专利名称：：检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒及方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，尤其一种检测试剂盒，具体来说是一种基于PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒，及对应的检测方法。
背景技术：
：广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)是1933年由我国学者陈心陶在广东省广州市黑家鼠(Rattusrattus)和褐家鼠(R.norvegicus)肺部发现并命名的，属圆线虫目(Strongylata)、后圆线虫科(Metastronylidae)、管圆线虫属(Angiostrongylus)。主要分布在太平洋、印度洋某些岛屿和东南亚国家。广州管圆线虫的发育过程分为幼虫和成虫阶段，幼虫分为I期、II期、III期、IV期和V期幼虫。广州管圆线虫成虫寄生在鼠肺动脉内，雌虫产卵于血流中，虫卵随血流到肺毛细血管，在末梢动脉血管内形成栓塞并发育，成熟后孵出第一期幼虫，幼虫穿过毛细血管进入肺泡，在呼吸道沿气管上行到达咽喉部，再吞入消化道，最后随粪便排出体外。当第一期幼虫被软体动物吞食或主动钻入其体内而感染发育成第三期幼虫(感染期幼虫)。当鼠吞食含感染期幼虫的软体动物或饮用了受污染的水后，幼虫在鼠胃内蜕鞘，并进入肠壁小血管，经肝或淋巴管、胸导管被带至右心，再经肺部血管至左心，由此到达身体各部器官发育为成虫并产卵，完成广州管圆线虫的一个生活周期。人类多因食用含有第III期活幼虫的淡水螺肉而感染，也可通过食用转续宿主如鱼、虾、蛙等或污染的水及蔬菜等而感染，皮肤接触也有可能导致感染。当有活力的III期幼虫被人误食，广州管圆线虫在人体内移行，穿过人体消化道壁进入血管，顺血流进入脑部，引起中枢神经系统的损害和炎症反应。广州管圆线虫病患者临床症状多数以中枢神经系统损害为主的脑膜脑炎和脑膜炎症状，主要表现为急性头痛、颈项强直、脑膜刺激症等，严重者亦可引起死亡。目前，全球报道病例已超过2800多例。在我国大陆第一例广州管圆线虫病例报道于1984年，直到1996年只有3例病例。然而，随着人类饮食习惯的变化，病例数显著增加，在过去的十年里，中国大陆发生了9次暴发，台湾3次，尤其是在我国近期的几次暴发中，病例数超过300多例。随着该虫中间宿主的扩散蔓延及食用螺肉者增多，发病人数呈继续增长的态势，且有从南方沿海向北方蔓延的趋势，其蔓延的速度之快引起人们的重视。广州管圆线虫病已经引起了我国卫生部门和世界卫生组织的重视。卫生部在2003年将广州管圆线虫病列为我国“新发传染病”，2005年再一次警告人们警惕包括广州管圆线虫在内的严重威胁人类健康的食源性寄生虫病。从生活史可看出，完成生活史周期必须要以鼠作为终宿主及某些螺类作为中间宿主。目前在我国有报道的广州管圆线虫中间宿主有小管福寿螺(Pomaceacanaliculate)、褐云玛瑙螺、皱疤坚螺、短梨巴蜗牛、同型巴蜗牛、中华圆田螺、环棱螺及蛞蝓等。在众多中间宿主中，小管福寿螺是广州管圆线虫的重要中间宿主，其广州管圆线虫自然感染率最高(65%)，在温州地区其自然感染率高至69%。近年来温州与福州地区以及近期北京市广州管圆线虫病的暴发均因食用福寿螺引起。小管福寿螺已成为传播广州管圆线虫的优势种群之一。小管福寿螺为软体动物门(Mollusca)，腹足纲(Gastropoda)，前腮亚纲(Prosobranchia)，ifIIliilMg(Caenogastropoda)，中月复g(Mesogastropoda)，Mil超科(Ampullarioidae)，瓶螺科(Ampullariidae)。原产于南美洲亚马逊河流域，由巴西华侨以高蛋白质食物引进台湾，1981年引入广东，在该省作为特种经济作物广为养殖，后又被引入到其他省份养殖。近十几年来，张莹珍等报道福州市区福寿螺的感染率为20.85%(49/235)，林金祥等报导福建长乐福寿螺的感染率为40.0%，罗斌等报告福州市福寿螺感染率为18.82%，李莉莎等报告福建省连江南安两地福寿螺感染率为16.64%，柳坚等调查了海南定安县的小管福寿螺显示感染率为7.1%(10/140)，孙慧冰等报道广东肇庆市小管福寿螺感染率为10.79%，张志强等报告茂名市福寿螺的感染率为20.14%，邓卓晖等报道广东省小管福寿螺平均感染率为5.9%(172/2929)。目前，小管福寿螺的检测方法，主要是基于显微镜的病原学检测，包括直接沉淀镜检法、胃蛋白酶消化法和肺检法。直接沉淀镜检法亦称勻浆法，是将研磨的小管福寿螺的组织用脱氯水沉淀数次后镜检沉淀中幼虫情况；胃蛋白酶消化法则是将研碎的组织用蛋白酶消化后镜检沉淀中的幼虫情况；肺检法是在光镜下观察肺囊中幼虫结节的方法。然而，由于福寿螺体积较大而广州管圆线虫III期幼虫(L3)相对较小，这些检测方法对检测者知识和技术要求较高，费时费力，且对于感染度较低的福寿螺漏检率高，同时对于早期感染检测困难。随着分子生物学的飞速发展，PCR技术在敏感性和特异性上的优势，已逐渐被用于寄生虫病检测上。但目前，仍没有针对小管福寿螺体内广州管圆线虫的PCR检测方法。然而在检测软体动物时，常常因软体动物中存在大量PCR抑制物而导致PCR反应失败，而出现假阴性情况的发生。
发明内容本发明要解决的技术问题在于提供一种检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒及方法，为现场快速检测小管福寿螺提供一种新的、更为快速有效的病原体检测手段。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，提供一种检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒，所述的试剂盒中含有=(A)CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)裂解液(含有2%CTAB，20mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，0·lmol/LTris-Cl(三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl(氯化钠))；(B)巯基乙醇；(C)蛋白酶K(20mg/mL)；(D)苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，苯酚氯仿异戊醇(25241)；(E)Tris-EDTA缓冲液，该缓冲液含IOmmol/LTris-Cl和Immol/LEDTA，pH为8.0;(F)2XMasterPCRMix；(G)引物(10μmol/L)，所述引物含有引物1和引物2；引物1(此对序列是已报道的)上游5，-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3，(SEQIDNO1所示序列)下游5，-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT_3，(SEQIDNO2所示序列)引物2(自己设计的)上游:5，-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3，(SEQIDNO3所示序列)下游5，-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3，(SEQIDNO4所示序列)。该试剂盒可抽提DNA100次，含有㈧CTAB裂解液50_70ml，(B)巯基乙醇800-1000μ1,(C)20mg/mL的蛋白酶K500-700μ1,(D)苯酚、氯仿和异戊醇的混合液120-200ml,(E)Tris-EDTA缓冲液6_15ml，(F)2XMasterPCRMixF750μ1,(G)IOymol/L的引物60μ1。在本发明的另一方面，提供了一种采用上述的试剂盒检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的方法，包括如下步骤1)小管福寿螺肺囊组织粉碎后，取彡lOOmg，加入(A)CTAB裂解液500-700μ1,(B)巯基乙醇8-10μ1以及(C)20mg/mL的蛋白酶K5_7μ1，60°C水浴5_10小时至完全消化；2)加入⑶苯酚、氯仿和异戊醇的混合液500-700μ1，充分混勻，常温下10，000-16，OOOrpm离心IOmin；3)取上清，加入等体积的(D)苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，充分混勻，常温下10，000-16，OOOrpm离心IOmin；4)重复第3)步；5)取上清，加入2-3倍体积95%或无水乙醇，常温下11，000-13，OOOrpm离心IOmin；6)弃上清，取沉淀，加入500μ170%或75%乙醇洗涤，常温下10，000-13，OOOrpm离心5min；7)弃上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入(E)Tris-EDTA缓冲液60-150μ1溶解，_20°C保持备用；9)将步骤8)的产物进行PCR反应将双蒸灭菌水5.9μ1，(F)2XMasterPCRMix7.5μ1,(6)1(^11101/1的引物0.6(^1，步骤8)获取的DNA样本1μ1，充分混勻后500-5000rpm简短离心5_10s，进行PCR反应；10)PCR产物取6μ1进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察条带，判断小管福寿螺感染情况。步骤9)中PCR反应的条件为95°C预变性5min后进行94°C变性lmin、56°C退火45s、72°C延伸Imin的35个循环的扩增，72°C延伸7min后保存。本发明的有益效果在于目前的各种PCR衍生技术中，多重PCR技术可同时实现检测与假阴性控制。本发明在PCR反应体系中除特异性扩增广州管圆线虫的引物外，还加入一对特异性扩增小管福寿螺的引物，作为内参，采用该两对引物(上述引物1和引物2)进行PCR反应可以避免假阴性情况的发生。本发明的创新点旨在建立一种多重PCR方法快速检测方法应对这种以暴发形式出现的食源性寄生虫病。为现场快速检测小管福寿螺提供一种新的、更为有效的病原体检测手段。本发明方法可检测广州管圆线虫的最低浓度为120pg/μ1。实验检测153个小管福寿螺样本，与肺检法比较，敏感度达到93.8%，特异度为95.2%。本发明的试剂盒敏感性高、特异性强、重复性好，为基层展开小管福寿螺分子学检测提供便利，同时检测方法简单实用。本发明的检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒及检测方法在小管福寿螺流行病学监测以及广州管圆线虫病暴发时食用螺检测中有着重要的作用，拥有广阔的应用前景。图1是实施例4中多重PCR的1.5%琼脂糖凝胶电泳图。具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中采用的试剂如下A液CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)；B液巯基乙醇；C液蛋白酶K(20mg/mL)；D液苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，其中，苯酚氯仿异戊醇为25241；E液Tris-EDTA缓冲液(10mmol/LTris-Cl,Immol/LEDTA,ρΗ8·0)；F液2XMasterPCRMix；G液引物(10μmol/L)，含有引物1和引物2引物1(此对序列是已报道的)上游5，-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3，(SEQIDNO1所示序列)下游5，-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT_3，(SEQIDNO2所示序列)引物2(自己设计的)上游5，-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3，(SEQIDNO3所示序列)下游5，-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3，(SEQIDNO4所示序列)。其中，CTAB、巯基乙醇购自AMRESC0，EDTA,NaCl购自华美生物工程公司，Tris-Cl购自BIOBASICINC.，蛋白酶K购自Sigma公司，2XMasterPCRMix购自上海莱枫生物科技有限公司，苯酚购自所来报生物科技有限公司，氯仿、异戊醇购自上海化学化工公司。实施例1采用试剂盒进行小管福寿螺DNA抽提1)小管福寿螺肺囊组织粉碎后，取50mg左右，加入600μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)),9μ1B液(巯基乙醇)，6μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化过夜；2)加入600μ1D液(苯酚氯仿异戊醇(25241))，充分混勻，10，OOOrpm离心IOmin；3)取上清，加入等体积的D液，充分混勻，10,OOOrpm离心IOmin；4)重复第3)步；5)取上清，加入2倍体积无水乙醇，11，OOOrpm离心IOmin；6)弃上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗涤，11，OOOrpm离心5min；7)弃上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入80μ1E液(Tris-EDTA缓冲液)溶解，_20°C保持备用。实施例2采用试剂盒进行已有DNA样本的检测1)PCR反应体系准备双蒸灭菌水5.9μ1，F液(2XMasterPCRMix)7.5μ1，G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，实施例1步骤8)完成后获取的已有DNA样本1μ1，充分混勻后500rpm简短离心5s；2)PCR反应体系如下950C预变性5min940C变性1min560C退火45sI35个循环；72°C延伸1min」720C延伸7min3)PCR产物取6μ1进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察条带，判断小管福寿螺感染情况。实施例3采用试剂盒进行小管福寿螺DNA抽提及检测1)小管福寿螺肺囊组织粉碎后，取IOOmg左右，加入700μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB,20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)),10μ1B液(巯基乙醇)，7μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化过夜；2)加入700μ1D液(苯酚氯仿异戊醇(25241))，充分混勻，16，OOOrpm离心IOmin；3)取上清，加入等体积的D液，充分混勻，16，OOOrpm离心IOmin；4)重复第3)步；5)取上清，加入3倍体积无水乙醇，13，OOOrpm离心IOmin；6)弃上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗涤，13，OOOrpm离心5min；7)弃上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入150μ1E液(Tris-EDTA缓冲液)溶解，_20°C保持备用。9)将第8)步的产物进行PCR反应；9.1)PCR反应体系准备双蒸灭菌水5.9μ1，F液(2XMasterPCRMix)7.5μ1,G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，步骤8)获取的DNA样本1μ1，充分混勻后5000rpm简短离心IOs；9.2)PCR反应体系如下95°C预变性5min94°C变性1min56°C退火45sL35个循环；72"C延伸1min」720C延伸7min9.3)PCR产物取6μ1进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察条带，判断小管福寿螺感染情况。实施例4采用试剂盒进行小管福寿螺DNA抽提及检测1)小管福寿螺肺囊组织粉碎后，取IOOmg左右，加入500μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl))，8μ1B液(巯基乙醇)，5μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化过夜；2)加入500μ1D液(苯酚氯仿异戊醇(25241))，充分混勻，13，200rpm离心IOmin；3)取上清，加入等体积的D液，充分混勻，13，200rpm离心IOmin；4)重复第3)步；5)取上清，加入2.5倍体积无水乙醇，12，OOOrpm离心IOmin；6)弃上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗涤，10，OOOrpm离心5min；7)弃上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入60μ1E液(Tris-EDTA缓冲液)溶解，_20°C保持备用；9)将第8)步的产物进行PCR反应；9.1)PCR反应体系准备双蒸灭菌水5.9μ1，F液(2XMasterPCRMix)7.5μ1,G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，步骤8)获取的DNA样本1μ1，充分混勻后2000rpm简短离心8s；9.2)PCR反应体系如下950C预变性5min940C变性1min560C退火45s135个循环；720C延伸1min^72°C延伸7min9.3)PCR产物取6μ1进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察条带，判断小管福寿螺感染情况。10)实验结果阴性、阳性结果判断见图1。如图1所示，1-6是阴性螺样本，即仅一条大小约为550bp的条带。550bp条带为小管福寿螺扩增条带，表明抽提DNA中仅含小管福寿螺DNA，而无广州管圆线虫DNA，说明该螺样本未感染广州管圆线虫，为阴性；7-15、17是阳性螺样本，即存在一条大小约为550bp和一条大小约为405bp的条带，其中405bp条带为广州管圆线虫扩增条带，表明抽提DNA同时含有小管福寿螺和广州管圆线虫DNA，说明该螺样本感染广州管圆线虫，为阳性；16是阴性对照，即无扩增条带，在该情况下表明PCR检测失败；M是DNAmarkerII。本发明方法可检测广州管圆线虫的最低浓度为120pg/y1。153只从野外采集的福寿螺，经肺检法检测并记录每只小管福寿螺的感染情况后进行多重PCR检测，两种方法的检测结果如表1所示，与肺检法比较，本发明检测方法的敏感度达到93.8%，特异度为95.2%。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求一种检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有(A)CTAB裂解液，该CTAB裂解液含有2％CTAB，20mmol/LEDTA，0.1mol/LTris-Cl和1.4mol/LNaCl；(B)巯基乙醇；(C)20mg/mL的蛋白酶K；(D)苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，苯酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1；(E)Tris-EDTA缓冲液，该缓冲液含10mmol/LTris-Cl和1mmol/LEDTA，pH为8.0；(F)2×MasterPCRMix；(G)10μmol/L的引物，所述引物含有引物1和引物2，该引物1的序列为上游5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3’(SEQIDNO1所示序列)，下游5’-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3’(SEQIDNO2所示序列)；该引物2的序列为上游5’-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3’(SEQIDNO3所示序列)，下游5’-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3’(SEQIDNO4所示序列)。2.如权利要求1所述的检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可抽提DNA100次，含有(A)CTAB裂解液50_70ml，(B)巯基乙醇800-1000u1，(C)20mg/mL的蛋白酶K500-700u1,(D)苯酚、氯仿和异戊醇的混合液120_200ml，(E)Tris-EDTA缓冲液6-15ml，(F)2XMasterPCRMixF750u1，(G)10iimol/L的引物60ii1。3.—种检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的方法，包含如下步骤1)小管福寿螺肺囊组织粉碎后，取<100mg，加入如权利要求1所述的(A)CTAB裂解液500-700u1,(B)巯基乙醇8-10iil以及(C)20mg/mL的蛋白酶K5-7yl，60°C水浴5-10小时至完全消化；2)加入如权利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和异戊醇的混合液500-700iU，充分混勻，常温下10，000-16,OOOrpm离心lOmin；3)取上清，加入等体积的如权利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，充分混勻，常温下10，000-16，OOOrpm离心lOmin；4)重复第3)步；5)取上清，加入2-3倍体积95%或无水乙醇，常温下11，000-13，OOOrpm离心lOmin；6)弃上清，取沉淀，加入500ill70%或75%乙醇洗涤，常温下10，000-13，OOOrpm离心5min；7)弃上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入如权利要求1所述的(E)Tris-EDTA缓冲液60-150u1溶解，_20°C保持备用；9)将步骤8)的产物进行PCR反应将双蒸灭菌水5.9iU，如权利要求1所述的(F)2XMasterPCRMix7.5yl，如权利要求1所述的(G)10iimol/L的引物0.60yl，步骤8)获取的DNA样本1ii1，充分混勻后500-5000rpm简短离心5_10s，进行PCR反应；10)PCR产物取6iU进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察条带，判断小管福寿螺感染情况。4.如权利要求3所述的检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的方法，其特征在于，步骤9)中PCR反应的条件为95°C预变性5min后进行94°C变性lmin、56°C退火45s、72°C延伸lmin的35个循环的扩增，72°C延伸7min后保存。全文摘要本发明公开了一种检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的试剂盒，该试剂盒中含有(A)CTAB裂解液(2％CTAB，20mmol/LEDTA，0.1mol/LTris-Cl，1.4mol/LNaCl)；(B)巯基乙醇；(C)蛋白酶K(20mg/mL)；(D)苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)；(E)Tris-EDTA缓冲液(10mmol/LTris-Cl，1mmol/LEDTA，pH8.0)；(F)2×MasterPCRMix；(G)引物(10μmol/L)。此外，本发明还公开了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的方法。本发明的试剂盒敏感性高、特异性强、重复性好，检测方法简单实用，为基层展开小管福寿螺分子学检测提供便利，同时为广州管圆线虫病暴发后食用螺的检测提供有效手段。文档编号C12Q1/68GK101824474SQ201010137439公开日2010年9月8日申请日期2010年3月31日优先权日2010年3月31日发明者刘和香,危芙蓉,吕山,周晓农,张仪,胡玲申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所