专利名称：：昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
。具体涉及昆虫几丁质酶基因序列及其dsRNA的应用。
背景技术：
：农业害虫为害是我国农业产量的主要制约因素，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题1)昆虫出现抗药性，用药剂量加大，防治成本提高；2)农药残留导致环境污染严重；3)对非靶标生物有较大的影响。现有的生物杀虫剂在害虫防治中应用也较广，但杀虫时间较长，效果缓慢。RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类的疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2007年的“NatureBiotechnology”杂志先后两篇论文报道了施用表达靶向害虫重要致死基因V-ATPaseA,CYP6AE14andGST1的dsRNA转基因植物作为一种控制病虫害的新方法(Baumetal，2007；Maoetal，2007)。2008年，PriceandGatehouse提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2)抗虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。
发明内容本发明的目的提供一种昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的在致死害虫中的应用。本发明提供的一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:1，是通过对东亚飞蝗EST数据库的搜索，鉴别出7条东亚飞蝗几丁质酶基因片段，检测了这7个几丁质酶基因在东亚飞蝗不同组织部位的表达，筛选出在组织表皮特异表达的与东亚飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因LmCHTIO，通过RACE-PCR扩增并进一步克隆获得958bp的东亚飞蝗几丁质酶基因。本发明提供的一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:2，是根据SEQIDNO:1设计上游引物SEQIDNO:4和下游引物SEQIDNO:5，通过PCR扩增获得SEQIDNO:2，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。本发明提供的一种合成dsRNA的昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO3，是根据SEQIDNO1设计上游引物SEQIDNO6和下游引物SEQIDNO:7，通过PCR扩增获得SEQIDN0:3，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。SEQIDNO:2和SEQIDNO:3合成的dsRNA的在致死害虫中的应用注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明SEQIDNO2和SEQIDNO3合成的dsRNA均可以特异性地沉默几丁质酶基因LmCHTIO的mRNA表达，并导致蝗虫蜕皮困难而死亡。图1东亚飞蝗注射SEQIDNO2或SEQIDNO3合成的dsRNA后出现蜕皮困难3而死亡的表型。A:2龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQIDNO:2合成的dsRNA)；B2龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQIDNO3合成的dsRNA)；C5龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQIDNO3合成的dsRNA)。图2东亚飞蝗注射SEQIDNO2或SEQIDNO3合成的dsRNA后几丁质酶基因LmCHTIO的mRNA表达，3-actin做为内参基因。A2龄东亚飞蝗(1为注射dsGFP的对照，2为注射SEQIDNO2合成的dsRNA)；B2龄东亚飞蝗(3为注射dsGFP的对照，4为注射SEQIDNO:3合成的dsRNA)；C:5龄东亚飞蝗(5为注射dsGFP的对照，6为注射SEQIDNO:3合成的dsRNA)。图3中华稻蝗注射SEQIDNO3合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQIDNO3合成的dsRNA的中华稻蝗。具体实施例方式实施例1东亚飞蝗几丁质酶基因片段及其dsRNA的获得1、东亚飞蝗几丁质酶基因片段的获得1)东亚飞蝗几丁质酶基因在东亚飞蝗表达序列标签EST数据库的搜索基于东亚飞蝗的表达序列标签(EST)数据库，采用生物信息学方法对东亚飞蝗几丁质酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得7条几丁质酶基因片段。2)东亚飞蝗几丁质酶基因RACE引物的设计基于已获得几丁质酶基因片段的碱基序列，采用primerpremierf.0软件设计。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。3)东亚飞蝗总RNA获得选取大小一致雌雄各半东亚飞蝗5龄若虫，四头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TaKaRaTrizol试剂盒。4)RACEcDNA合成RACEcDNA合成步骤参照SMARTRACEcDNAAmplification试剂盒。5)东亚飞蝗几丁质酶基因片段的获得根据Advantage2Polymerase说明书进行3，和5，RACE末端快速扩增，进一步克隆获得的东亚飞蝗几丁质酶基因序列。6)东亚飞蝗几丁质酶基因片段碱基序列的分析利用Expasy网站中相关在线软件和GENED0C、基因探索者等软件分析所得序列，之后在NCBI网站中使用BLAST功能进行序列同源性比对。2、东亚飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因的筛选1)东亚飞蝗几丁质酶基因表达引物的设计基于7条几丁质酶基因片段的碱基序列，采用primerpremier5.0软件设计。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。2)东亚飞蝗不同组织部位总RNA的提取及纯化选取活力旺盛的5龄东亚飞蝗，6头虫子(雌雄各半)一个生物学重复，共3个生物学重复。解剖其11个组织部位前肠、中肠、后肠、胃盲囊、脂肪体、马氏管、表皮、气管、肌肉、精巢和卵巢。将解剖好的3个生物学重复置于液氮中冻存。各个组织部位总RNA的提取及纯化方法具体操作步骤参照TaKaRaTrizol试剂盒和RNA纯化说明书3)第一链cDNA的合成参照M-MLV反转录TaKaRa试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。4)RT-PCR法检测7个几丁质酶基因在11个组织部位的表达7个几丁质酶基因在不同组织部位的表达采用常规RT-PCR检测，在凝胶成像仪上采集图像并分析。5)东亚飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因的筛选选取在表皮中高表达东亚飞蝗几丁质酶基因LmCHTl开展进一步的研究。3、东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA合成1)东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA引物的设计基于本研究所得到东亚飞蝗几丁质酶基因的序列SEQIDNO:1，采用primerpremier5.0软件设计。共设计2对dsRNA引物，其序列分别为SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。2)东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA的合成用上述2对dsRNA引物合成PCR产物，经WizardSVGelandPCRClean-UpSystem(Promega)试剂盒纯化后按照T7RiboMAXExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA。dsRNA浓度采用酶标仪SpectraMax190测定，并浓缩至终浓度为3μg/μ1ο实施例2几丁质酶基因dsRNA致死东亚飞蝗1、东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA注射将2μ1(约6μg)SEQIDNO:2或SEQIDNO3的dsRNA用25μ1规格微量注射器注射到东亚飞蝗任一龄若虫二、三腹节之间，共注射3组生物学重复，每组10只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后东亚飞蝗置于28°C恒温生化培养箱中饲养。2、注入dsRNA后东亚飞蝗表型的观察注射dsRNA东亚飞蝗实验组与对照组在取食量、体型变化及体重增长并无显著差异。在蜕皮过程中，对照组飞蝗顺利蜕皮，从脊线开裂至身体完全蜕出只需短短几分钟；而dsRNA注射组飞蝗，脊线可以开裂，但头部及腹部新皮与旧皮无法分离，导致飞蝗无法移动，保持同一状态长达数小时甚至两天，直至死亡。表型见附图1。死亡率统计见下表表1:5龄东亚飞蝗注射SEQIDNO3的dsRNA及dsGFP的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>Ia^注射虫数(只)ι死亡虫数(只)ι死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>N5-1、N5-2、N5-3为注射SEQIDNO3的dsRNA实验组；N5dsGFP_l、N5dsGFP_2、N5dsGFP-3为注射dsGFP的对照组。3、东亚飞蝗几丁质酶基因沉默检测即将蜕皮死亡的东亚飞蝗置于液氮中冻存，每组收虫4只，雌雄各半，采用Trizol法提取总RNA并纯化，采用MLV反转录酶获得cDNA。对照组东亚飞蝗蜕皮时收虫，提取总RNA并纯化，采用MLV反转录酶获得cDNA，作为对照。东亚飞蝗几丁质酶基因经RNA干扰后其基因表达情况，采用常规RT-PCR检测，在凝胶成像仪上采集图像并分析。附图2为检测结果。实施例3几丁质酶基因dsRNA致死中华稻蝗1、中华稻幢SEQIDNO3的dsRNA注射将2μ1(约6μg)SEQIDNO3的dsRNA用25μ1规格微量注射器注射到中华稻蝗任一龄若虫二、三腹节之间，共注射2组生物学重复，每组10只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后中华稻蝗置于28°C恒温生化培养箱中饲养。2、注入dsRNA后，中华稻蝗的观察注射dsRNA组中华稻蝗在龄期中间与对照组在取食量、体型变化及体重增长并无显著差异。在蜕皮过程中，对照组稻蝗顺利蜕皮，从脊线开裂至身体完全蜕出只需短短几分钟；而dsRNA组稻蝗，脊线可以开裂，腹部可以抽出，但头部新皮与旧皮无法分离，稻蝗无法行动，保持同一状态长达数小时甚至一天，直至死亡。表型见附图3。权利要求一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO1。2.一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:2。3.如权利要求2所述的昆虫几丁质酶基因，含有T7启动子。4.如权利要求2所述的昆虫几丁质酶基因，其引物是上游引物SEQIDN0:4，下游引物SEQIDNO:5ο5.一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:3。6.如权利要求5所述的昆虫几丁质酶基因，含有Τ7启动子。7.如权利要求5所述的昆虫几丁质酶基因，其引物是上游引物SEQIDΝ0:6，下游引物SEQIDNO:7ο8.如权利要求2或5所述的昆虫几丁质酶基因合成的dsRNA。9.如权利要求8所述的dsRNA在致死害虫中的应用。全文摘要本发明提供几丁质酶基因序列及其dsRNA的应用，可沉默特定的几丁质酶基因使昆虫发育受阻死亡。通过对多个东亚飞蝗几丁质酶基因克隆、测序及表达分析，得到序列为SEQIDNO1的几丁质酶基因，从中选出序列为SEQIDNO2和SEQIDNO3的几丁质酶基因，用于dsRNA的合成。将dsRNA注入昆虫的体腔后，昆虫在发育过程中表现为蜕皮困难而死亡。本发明为害虫实现基于RNA干扰的有效防治提供依据，为安全无公害的害虫防治方法研制提供新的途径。文档编号C12N15/56GK101805746SQ201010136330公开日2010年8月18日申请日期2010年3月26日优先权日2010年3月26日发明者张建珍,张建琴,李大琪,杨美玲,郭亚平,马恩波申请人:山西大学