附图6-a和7-a所示，当溶液中SA-HRP的量远远超过或等于BAP-rHF表面生物 素分子的数量时（即SA-HRP :BAP-rHF纳米颗粒> 24 :1时），在一个具体的实施方式中，配 比可以为24~30 :1，本领域技术人员知晓SA-HRP的量可以更大，但是饱和后继续增加酶 的用量意义不大。BAP-rHF纳米颗粒表面的生物素分子就会被SA-HRP所饱和，从而形成表 面覆盖有HRP仅含有一个纳米颗粒的ENC。随着SA-HRP数量的减少，BAP-rHF纳米颗粒表 面的生物素分子不能被SA-HRP所饱和时，BAP-rHF纳米颗粒间就必须共享SA-HRP，从而形 成纳米颗粒间的聚集。
[0095] 如附图6-b和7-b所示，当SA-HRP :BAP-rHF纳米颗粒=23. 5 :1时，每两个 BAP-rHF纳米颗粒间就必须共享一个SA-HRP，这样就会形成两个BAP-rHF纳米颗粒聚集的 ENC。本领域技术人员知晓，在具体的试验中，由于试剂浓度测量的准确性以及其它客观条 件（如系统误差、分子的具体差异等）的限制，形成二聚体时两者的比例并不局限于23. 5 : 1,也可依据实际需求作微调。
[0096] 如附图6-c和7-c所示，进一步减少SA-HRP的量达到SA-HRP :BAP-rHF纳米颗粒 =23 :1时，每个纳米颗粒就需要与相邻的纳米颗粒共享两个SA-HRP分子，从而形成三聚体 或四聚体形式的ENC。SA-HRP :BAP-rHF纳米颗粒=22. 5 :1时，每个纳米颗粒就需要与相 邻的两个或三个纳米颗粒共享多个SA-HRP分子，从而形成大的多聚体（如附图7-d、7-e)。 进一步减少SA-HRP的量，例如可为20~22. 5 :1，可以得到更多纳米颗粒聚集的紧密堆积 的ENC(如附图7-f)。本领域技术人员知晓，在具体的试验中，由于试剂浓度测量的准确性 以及其它客观条件（如系统误差、分子的具体差异等）的限制，形成多聚体时两者的比例并 不局限于上述具体数值，也可依据实际需求作微调。
[0097] 当SA-HRP的量减少到一定比例，这种趋势发生改变。
[0098] 本发明实施例中ENC中所含有的酶分子数量可通过以下公式进行简略计算：
[0099] X = nX24-iXn/2
[0100] 其中，X代表ENC中酶分子的数量，η代表ENC中所整合的生物素化的铁蛋白纳米 颗粒（简称bFNP)的数量，i代表每个bFNP与相邻颗粒共享的SA-HRP的数量。
[0101] 在一个具体的实施方式中，单体的ENC含有酶分子约为24个、二聚体（共用一个 亲和素）有47个酶分子、三聚体（共用2个亲和素）或四聚体（共用2个亲和素）有69-92 个，六至十聚体（共用3个亲和素）有141-225个酶分子，且随着共享的亲和素增多所含有 的酶分子会更多，当达到一定比例后，最终可使ENC含有高达数百个酶分子。
[0102] 相对已有的提高酶分子数量的方法，本发明所制备的ENC具有更大的形态一致 性。而且本方法仅需在现有的商业化试剂中添加 bFNP即可制备，非常便捷。同时，也可以 制成预制试剂，满足大部分形式免疫分析的使用。
[0103] 在一个具体的实施方式中，本发明中酶还可为葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、蔗糖氧 化酶、酪氨酸氧化酶等可用于酶联反应的酶。
[0104] 实施例4
[0105] 在本发明一个具体的实施方式中，ENC可用于制备ELISA检测试剂盒，试剂盒包 括生物素化的纳米颗粒以及亲和素修饰的酶，纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过 自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，其中 12,且M为整数。在使用时，将生物素化的蛋白纳米颗粒和亲和素修饰的酶按一定的比 例进行混合，即可制得不同尺寸的ENC。
[0106] 在一个具体的实施方式中，试剂盒包括生物素化的铁蛋白纳米颗粒以及亲和素修 饰的酶，其中每个铁蛋白纳米颗粒表面均匀连接24个生物素。在使用时，将生物素化的铁 蛋白纳米颗粒和亲和素修饰的酶按一定的比例进行混合，即可制得不同尺寸的ENC。也可以 将ENC预制成实际，在实际使用中直接添加即可。此外，单独使用本发明试剂盒中的生物素 化的纳米颗粒与其它现有的商业试剂混合，也可用于免疫分析。
[0107] 其中，本发明中酶可为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、蔗糖氧化酶、 酪氨酸氧化酶等可用于酶联反应的酶。
[0108] 本领域技术人员知晓，试剂盒中还可包括缓冲液、洗涤液、稀释液或显色剂等，在 此不做赘述。
[0109] 实施例5
[0110] 下面结合附图6-10对本发明基于ENC的超灵敏ELISA作进一步阐述。以下实施 例中以酶-铁蛋白纳米复合物为例，本领域技术人员知晓，ENC不仅限于酶-铁蛋白纳米复 合物，其它与铁蛋白类似的能够进行遗传修饰和可控自组装的球形蛋白纳米或病毒纳米颗 粒也可适用于本发明ELISA检测。
[0111] UENC用于免疫分析大幅提高灵敏度的原理：通过控制SA-HRP与BAP-rHF纳米颗 粒之间的摩尔比例，即可得到尺寸可控的ENC，ENC整合了大量的酶分子，同时又具有SA包 覆的表面。如附图6-d所示，ENC可以在通过生物素-亲和素相互作用将大量的酶分子结 合于生物素化抗体-抗原复合物上，从而达到大幅提高免疫分析灵敏度的目的。
[0112] 2、ENC的制备：测定BAP-rHF纳米颗粒和SA-HRP的浓度，按照一定比例（物质的 量比为I :20 - 1 :30之间）将BAP-rHF纳米颗粒与SA-HRP混合并剧烈振荡混匀后，4度孵 育备用。
[0113] 3、基于ENC的超灵敏免疫分析：
[0114] a、基于ENC的间接ELISA，其具体步骤为：
[0115] 1)将抗原包被于酶标板；
[0116] 2)洗涤；
[0117] 3)封阻；
[0118] 4)洗涤；
[0119] 5)分别加入样品及阴阳性对照，孵育；
[0120] 6)洗涤；
[0121] 7)加入生物素化一抗，孵育；
[0122] 8)洗涤；
[0123] 9)加入预先制备的不同比例的ENC，孵育；
[0124] 10)洗涤；
[0125] 11)加入底物反应，孵育；
[0126] 12)终止反应，测定结果。
[0127] b、基于ENC的夹心ELISA，其具体步骤为：
[0128] 1)将捕获抗体包被于酶标板；
[0129] 2)洗涤；
[0130] 3)封阻；
[0131] 4)洗涤；
[0132] 5)每孔加入样品及阴阳性对照，孵育；
[0133] 6)洗涤；
[0134] 7)加入生物素化识别抗，孵育；
[0135] 8)洗涤；
[0136] 9)加入预先制备的不同比例的ENC，孵育；
[0137] 10)洗涤；
[0138] 11)加入底物反应，孵育；
[0139] 12)终止反应，测定结果。
[0140] 将ENC用于间接ELISA检测HIV p24抗体和心肌肌钙蛋白cTnl的结果分别提高 了检测灵敏度1000和10000倍。
[0141] 下面结合附图8对基于ENC的p24抗体检测作进一步阐述：
[0142] 1)将纯化的p24抗原（购自苏州杰恩）用包被缓冲液（碳酸盐缓冲液）稀释为 10 μ g/mL，100 μ L/ 孔包被 96 孔板（购自 corning)，4°C过夜。
[0143] 2)洗涤，PBST(含有 0·〇5% Teween 2〇 的 PBS，3〇OyL/孔）洗 3 遍。
[0144] 3)封阻，每孔加入300yL的5%的脱脂牛奶（PBS溶解），37°C封阻2小时。
[0145] 4)洗涤，PBST 洗 3 遍。
[0146] 5)将p24抗体用健康人血清梯度稀释（从1 μ g/mL到lpg/ml)，每孔加入100 μ L， 于恒温混匀仪上37°C反应2小时。
[0147] 6)甩去反应液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0148] 7)将生物素化的羊抗小鼠 IgG(购自博士德）按说明书稀释，每孔加入IOOyL,于 恒温混匀仪上37°C反应1小时。
[0149] 8)甩去反应液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0150] 9)每孔加入100 μ L ENC(组装比例1 :20~23. 5)，于恒温混匀仪上37°C反应1小 时。
[0151] 10