L-半胱氨酸生产菌以及l-半胱氨酸的生产方法

专利名称：L-半胱氨酸生产菌以及l-半胱氨酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及L-半胱氨酸或其关联物质的生产方法，具体来说涉及适于生产L-半 胱氨酸或其关联物质的细菌、以及使用该细菌的L-半胱氨酸或其关联物质的生产方法。 L-半胱氨酸以及其关联物质可以在医药品、化妆品以及食品领域中被利用。
背景技术：
L-半胱氨酸可以通过从毛发、角、羽毛等含有角蛋白质的物质中提取而获得，或者 以DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸为前体通过细菌酶转化而获得。此外，还计划使用新型酶通 过固定化酶方法大量生产L-半胱氨酸。还尝试通过使用细菌的发酵方法来生产L-半胱氨酸。例如，本发明人公开的使 用下述埃希氏菌属细菌的L-半胱氨酸的生产方法，所述埃希氏菌属细菌的L-半胱氨酸分 解系统受到了抑制、并且携带且降低了 L-半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase (EC 2. 3. 1. 30)，下面也称为“SAT”)(专利文献1)。此外，作为通过抑制 L-半胱氨酸分解系统从而提高了 L-半胱氨酸生产能力的细菌，已知的有使胱硫醚- β -裂 解酶(专利文献1)、色氨酸酶(专利文献2、、0_乙酰丝氨酸巯基水解酶B (专利文献3)的 活性降低或缺失的棒状杆菌型细菌或埃希氏属细菌。此外，还已知使用下述细菌的L-半胱 氨酸制造方法，所述细菌中，利用编码具有降低L-半胱氨酸反馈抑制的特定突变的SAT的 DNA序列，使L-半胱氨酸物质代谢摆脱了调控(专利文献4)。还已知编码YdeD蛋白质的ydeD基因(非专利文献1)以及编码YfiK蛋白质的 yfiK基因(专利文献幻与L-半胱氨酸途径的代谢产物的分泌有关。此外，已知通过增强作 为编码适于分泌针对细胞的有毒物质的蛋白质的基因的mar-基因座、acr-基因座、cmr-基 因座、mex-基因座、bmr-基因座、qacA-基因座(专禾丨J文献6)、或emrAB、emrKY、yojIH、 acrEF、bcr或者cusA基因(专利文献7)的表达来提高L-半胱氨酸生产能力的技术。此外，作为L-半胱氨酸生产菌，已知有增强了由cysB基因编码的半胱氨酸调节子 的正向转录调控因子的活性的大肠杆菌(专利文献8)。另一方面，在L-氨基酸的发酵生产中，不仅L-氨基酸向细胞外的分泌，L-氨基 酸的摄入也是很重要的。微生物在各自的生长繁育的环境中，具有从环境中向细胞内摄 入多种氨基酸并加以利用的能力。例如大肠杆菌(E. coli)，其具有许多转运体，预计也应 当具有相当多的与L-氨基酸的摄入相关的转运体。在预测具有“膜转运蛋白(membrane tranporter protein) ”功能的物质中，估计其中的14%与氨基酸的转运相关(非专利文 献2)。但是，由于在转运体中通常存在着多种基质特异性的各种种内同源物(〃，口夂， paralogue)，另外功能性的重复(对于同一基质存在多个摄入系统)也较多，因此对转运体 的功能的鉴定是非常困难的(非专利文献3)。如上所述，转运体的功能、生理上的作用是非 常复杂的。因此，就从同源性、表型出发简单地推定转运体的性质而言，有时具有不能反应 出实际的转运体的生理功能的情况。例如，无法预测在对多种基质的输送中哪一种输送是 具有生理上重要功能的等。此外，相反，即使了解了输送某种物质的过程，还具有存在其他多个同样转运该物质的因子的可能性。因此，就用于氨基酸发酵生产的微生物的修饰而言， 利用转运体作为目标并不容易。此外，在细菌的L-半胱氨酸以及其关联化合物中，涉及到胱氨酸的摄入系统的有 如下所示的几种看法，但基本上没有与L-半胱氨酸、S-硫代半胱氨酸(S- 7 > 7才〉7 f ^ S-sulfocysteine)的摄入相关的有力的见解。推测在大肠杆菌中存在动力学特性(Kinetics)不同的至少2种胱氨酸摄入系统 (非专利文献4)。在体外(in vitro)的实验体系中显示出FliY与胱氨酸相结合(非专利 文献幻，fliY基因和与其邻近的yecC，yecS, yecO形成操纵子，推测其作为ABC转运体发 挥功能(非专利文献6)。但是，它们是否在大肠杆菌中起生理上摄入胱氨酸的功能，目前尚 未通过实验直接揭示出来。同样地，在沙门氏菌(Salmonella)属的细菌中，预计也存在动力学上不同的3种 胱氨酸摄入系统(非专利文献7)，但目前还没有鉴定出与此相关的蛋白质、以及编码它们 的基因。另外，已有报道称在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中具有3种胱氨酸摄入系 统(YckKJI，YtmJKLMN, YhcL)，在该3种系统缺损的情况下，将胱氨酸作为唯一硫源时，该细 菌不能生长繁育(非专利文献8)。有报道称大肠杆菌的YdjN与涉及枯草芽孢杆菌的胱氨酸摄入的TcyP具有45 %的 同源性(非专利文献8)，但实际上，无法确认其是否具有胱氨酸摄入活性。 在发酵乳杆菌(Lactobai 1 Ius fermentum) BRl 1中，已知了由bspA编码胱氨酸摄 入系统(Turner et al. J. Bacteriol. 181. 2192-2198 (1999))。此外，推测在侵肺军团菌 (Legionella pneumophila)中存在动力学上不同的2种半胱氨酸摄入系统(非专利文献 9)，但尚未确定基因以及蛋白质。现有技术文献专利文献专利文献1特开平11-155571号专利文献2特开2003-169668专利文献3特开2005-245311专利文献4特表2000-504926专利文献5特开2004-49237专利文献6美国专利第5972663号专利文献7特开2005-287333专利文献8国际公开小册子第01/27307号
非专利文献非专利文献1 Dabler et al. , Mol. Microbiol. 36. 1101-1112(2000)非专利文献2 Paulsen et al.，J. Mol. Biol. 277. 573-592 (1998)非专利文献3 Hosie et al.，Res. Microbiol. 152. 259-270(2001)非专利文献4 Berger et al.，J. Biol. Chem. 247. 7684-7694(1972)非专利文献5 Butler et al.，Life Sci. 52. 1209-1215(1993)非专利文献6 Hosie et al.，Res. Microbiol. 152. 259-270(2001)非专利文献7 Baptist et al. , J. Bacteriol. 131. 111-118(1977)
非专利文献 8 Burguiere et al.，J. Bacteriol. 186. 4875-4884(2004)非专利文献 9 Ewann et al.，Appl. Environ. Microbiol. 72. 3993-4000(2006)

发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题是开发使细菌的L-半胱氨酸生产能力提高的新型技术，提供L-半 胱氨酸生产菌、以及使用该细菌的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或 者它上述物质的混合物的生产方法。解决问题的方法本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过修饰细菌使得ydjN 基因编码的蛋白质的活性降低，可以提高L-半胱氨酸的生产能力；还发现通过修饰细菌使 得上述蛋白质和fliY基因编码的蛋白质的活性降低，可以进一步提高L-半胱氨酸的生产 能力，从而完成了本发明。S卩，本发明如下所述。(1) 一种属于肠杆菌科的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰从 而使得YdjN蛋白质的活性降低。(2)上述的细菌，其中，所述YdjN蛋白质为具有SEQ ID N0:2或4的氨基酸序列 的蛋白质或者该蛋白质的变体。(3)上述的细菌，其中，还经过了修饰从而使得FliY蛋白质的活性降低。(4)上述的细菌，其中，所述FliY蛋白质为具有SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列 的蛋白质或者该蛋白质的变体。(5)上述的细菌，其中，所述YdjN蛋白质或FliY蛋白质活性是是通过降低编码所 述YdjN蛋白质或FliY蛋白质的ydjN基因或fliY基因的表达量，或者破坏所述基因而降 低的。(6)上述的细菌，其中，所述ydjN基因是下述(a) (c)中的任一种DNA (a)含有SEQ ID NO :1或3的碱基序列的DNA ；(b)与SEQ ID NO :1或3的碱基序列的互补序列或能够由所述碱基序列制备的探 针在严格条件下杂交的DNA ；(c)与SEQ ID NO :1或3的碱基序列具有95%以上的同一性的DNA。(7)上述的细菌，其中，所述fliY基因是下述(d) (f)中的任一种DNA (d)含有SEQ ID NO :5或7的碱基序列的DNA ；(e)与SEQ ID NO :5或7的碱基序列的互补序列或能够由所述碱基序列制备的探 针在严格条件下杂交的DNA ；(f)与SEQ ID NO :5或7的碱基序列具有95%以上的同一性的DNA。(8)上述的细菌，其中所述细菌还具有下述性质中的至少一种i)经过修饰从而使得丝氨酸乙酰转移酶活性提高；ii)经过修饰从而使得yeaS基因的表达增强；iii)经过修饰从而使得3-磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglyceratedehydrogenase) 活性提高；
iv)经过修饰从而使得硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统(transport system)的活性 增强。(9)上述的细菌，其中，所述细菌为属于泛菌属的细菌。(10)上述的细菌，其中，所述细菌为Pantoea ananatis。(11)上述的细菌，其中，所述细菌为大肠杆菌。(12) 一种L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的 混合物的生产方法，该方法中，在培养基中培养所述细菌，并从所述培养基中收集L-半胱 氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的混合物。发明效果通过本发明可以提高属于肠杆菌科的细菌的L-半胱氨酸生产能力。此外，通过本 发明，可以更高效地生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者它们的 混合物。


图1为显示在大肠杆菌MG1655中S-硫代半胱氨酸的摄入的图。图2为显示在大肠杆菌MG1655中胱氨酸的摄入的图。图3为显示在大肠杆菌MG1655中半胱氨酸的摄入的图。图4为显示基于P. ananatis ydjN的S-硫代半胱氨酸的摄入的图。图5为显示基于大肠杆菌fliY的缺损的胱氨酸的摄入的图。图6为显示基于大肠杆菌fliY的强化的胱氨酸的摄入的图。图7为显示基于大肠杆菌fliY的缺损的半胱氨酸的摄入的图。图8为显示启动子Pnlp的序列的图。发明的
具体实施例方式<1>本发明的细菌本发明的细菌为具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰使得YdjN蛋白质活 性降低的属于肠杆菌科的细菌。本发明细菌优选的方式为，经过了修饰使得上述蛋白质以 及FliY蛋白质的活性降低的细菌。YdjN蛋白质以及FliY蛋白质是由fliY以及ydjN基因 编码的。所述蛋白质以及基因将在以下进行详述。L-半胱氨酸的生产能力是指，当在培养基中培养本发明的细菌时，在培养基中或 者菌体内生成L-半胱氨酸，并且积累达到可以从培养基中或者菌体中回收的水平的能力。 此外，具有L-半胱氨酸生产能力的细菌是指，与野生株或者亲本株相比可以生产更多L-半 胱氨酸并使其在培养基中积累的细菌，优选可以生产并在培养基中积累0. 3g/L以上，更优 选为0. 4g/L，特别优选为0. 5g/L以上的量的L-半胱氨酸的微生物。微生物生产的L-半胱氨酸在培养基中通过二硫键一部分转化为L-胱氨酸。此外， 如下述一样，有时L-半胱氨酸通过和培养基中含有的硫代硫酸反应生成S-硫代半胱氨酸 (Szczepkowski T.W.，Nature，vol. 182(1958))。进一步，细菌的细胞内生成的L-半胱氨酸 有时还和细胞中存在的酮或醛，例如与丙酮酸缩合，以硫代半酮缩醇( S ★才*々一>， hemithioketal)为中间体生成噻唑烷(千r V 'J ” >，thiazolidine)衍生物(参考日本 专利第四92010)。这些噻唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇有时作为平衡混合物存在。因此，L-半胱氨酸生产能力，不仅限于在培养基中或者菌体内积累L-半胱氨酸的能力，是指在培 养基中积累除L-半胱氨酸之外，还包括L-胱氨酸、其衍生物或前体，或者它们的混合物的 能力。作为所述L-半胱氨酸或L-胱氨酸的衍生物，可以列举出，例如S-硫代半胱氨酸、噻 唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇等。此外，作为L-半胱氨酸或L-胱氨酸的前体，可以列举出 例如作为L-半胱氨酸的前体的0-乙酰丝氨酸。L-半胱氨酸或L-胱氨酸的前体中，也可以包括前体的衍生物，可以列举出例如作 为0-乙酰丝氨酸的衍生物的N-乙酰丝氨酸。0-乙酰丝氨酸(0AQ为L-半胱氨酸生物合成的前体物质。OAS为细菌、植物的代 谢物质，通过丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的酶反应，通过L-丝氨酸的乙酰化而产生。OAS在细 胞内还可以转化为L-半胱氨酸。作为具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，可以为天然具有L-半胱氨酸生产能力的 细菌，但也可以是如下所述的细菌通过利用突变方法、重组DNA技术进行修饰而具有了 L-半胱氨酸生产能力的细菌。而且，在本发明中的L-半胱氨酸，如果没有特殊提及，是指 还原型L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述那样的衍生物、或者它们的混合物。作为在本发明中使用的细菌，只要是具有L-半胱氨酸生产能力的细菌即可，没有 特殊限制，可以是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏 菌属、沙门氏菌属、摩根氏菌属等肠杆菌科的细菌。具体地说，可以使用按照NCBI (美国国 家生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)数据库中记载 的分类属于肠杆菌禾斗的细菌(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgiyyid = 91347)。作为用于修饰的肠杆菌科的亲本株，其中优选使用埃希氏菌属细菌、肠 杆菌属细菌、泛菌属细菌、欧文氏菌属、肠杆菌属、或克雷伯氏菌属。对于埃希氏菌属细菌，没有特别限制，具体而言，可以使用Neidhardt等的著 作(Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutantderivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/SecondEdition, American Society for Microbiology Press，Washington，D. C.)列出的细菌。在这些细菌中，例 如可列举大肠杆菌。作为大肠杆菌，具体地可列举源自原型野生型K12菌株的大肠杆菌 W3110(ATCC 27325)和大肠杆菌 MG1655 (ATCC 47076)。这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive， Rockville, Maryland 20852 P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, UnitedStates of America)通过分售获得。即，对每种菌株都给予了登录号，可以使用这些号码通过分售获得 菌株(参考http://www.atcc. org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了每种菌株 的对应登录号。肠杆菌属细菌的实例可以列举出成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等、泛菌属细菌的实例可以列举出Pantoea ananatis。而且，近年来，成团肠杆菌根据其16S rRNA的碱基序列的解析，被重新分类为成 团泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在 本发明中，只要是被分类为肠杆菌科的细菌，无论是属于肠杆菌属或者泛菌属中任一属的 细菌均可。
特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为Y-变形细菌 (γ -Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(J GenAppl Microbiol 1997 Dec ;43 (6)355-361、International Journal of SystematicBacteriology, Oct. 1997，pl061-1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些 1^^ j^SS lif (Pantoeaagglomerans) 5 Pantoea dispersa ^ (International Journal of SystematicBacteriology, July 1989 ;39 (3) · p. 337-345)。 此夕卜，属 于欧文氏菌属的细菌中，有些被重新分类为菠萝泛菌(Pantoea ananas)、斯氏泛菌 (Pantoeastewartii) ( International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993 ；43(1). p. 162-173)。肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆 菌(Enterobacter aerogenes)。具体地，可以使用欧州专利申请公开952221号说明书示例 的菌株。作为肠杆菌属的代表性菌株，可以列举出成团肠杆菌ATCC12287株。作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以列举出Pantoea ananatis,斯氏泛菌 (Pantoea stewartii) 1 ^^1 lif (Pantoea citrea)。 1 Pantoea ananatis 具体地可以列举出Pantoea ananatis AJ13355株、SC17株、以及SC17 (0)株。SC17株是 以作为低PH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株从静R县磐田市的土壤中 分离出来的菌株AJ13355(FERMBP-6614)为起始，作为粘液质低生产突变株选择出来的菌 株(美国专利第6，596，517号)。SC17(0)株是为了对Pantoea ananatis进行基因破坏， 作为对λ Red基因产物具有抗性的菌株而构建的菌株(W02008/075483)。SC17株已于平 成21年2月4日(2009年)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心 (地址邮政编码305-8566日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，并给予保藏号 FERM ABP-11091 ο此外，SC17(0)株已于2005年9月21日保藏在俄罗斯国立工业微生物 保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika)地址为俄罗斯莫斯科(Russia, 117545Moscow, IDorozhny proezd. 1)，保藏号为 VKPMB-9246。Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通商产业 省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称为独立行政产业技术综合研究所专利生 物保藏中心，地址邮政编码305-8566日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏 号为FERM P-16644，并于平成11年(1999年)1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏， 并给予保藏号FERM BP-6614。而且，该菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌(EntercAacter agglomerans)，并当作成团肠杆菌AJ13355进行了保藏。但是，近年来，基于16S r RNA核苷 酸序列分析等，其被重新分类为Pantoea ananatis。作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、胡萝卜 软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举出植生克雷伯氏 菌(Klebsiella planticola)0(L-半胱氨酸生产能力的赋予或增强)下面，对于给属于肠杆菌科的细菌赋予L-半胱氨酸生产能力的方法，或增强这些 细菌的L-半胱氨酸生产能力的方法进行描述。为了给细菌赋予L-半胱氨酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变株、类似物抗性菌 株或代谢调节突变株，创建L-半胱氨酸生物合成系统酶表达增强的重组菌株等等(参见 《7 S 7酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这 里，在L-半胱氨酸生产菌的选育中，被赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等 性质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-半胱氨酸生物 合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将营养缺陷突变、类似 物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。具有L-半胱氨酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、L-半胱氨酸类似物抗性菌株 或代谢调节突变株可如下获得对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或 UV照射或用诱变剂例如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等 处理；其后，从所得的突变株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具 有L-氨基酸生产能力的菌株。通过增强L-半胱氨酸生物合成途径的酶，或，与生成L-丝氨酸等作为该途径的基 质的化合物相关的酶，例如，3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸乙酰转移酶等的活性，可以提高 细菌的L-半胱氨酸生产能力。3-磷酸甘油酸脱氢酶受到丝氨酸的反馈抑制，但通过使细菌 携带有编码该反馈抑制被降低或解除了的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基 因，可以增强该酶的活性。此外，丝氨酸乙酰转移酶受到L-半胱氨酸的反馈抑制。因此，通过使细菌携带有 编码该反馈抑制被降低或解除了的丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE基因，可以增强该酶 的活性。此外，通过增强硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性，也可以提高L-半胱氨酸 的生产能力。硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的蛋白质群由cysPTWAM基因簇编码(特开 2005-137369 号公报，EP1528108 号说明书)。此外，通过提高yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)的表达，也 可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力。yeaS基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序 列如SEQ ID NO: 15以及16所示。在细菌中，除ATG之外，还已知GTG等多种密码子可以作 为起女台密石马子使用(http //depts. Washington, edu/agro/genomes/students/stanstart. htm)。在SEQ IDNO :15以及16中，与最初的密码子gtg相当的氨基酸表记为Val，但实际 上为Met的可能性较高。具体来说，L-半胱氨酸生产菌的实例可以列举出、但不限于下述属于埃希氏菌属 的菌株，如用编码反馈抑制抗性的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多种cysE等位基因转化的大 肠杆菌JM15 (美国专利第6，218，168号)；具有编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白质的 过表达基因的大肠杆菌W3110(美国专利第5，972，663号)；半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(特开平11-155571号公报)；由cysB基因编 码的半胱氨酸调节子的正向转录调控因子活性增强的大肠杆菌W3110(W001/27307)等。在大肠杆菌中，作为具有分泌L-半胱氨酸活性的公知的蛋白质，已知有如上所述 的由ydeD编码的蛋白质(特开2002-233384)、由yfiK编码的蛋白质(特开2004-49237)、 由 emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、cusA 各基因编码的蛋白质(特开平 2005-287333)。也 可以增强所述L-半胱氨酸分泌蛋白质的活性。
下面，作为赋予L-半胱氨酸生产能力的方法，对增强L-半胱氨酸生物合成酶活性 的方法进行说明。作为L-半胱氨酸生物合成酶，可以列举出例如，丝氨酸乙酰转移酶(SAT)。在属于 肠杆菌科的细菌的细胞内增强SAT活性，可以通过增加编码SAT基因的拷贝数、或者通过修 饰编码SAT的基因的启动子等表达调节序列来实现。例如，将编码SAT的基因片段，与在属 于肠杆菌科的细菌中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体连接制作重组DNA，并将其导入到 属于肠杆菌科的宿主细菌中来进行转化即可。下面，对强化SAT基因的表达的方法进行说明。对于其他的L-半胱氨酸生物合成 系统酶基因，以及具有所述yeaS基因以及具有半胱氨酸分泌活性的蛋白质的基因，也可以 适用相同的方法。就使SAT基因的表达增强的修饰而言，例如，可以利用基因重组技术，通过提高细 胞内的SAT基因的拷贝数来进行。例如，将含有SAT基因的DNA片段，与在宿主细菌内发挥 功能的载体，优选多拷贝型载体连接从而制成重组DNA，并将其导入细菌进行转化即可。例如，大肠杆菌的SAT基因可以通过下述方法获得使用基于SEQ IDNO 9的碱基 序列制作的引物，以大肠杆菌的染色体DNA为模板，通过PCR方法获得SAT基因。其他细菌 的SAT基因也可以利用基于所述序列信息制作的探针，通过杂交方法，从细菌的染色体DNA 或染色体DNA文库中获取。提高SAT基因的拷贝数，可以通过使SAT基因在细菌的染色体DNA上多拷贝地存 在而实现。为了向细菌的染色体DNA上多拷贝地导入SAT基因，利用在染色体DNA上多拷 贝存在的序列作为靶标，通过同源重组来进行。作为在染色体DNA上多拷贝存在的序列，可 以利用重复DNA (i^petitive DNA)、存在于转座元件的端部的反向重复序列等。或者，与特 开平2-109985号公报中所公开的内容一样，可以将SAT基因搭载于转座子上并将其转移， 在染色体DNA上多拷贝地导入。另外，就SAT基因表达的增强而言，除了上述基因拷贝数的扩增之外，如在国际公 开00/18935号小册子中记载的一样，可以通过下述方法来实现将染色体DNA上或者质粒 上的SAT基因的启动子等表达调节序列替换成强启动子等表达调节序列，或者扩增使SAT 表达增强的调节子，或者缺失或者弱化使SAT的表达降低的调节子。作为强启动子，已知 的有例如Iac启动子、trp启动子、trc启动子等。此外，通过向SAT基因的启动子领域内 导入碱基取代等，还可以修饰得到更强的启动子。通过这些启动子取代或者修饰可以强 化SAT基因的表达。启动子强度的评价方法和强启动子的例子记载于Goldstein和Doi 的论文(Goldstein, Μ. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryoticpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.，1，105-128)等中。而且，对表达调节序列的修饰也可以与提高SAT 基因拷贝数的方法进行组合。此外为了提高SAT蛋白质的生成，也可以在SAT基因的翻译 起始点附近导入突变从而提高翻译效率，也可以将其与增强SAT基因的表达相组合。对于SAT基因表达的提高，以及SAT蛋白质含量增加的确认，可以按照与后述的对 目标基因转录量的降低，以及对目标蛋白质含量的降低的确认相同地，通过mRNA的定量， 以及使用抗体的蛋白质印迹(Western blot)来进行。SAT基因可以任选埃希氏菌属细菌来源的基因以及其他生物来源的基因使用。作 为编码大肠杆菌的SAT的基因，从野生株以及L-半胱氨酸分泌突变株中克隆了 cysE，从而得知其碱基序列(Denk, D. and Boeck, Α.，J. General Microbiol.，133，515-525 (1987))。 上述碱基序列以及该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :9以及10所示。使用基于 该基因序列制成的引物，以埃希氏菌属细菌的染色体DNA为模板进行PCR，可以获得SAT基 因(参考特开平11-155571号)。其他生物的编码SAT的基因也可以同样地获得。通过上 述方法得到的SAT基因，也可以像上述cysE基因那样进行表达增强。而且，当在SAT基因的表达中存在“L-半胱氨酸反馈抑制”等抑制机理时，通过修 饰表达调节序列或与抑制相关的基因从而使该抑制机制变为非敏感性的，也可以增强SAT 基因的表达。例如，通过在属于肠杆菌科的细菌中携带降低或解除了 L-半胱氨酸反馈抑制的 SAT(下面，也称为“突变型SAT”)，可以使SAT活性升高。作为突变型SAT，可以列举出具 有下述突变的SAT 用赖氨酸残基以及亮氨酸残基以外的氨基酸残基取代相当于野生型 SAT (SEQ ID NO 10)的第256位的甲硫氨酸残基的氨基酸残基的突变，或者从相当于第256 位的甲硫氨酸残基开始缺失C末端侧的区域的突变。作为所述赖氨酸残基以及亮氨酸残基 以外的氨基酸残基，可以列举出，在通常构成蛋白质的氨基酸中，除甲硫氨酸残基、赖氨酸 残基以及亮氨酸残基以外的17种氨基酸残基。可以列举出更优选为异亮氨酸残基或者谷 氨酸残基。作为向野生型SAT基因中导入所期望的突变的方法，可以列举出定点突变。作 为突变型SAT基因，已知编码大肠杆菌的突变型SAT的突变型cysE (参考WO 97/15673号 国际公开小册子、特开平11-155571号)。携带了含有编码由谷氨酸残基取代第256位的甲 硫氨酸残基的突变型SAT的突变型cysE的质粒pCEM256E的大肠杆菌JM39-8菌株(大肠 杆菌JM39-8(pCEM256E)、内部编号AJ13391)，已经于平成9年(1997年)11月20日保藏于 工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1 丁目1番地3 号)，保藏号为FERMP-16527，并于2002年7月8日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并 给予保藏号FERM BP-8112。在本发明中，“对L-半胱氨酸的反馈抑制为非敏感性”既可以指如上所述的通过 修饰而使得对L-半胱氨酸的反馈抑制变为非敏感性，也可以指原本就不受反馈抑制。已 知拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SAT为不受L-半胱氨酸反馈抑制，在本发明中优选 使用。作为含有拟南芥来源的SAT基因的质粒，已知的有pEAS-m(FEMS Microbiol. Lett.， 179(1999)453-459)。此外，通过增强编码硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统蛋白质群的cysPTWAM基因簇的 表达，也可以提高L-半胱氨酸的生产能力(特开2005-137369号公报、EP1528108号说明 书)。此外，硫化物通过分别由cysK以及cysM基因编码的0_乙酰丝氨酸(巯基)-裂 解酶-A或者B催化的反应而被导入0-乙酰基-L-丝氨酸，从而产生L-半胱氨酸。因此， 通过增强编码所述酶的基因的表达也可以提高L-半胱氨酸的生产能力。此外，通过抑制L-半胱氨酸分解系统，可以提高L-半胱氨酸的生产能力。抑 制L-半胱氨酸分解系统是指，细胞内的L-半胱氨酸的分解活性与野生株或者亲本 株等非修饰株相比有降低。作为承担L-半胱氨酸分解系统的蛋白质，已知的有胱硫 醚- β -裂解酶(metC 产物、特开平 11-155571 号，Chandraet. al.，Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 产物、特开 2003-169668，(Austin Newton et. al.，J.Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218) )、0-乙酰丝氨酸巯基水解酶B (cysM基因产物、特开 2005-245311)、以及malY基因产物(特开2005-245311)。通过使所述蛋白质的活性降低， 从而提高L-半胱氨酸的生产能力。使蛋白质活性降低的修饰，可以像后述的针对fliY或ydjN基因所记载的方法一 样来进行。大肠杆菌的cysM基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序列，分别如SEQ ID NO 25以及26所示。(YdjN蛋白质以及FliY蛋白质活性的降低)本发明的细菌，如上所述为具有L-半胱氨酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其 可以这样获得通过修饰从而使YdjN蛋白质、或YdjN蛋白质以及FliY蛋白质的活性降低。 而且，也可以是在进行了修饰使得YdjN蛋白质、或YdjN蛋白质以及FliY蛋白质的活性降 低之后，再赋予其L-半胱氨酸的生产能力。YdjN蛋白质以及FliY蛋白质分别为由yjdN基 因以及fliY基因编码的蛋白质。为了使YdjN蛋白质以及FliY蛋白质的活性降低，可以通 过如下方法实现，例如，修饰具有fliY基因以及ydjN基因的细菌，从而使所述基因编码的 FliY以及YdjN的活性降低。而且，在为了提高L-半胱氨酸生产能力而使活性降低时，可以 是使FliY或YdjN中的任一方活性降低，但优选使YdjN的活性降低，更为优选使两方活性 均降低。在本发明中，对活性的“降低，，没有特殊限制，其包含修饰株的活性比野生株或者 非修饰株低，以及活性完全消失这两个方面。本发明者从Pantoea ananatis的染色体DNA中，发现了编码其缺损可以使L-半 胱氨酸生产能力提高的蛋白质的新基因，由于它们分别显示了和大肠杆菌的fliY、ydjN的 较高的同源性(分别是78%、80% )，因此将它们分别命名为fliY和ydjN。而且，在本说明 书中，“同源性(homoloyg)”有些情况下是指“同一性(identity)”。在本发明中，有时将大肠杆菌的fliY、ydjN基因和Pantoea ananatis的fliY、 ydjN基因，以及其他细菌携带的所述基因的同源基因分别命名为fliY、ydjN基因。作为fliY基因的具体实例，可以列举出含有SEQ ID NO :5、7所示的碱基序列的基 因。此外，作为ydjN基因的具体实例，可以列举出含有SEQ IDNO :1、3所示的碱基序列的基 因。SEQ ID NO :5表示的是大肠杆菌MG1655菌株的fliY基因，SEQ IDNO :6表示的是 该基因编码的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO :7表示的是Pantoea ananatisSC17菌株的 fliY基因，SEQ ID NO :8表示的是该基因编码的氨基酸序列。SEQ ID NO :1表示的是大肠杆菌MG1655菌株的ydjN基因的碱基序列，SEQ ID NO: 2表示的是该基因编码的氨基酸序。此外，SEQ ID NO :3表示的是Pantoea ananatis SC17 菌株的ydjN基因的碱基序列，SEQ ID NO :4表示的是该基因编码的氨基酸序列。FliY蛋白质以及YdjN蛋白质并不仅限于具有上述氨基酸序列的蛋白质以及它们 的同源物，也可以是它们的变体(variant)。fliY或ydjN基因也可以是编码FliY蛋白质 或YdjN蛋白质的变体的基因。FliY蛋白质以及YdjN蛋白质的变体是指具有在SEQ ID N0 2、4、6或8的氨基酸序列中，在1个或者数个位置上具有1个或数个氨基酸取代、缺失、插入 或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，且其具有FliY蛋白质或YdjN蛋白质的功能的蛋白质。而且上述“1个或数个”根据氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置或者氨 基酸残基的种类有所不同，但具体来说优选为1 20个、更优选为1 10个，更为优选为 1 5个。ydjN基因缺损株如后述实施例所示，其S-硫代半胱氨酸以及L-胱氨酸的摄入降 低。因此，推测YdjN蛋白质具有与S-硫代半胱氨酸以及L-胱氨酸的摄入有关的功能。另一方面，尽管有文献指出FliY可能与L-胱氨酸的摄入相关(Butler etal., Life Sci. 52. 1209-1215(1993)，Hosie et al. , Res. Microbiol. 152. 259-270 (2001)),{0 如实施例所示的一样，无论其与L-胱氨酸的摄入相关，或不相关，均可以推测与YdjN相比 其活性较低。总之，使ydjN基因和fliY基因两方均缺损，与使各个基因单独缺损的情况相 比，显著地提高了 L-半胱氨酸的生产能力。因此，虽然FliY的功能仍不明确，但其具有下 述特征使其缺损时，能够提高L-半胱氨酸的生产能力。上述的1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或者添加为可以正常维持蛋白质的 功能的保守突变。保守突变的代表为保守取代。保守取代是指，当取代部位为芳香族氨基 酸时，在Wie、Trp、Tyr之间相互取代；当取代部位为疏水性氨基酸时，在Leu、lie、Val间 之间相互取代；当为极性氨基酸时，在Gin、Asn之间相互取代；当为碱性氨基酸时，在Lys、 Arg, His之间相互取代；当为酸性氨基酸时，在Asp、Glu之间相互取代；当为具有羟基的 氨基酸时，为在义！·、!!!!·之间相互取代的突变。可视为保守取代的取代具体的可以列举出， 用 Ser 或 Thr 取代 Ala、用 GlruHis 或 Lys 取代 Arg、用 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 取代 Asn、 用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp、用 Ser 或 Ala 取代 Cys、用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gin、用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu、用 Pro 取代 Gly、用 Asn、Lys、Gln、Arg 或 Tyr 取 代 His、用 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代 lie、用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu、用 Asn、Glu、 GlruHis 或 Arg 取代 Lys、用 lie、Leu、Val 或 Wie 取代 Met、用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取 代Wie、用Thr或Ala取代kr、用Ser或Ala的取代Hir、用Phe或Tyr的取代 ρ、用His、 Phe或Trp取代Tyr、以及用Met、Ile或Leu的取代Val。此外，就上述这样的氨基酸的取 代、缺失、插入、添加或者倒位等而言，还包括因基因来源的细菌的个体差异、种间差异等情 况而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或者倒位。此外，也可以为编码下述蛋白质的基因，该蛋白质与具有上述这样的保守突变的 基因编码的氨基酸序列全体相比，具有80%以上的同源性，优选具有90%以上、更优选具 有95%以上、更为优选具有97%以上、特别优选具有99%以上的同源性。编码这样的与 FliY、YdjN具有同源性的蛋白质的基因，可以以上述大肠杆菌株野生型fliY、ydjN基因作 为提问序列，使用BLAST检索或FASTA检索，从公开的数据库中容易地获取其序列信息，并 通过使用基于该公知的基因序列作成的寡核苷酸作为引物来获得。此外，只要是fliY、YdjN基因编码的蛋白质的功能没有损坏即可，还可以是与上 述碱基序列的互补序列、或者能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交的基因。在 本发明中，严格的条件下是指，例如在60°C，1XSSC，0. 1% SDS优选0. 1XSSC，0. 1% SDS相 当的盐浓度下，洗涤1次优选2 3次。上述杂交用探针也可以为基因的互补序列的一部分。这样的探针，可以以基于公 知的基因序列制得的寡核苷酸为引物，以包含这样的碱基序列的DNA片段为模板，通过PCR 反应来制备。例如，当作为探针使用300bp左右长度的DNA片段时，上述杂交的洗涤条件可以列举出为 50°C、2XSSC、0. 1% SDS0下面，针对使FliY或YdjN蛋白质活性降低的方法进行说明。承担所述L-半胱氨 酸分解系统的蛋白质等，也可以通过同样的方法使其活性降低。以下，将使其活性降低的对 象蛋白质记为“目标蛋白质”，编码目标蛋白质的基因记为“目标基因”。使目标蛋白质的活性降低的修饰例如可以通过降低目标基因的表达来实现。具体 来说例如，通过使染色体上的目标基因的编码区域的一部分或全部缺损，可以降低所述蛋 白质的细胞内的活性。此外，通过修饰目标基因的启动子或shine-dalgarno(SD)序列等表 达调节序列等，也可以降低目标蛋白质的活性。此外，对表达调节序列以外的非翻译区的 修饰也可以降低基因的表达量。而且，还可以缺失包括染色体上的基因的前后序列的整个 基因全体。此外，所述修饰还可以这样完成向染色体上的目标基因的编码区域导入氨基 酸取代(错意突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一 二个碱 基的移码突变(Journal of Biological Chemistry272 :8611-8617 (1997) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 955511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991))。此外，强化负向调节目标蛋白质的调节子的活性，或 者抑制正向调节调节子的活性也可以使目标蛋白质的活性降低。添加负向调节目标蛋白质 的活性或表达的物质、除去正向调节物质也可以使目标蛋白质的活性降低。此外，只要是可以使目的蛋白质的活性降低的修饰即可，也可以是通过X射线或 紫外线照射、或者利用N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理而引 起的修饰。就表达调节序列的修饰而言，优选为1个碱基以上，更优选为2个碱基以上，特别 优选为3个碱基以上。此外，在缺失编码区域时，只要目标蛋白质的功能降低即可，缺失的 区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域，也可以是整个编码区域。通 常，缺失的区域较长能够切实地使基因失活。此外，优选的是缺失区域的上游或下游的读码 框不一致。在目标基因的编码区域中插入其他序列时，可以为基因的任何区域，但插入的序 列较长时能够切实地使基因失活。插入部位的前后序列优选读码框不一致。对于其他序列 没有特殊限制，只要是能够降低编码的目的蛋白质的功能即可，可以列举例如携带抗生素 抗性基因或对L-半胱氨酸生产有用的基因的转座子等。为了如上所述地修饰染色体上的目标基因，可以通过下述方法实现例如，缺 失基因的部分序列，制作经过了修饰使得不产生发挥正常功能的目标蛋白质的缺失型基 因，用含有该基因的DNA转化细菌，通过引起缺失型基因和染色体上的基因进行同源重 组，将染色体上的基因取代为缺失型基因。即使产生由缺失型基因编码的目标蛋白质，其 也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，降低了其功能。已经明确了利用这样的同源重 组通过基因取代破坏基因的被称为“Red驱动整合(Red-driven integration)"的方法 (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645 (2000))、组合 使用Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，Ε. H.，Gumport, R. I.，Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184 :5200-5203(2002))的方法(参照 W02005/010175 号)等使用线性 DNA的方法，或者使用含有温度敏感性复制起点的质粒、可接合转移的质粒的方法，利用在 宿主内不含复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号，或特开平05-007491号)。对于目的基因的转录量的降低而言，可以通过将由该基因转录的mRNA的量与野 生株或者非修饰株相比较来进行确认。作为评价mRNA的量的方法，可以列举出Northern 杂交、RT-PCR 等(Sambrook, J. , et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring HarborLaboratory Press, Cold spring Harbor(USA),2001)。使用抗体的蛋白质印迹(Western blot)可以对目标蛋白质的量的降低进行确认 (Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, ColdspringHarbor(USA), 2001))。另外，目标蛋白质为YdjN蛋白质时，对于该蛋白质的量的降低的确认，可以通过 测定细胞的S-硫代半胱氨酸或L-胱氨酸摄入活性来进行。就蛋白质是否具有上述化合物的摄入活性而言，可以通过下述方法确认制作使 野生株或者亲本株中编码该蛋白质的基因的表达增强的细菌，在培养基中培养该细菌，并 对培养基中蓄积的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、其衍生物或者前体、或者它们的混合物的量进 行定量。或者，从野生株或亲本株出发制作使编码该蛋白质的基因的表达降低或缺损的细 菌，在含有S-硫代半胱氨酸或L-胱氨酸的培养基中培养该细菌时，通过培养基中添加的 这些化合物的减少量的变少来进行确认。具体实例如实施例所示。当使用大肠杆菌的f IiY或ydjN基因作为f IiY或ydjN基因时，使用基于SEQ ID NO :5或1的碱基序列制作的引物，以大肠杆菌的染色体DNA为模板，通过PCR方法可以获 得fliY或ydjN基因。同样地，Pantoea ananatis的fliY或ydjN基因可以使用基于SEQ ID NO :7或3的碱基序列制作的引物，以Pantoea ananatis的染色体DNA为模板，通过PCR 方法来获得。其他细菌的fliY或ydjN基因也可以使用基于上述序列信息制作的探针或引 物，通过杂交方法或PCR方法，从细菌的染色体DNA或染色体DNA文库中获得。另一方面，为了确认FliY或YdjN蛋白质是否具有摄入S-硫代半胱氨酸、L-胱氨 酸、或L-半胱氨酸的活性，在必须提高fliY或ydjN基因的表达量的情况下，只要将所述基 因多拷贝地导入细菌中即可。向细菌中多拷贝地导入fliY、ydjN基因时，可以适用像针对 于SAT基因所记载的方法一样的使用多拷贝型载体的方法，或通过同源重组向染色体DNA 上多拷贝地导入的方法等。〈本发明的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或它们的混合物 的生产方法>在培养基中培养如上所述获得的本发明的细菌，通过从培养基中采集L-半胱氨 酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或它们的混合物，可以生产所述化合物。作为 L-半胱氨酸的衍生物，如上述的一样，可以列举出S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍生物、与该噻 唑烷衍生物相当的硫代半酮缩醇等。作为使用的培养基，可以列举出含有碳源、氮源、硫源、无机离子以及需要的其他 有机成分的通常的培养基。作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉水解物等糖类、富马酸、柠檬 酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐、大豆水解物等有机氮、氨 气、氨水等。
作为硫源，可以列举出硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、连二亚硫酸盐(hyposulfite)、 硫代硫酸盐等无机硫化物。作为有机微量营养源，优选适量含有维生素Bl等必需物质或者酵母提取物等。除 此之外，根据需要可以少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。培养在需氧的条件下进行30 90小时较好，培养温度为25°C 37°C，且优选将 培养中的PH控制在5 8的范围内。此外，可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质， 以及氨气等来调节PH值。就从培养物中采集L-半胱氨酸而言，可以通过组合通常的离子 交换树脂法、沉淀法及其他公知的方法来实施。通过上述方法得到的L-半胱氨酸，可以用来生产L-半胱氨酸的衍生物。作为L-半 胱氨酸的衍生物包含甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸(carbocysteine)^^ 代半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等。此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中积累时，从培养基中采集噻唑烷 衍生物，使得噻唑烷衍生物和L-半胱氨酸之间的反应平衡向L-半胱氨酸一侧移动，从而可 以生产L-半胱氨酸。此外，当S-硫代半胱氨酸在培养基中积累时，例如可以使用二硫苏糖 醇等还原剂通过进行还原转化得到L-半胱氨酸。本发明中采集出的L-半胱氨酸或其衍生物除了含有作为目标的化合物之外，还 可以含有微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物等。采集的目的化合物的 纯度为50%以上，优选为85%以上，特别优选为95%以上。
实施例以下，通过实施例针对本发明的进行更具体的说明。在下面所述的内容中，半胱氨酸以及胱氨酸为L-型。(实施例1)鉴定具有半胱氨酸或胱氨酸摄入活性的蛋白质(1)获得不能利用S-硫代半胱氨酸作为单一半胱氨酸源的突变株(1-1)由 大肠杆菌MG1655株(ATCC No. 47076)获得cysE基因缺损株cysE基因的缺损通过 Datsenko和Wanner等人开发的被称为“Red驱动整合”的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12，p6640_6645)和 λ 噬菌体来源的切出系统(J. Bacteriol. 2000 184. 5200-5203(2002))来进行。通过Red驱动整合，使用合成寡核苷酸作为引物得到PCR 产物，使用该PCR产物能够一步式地构建基因破坏菌株，所述合成寡核苷酸的5'侧设计 有目的基因的一部分，3'侧设计有抗生物素抗性基因的一部分。另外通过组合λ噬菌体 来源的切出系统，可以除去在基因破坏菌株中导入的抗生物素抗性基因。通过这样的Red 驱动整合和λ噬菌体来源的切出系统使大肠杆菌基因缺损的方法在特开2005-058227Α和 W02007/119880A1等中有详细描述。使用与这样的方法相同的方法，也可以获得cysE基因 的缺损株。通过PCR方法获得了在cysE基因的两端的同源序列中插入了抗生物素抗性 基因(卡那霉素抗性基因(Knf))的DNA片段。除了使用DcysE (Ec) -F (ccggcccgcg cagaacgggc cggtcattat ctcatcgtgt ggagtaagcatgaagcctgc ttttttatac taagttggca SEQ ID NO 50)、DcysE (Ec)-R(actgtaggccggatagatga ttacatcgca tccggcacga tcacaggaca cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga :SEQ ID NO :51)作为弓| 物，使用P^l 18-(λ BttL-Kmr- λ attR) (W02006/093322A2)作为模板以外，具体的实验方法和实 验材料，全部按照在特开2005-058227A1中记载的方法进行。将获得的缺损株命名为 MG1655AcysE。(1-2)由MG1655 Δ cysE菌株制作转座子突变株的文库使用EZ-Tn5<KAN-2>Tnp Transposome 试剂盒(EPICENTRE 公司)，由 MG1655 Δ cysE 菌株制得将Tn5随机插入的突变株的文库。根据试剂盒产品中附带的说明书实施具体的实 验方法。(1-3)从突变株文库中筛选不能以S-硫代半胱氨酸作为单一半胱氨酸源加以利 用的突变株利用上述文库，对不能以S-硫代半胱氨酸作为单一半胱氨酸源加以利用的突变 株进行筛选。在此“半胱氨酸源”是指被摄入到细胞内并用于生成半胱氨酸的基质。在细 胞内不能合成半胱氨酸时，半胱氨酸本身也属于半胱氨酸源。在含有20 μ M半胱氨酸的Μ9 琼月旨培养基(Sambrook and Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Third Edition)，Cold Spring HarborLaboratory Press)禾Π 含有 20 μ M S-硫代半胱氨酸 (cat#C2196, SIGMA)的M9琼脂培养基上分别用牙签接种突变株，筛选出在含有半胱氨酸的 培养基上可以生长繁育但在含有S-硫代半胱氨酸的培养基上不能生长繁育的突变株。从 约1000个菌株中，获得了 1株突变株。对插入的Tn5的基因组区域进行鉴定，结果可知在 ydjN基因中插入了 Tn5。(1-4) ydjN基因缺损株的S-硫代半胱氨酸同化能力的解析为了确认插入Tn5的突变株的表型是否是因为ydjN基因的功能缺损，利用上 述的Red驱动整合由MG1655 Δ cysE菌株构建了 ydjN基因的缺损株。此时使用引物 DydjN(Ec)-F(cactatgact gctacgcagt gatagaaata ataagatcaggagaacgggg tgaagcctgc ttttttatac taagttggca :SEQ ID NO :52)、DydjN(Ec)-R(aaagtaaggc aacggcccct atacaaaacg gaccgttgcc agcataagaacgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga :SEQ ID NO 53)。将构建的缺损株命名为MG1655 AcysE Δ ydjN :: Km菌株，利用同样的方法由MG1655 获得了 MG1655 Δ ydjN Km 菌株。在含有50 μ M半胱氨酸、50 μ M胱氨酸或50 μ M S_硫代半胱氨酸的Μ9琼脂培养基 (但是，在此使用等浓度MgCl2代替培养基成分中的MgSO4)上的生长繁育如表1所示。[表1]
权利要求
1.一种属于肠杆菌科的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰从而使得 YdjN蛋白质的活性降低。
2.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述YdjN蛋白质为具有SEQIDNO :2或4的氨 基酸序列的蛋白质或其变体。
3.根据权利要求1或2所述的细菌，其还经过了修饰从而使得FliY蛋白质的活性降低。
4.根据权利要求3所述的细菌，其中，所述FliY蛋白质为具有SEQIDNO :6或8的氨 基酸序列的蛋白质或其变体。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的细菌，其中，所述YdjN蛋白质或FliY蛋白质的 活性是通过降低编码YdjN蛋白质或FliY蛋白质的ydjN基因或fliY基因的表达量，或者 破坏所述基因而降低的。
6.根据权利要求5所述的细菌，其中，所述ydjN基因是下述(a) (c)中的任一种DNA (a)含有SEQID NO :1或3的碱基序列的DNA，(b)与SEQID NO :1或3的碱基序列的互补序列或能够由所述碱基序列制备的探针在 严格条件下杂交的DNA，(c)与SEQID NO :1或3的碱基序列具有95%以上的同一性的DNA。
7.根据权利要求5或6所述的细菌，其中，所述fliY基因是下述(d) (f)中的任一 种 DNA (d)含有SEQID NO :5或7的碱基序列的DNA，(e)与SEQID NO :5或7的碱基序列的互补序列或能够由所述碱基序列制备的探针在 严格条件下杂交的DNA，(f)与SEQID NO :5或7的碱基序列具有95%以上的同一性的DNA。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的细菌，其中，所述细菌还具有下述性质中的至少 一种i)经过修饰从而使得丝氨酸乙酰转移酶活性提高， )经过修饰从而使得yeaS基因的表达提高，iii)经过修饰从而使得3-磷酸甘油酸脱氢酶活性提高，iv)经过修饰从而使得硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性增强。
9.根据权利要求1 8中任一项所述的细菌，其中，所述细菌为属于泛菌属的细菌。
10.根据权利要求9所述的细菌，其中，所述细菌为Pantoeaananatis。
11.根据权利要求1 8中任一项所述的细菌，其中，所述细菌为大肠杆菌。
12.—种L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的混合物 的生产方法，该方法中，在培养基中培养根据权利要求1 11中任一项所述的细菌，并从所 述培养基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的混 合物。
全文摘要
本发明提供一种新的L-半胱氨酸生产方法，所述方法在L-半胱氨酸生产菌的选育中使用了在肠杆菌科细菌中承担L-半胱氨酸摄入活性的基因。本发明还提供一种属于肠杆菌科的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰从而使得YdjN蛋白质、或者YdjN蛋白质和FliY蛋白质的活性降低，并通过在培养基中培养所述细菌，从该培养基中收集L-胱氨酸、其衍生物或前体、或者它们的混合物来制造这些化合物。
文档编号C12P13/12GK102080062SQ20101013655
公开日2011年6月1日 申请日期2010年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者野中源 申请人:味之素株式会社