当纳米颗粒为 铁蛋白纳米颗粒时，三聚体表面修饰有69个酶分子；当复合物为四聚体，纳米颗粒为铁蛋 白纳米颗粒时，四聚体表面修饰有92个酶分子。依次类推，随着共用的生物素数量的增加， 形成包括更多酶分子的多聚体。
[0017] 优选的，所述每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素包括：
[0018] 通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合生物素接受多肽（biotin accepted peptide, BAP)得到融合蛋白基因，将所述融合蛋白基因克隆入表达载体；
[0019] 将生物素蛋白连接酶（Biotin-protein ligase, BirA)克隆入共表达载体中；
[0020] 将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱 导表白蛋白和生物素；
[0021 ] 经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒。
[0022] 优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白包括24个相同或同源的 亚基；更为优选的，铁蛋白为重组人重链铁蛋白（recombinant human heavy-chain ferritin, rHF)〇
[0023] 优选的，通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合连接多肽之后再融合生 物素接受多肽得到融合蛋白基因。减少可能存在的位阻的影响，保持生物素接受多肽远离 纳米颗粒的表面。
[0024] 优选的，所述表达载体和所述共表达载体为质粒载体，所述表达宿主选自大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。更为优 选的，所述表达载体为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11，所述共表达载体为pCDFDuel-1， 所述表达宿主为大肠杆菌。
[0025] 优选的，所述克隆通过链式酶聚合反应（PCR)完成。
[0026] 优选的，将生物素蛋白连接酶（BirA)克隆入共表达载体中具体包括：获取BirA基 因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分别加入限制性内切酶NcoI和Sail的酶切 位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA和表达载体p⑶FDuel-I进行双酶切反应， 收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和p⑶FDuel-I载体按物质的量比以6 :1进行连 接反应，得到 BirA-pCDFDuel-1。
[0027] 优选的，将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后 加入诱导表白蛋白和生物素具体包括：将表达载体和共表达载体加入含有表达宿主和抗生 素的培养基中培养过夜，直至活化至对数生长期，加入IPTG诱导表白蛋白和生物素过夜， 进行培养和表达。
[0028] 优选的，经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒具体包括：收集表达后的产物进 行超声破粹，收集上清液，水浴反应后离心，收集上清液利用蔗糖密度梯度离心或凝胶排阻 层析收集纳米颗粒。
[0029] 优选的，所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酶。
[0030] 另一方面，本发明还提供一种酶纳米复合物可控自组装方法，通过遗传修饰制备 生物素化的纳米颗粒，将所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其中，所述纳米 颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，