昆虫几丁质去乙酰基酶基因1及其在害虫防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及飞幢几了质去己酷基酶基因l(CDAl)及在害 虫防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 飞幢是我国重要农业害虫，其大规模迁飞对农业生产造成严重危害。目前对其防 治主要依靠化学防治。长期施用化学杀虫剂导致一系列问题，如环境污染，抗药性产生和对 非祀标生物的危害。因此开发新型、可替代化学防治的方法变得尤为紧迫。
[0003] RNA干扰（RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自 2006年获得诺贝尔奖W来，RNAi技术一直是生命科学的研究热点。RNAi不仅是研究基因 功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNA干扰进行害虫防治具有 如下优点；1)杀虫专一性，对非祀标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解，无残留；3) 对环境无毒无害，相对安全。因此学者将其称为第四代杀虫剂。基于RNA干扰进行害虫防 治的前提是筛选祀标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。
[0004] 昆虫表皮可W防止其体内水分散失和免受病原体侵染，几了质是昆虫表皮的重要 组成成分，几了质致密排列对于昆虫生长发育必不可少。几了质去己酷基酶基因l(CDAl) 负责将几了质N-己酷基葡糖胺的己酷胺基水解，形成脱己酷几了质（或称聚葡萄糖胺，壳 聚糖），从而改变其物理性质，使表皮蛋白等其它组分更容易与几了质结合，从而形成致密 的表皮结构。沉默该祀标基因后昆虫出现晚皮受阻而致死的现象。由于人和其他高等动物 并没有几了质，因此，本发明采用RNA干扰技术，针对几了质代谢系统筛选几了质去己酷基 酶基因1的dsRNA分子祀标相对安全，在飞幢防治中具有重要作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种昆虫几了质去己酷基酶基因1全长序列及其dsRNA， W及它们的合成方法和在害虫防治中的应用。
[0006] 本发明提供一种飞幢几了质去己酷基酶基因1全长序列，其核巧酸序列为SEQ ID NO ;1。该基因全长序列是基于飞幢转录组数据库，捜索获得的片段通过GeneDoc软 件对其进行拼接，设计上游引物CAACGTCACAACCAGTGAGTGTC (SEQ ID NO ; 3)和下游引物 GCGGTACACGATGAAAGATGG(SEQ ID N0;4)，通过 PCR 扩增获得。该核巧酸长度为 1753bp，其 核巧酸序列为SEQ ID NO ;1。
[0007] 本发明提供一种飞幢几了质去己酷基酶基因1编码的氨基酸序列，其特征是核巧 酸序列为SEQ ID NO ;2的序列。该氨基酸序列是对SEQ ID NO; 1进行生物信息学分析后预 测得到。生物信息学分析表明CDA1基因的编码535个氨基酸，分子量为6化D，理论等电点 为 5. 11。
[000引本发明提供飞幢几了质去己酷基酶基因1合成的dsRNA及其在害虫防治中的应 用；基于飞幢几了质去己酷基酶基因1序列，通过primer premiers. 0软件设计含有T7启 动子的上游引物*33130肖3別03別313肖肖肖1'口'6144〔66〔64644664(：669 10側；5)和下游引物 taatacgactcac化tagggCCATCATGGTGAACTGGTTG(SEQ ID NO ;6)，通过PCR扩增获得一段长度 为586bp的两端均为T7启动子的DM片段（SEQ ID NO ;7)。试剂盒纯化后按照T7化boMAX? Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成的dsRNA。通过微量进样器将合 成的dsRNA注射进入飞幢体腔内。结果表明；注射dsRNA后飞幢几了质去己酷基酶基因1 的mRNA表达显著降低，飞幢出现晚皮困难并导致死亡。
[0009] 本发明的有益效果；飞幢五龄若虫注射dsRNA后，若虫在第7天出现晚皮现象，但 只有翅芽张开、背部弓起，旧表皮难W脱去直到死亡，死亡率达到94. 7% W上。本发明飞幢 几了质去己酷基酶基因1合成的dsRNA对飞幢具有高的致死率，对于害虫防治具有重要的 现实意义，可W为害虫防治提供新的途径。
【附图说明】
[0010] 图1 ;琼脂糖凝胶检测几了质去己酷基基因1全长cDNA序列长度（M为化5000DNA Marker,条带从小到大依次为 100、250、500、750、1000、1500,2000、3000、5000bp，1 为几了 质去己酷基基因1条带大小）
[0011] 图2 ;dsRNA注射2化后对几了质去己酷基酶基因1的转录影响（1为注射dsGFP 的对照组，2为注射dsRNA的实验组）。0 -actin为内参基因。其中冲<0. 05, *冲<0. 01。 [001引 图3 ;dsRNA对5龄飞幢若虫生长发育的影响（1为注射dsGFP的对照组，2和3均 为注射dsRNA的实验组）。实验组飞幢出现晚皮困难死亡的表型。
【具体实施方式】
[001引实施例1 ;飞幢几了质去己酷基酶基因IcDNA全长序列获得及氨基酸序列分析
[0014] 1.飞幢几了质去己酷基酶基因IcDNA片段获得
[0015] 基于飞幢的转录组数据库，对其化igene进行捜索，经NCBI Blastx分析后，确定 获得1个飞幢几了质去己酷基酶基因1的片段。
[0016] 2.飞幢几了质去己酷基酶基因IcDNA全长序列获得
[0017] 将上述基因片段通过GeneDoc软件进行拼接，并采用primer premiers. 0 软件设计上游引物CAACGTCACAACCAGTGAGTGTC(SEQ ID N0;3)和下游引物 GCGGTACACGATGAAAGATGG(SEQ ID NO ;4)，由上海英潍捷基生物有限公司合成。
[001引选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞幢若虫，在体式显微镜下将其表皮快 速解剖下来，并冷冻于液氮中。4头一个生物学重复，依照TaKaRa Trizol试剂盒提取RNA。 采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA。W此做为模板，结合设计上下游 引物，通过PCR扩增获得几了质去己酷基酶基因全长片段（图1)，通过Gel Extroaction Kit (Omega)将PCR产物进行纯化，将纯化后的产物克隆到祀ASY-T3Cloning vector (全式 金公司）中，转入感受态细胞，扩大菌液培养，采用Plasmid Mini Kitl (Omega)提取质粒检 测后将菌液送往invitrogen公司测序公司进行测序。测序得到核巧酸序列为SEQ ID NO: 1的序列。
[0019] 3.飞幢几了质去己酷基酶基因1氨基酸序列分析
[0020] 通过Ex化Sy在线软件对已获几了质去己酷基酶基因1进行翻译，预测几了质去 己酷基酶基因1的开放阅读框编码535个氨基酸，分子量为6化D，等电点为5. 11。功能域 预测发现几了质去己酷基酶基因1具有信号肤，几了质结合域（CBD)，低密度脂蛋白受体域 (LDLa)和催化活性域（CDA)。飞幢几了质去己酷基酶基因1氨基酸与赤拟谷盗CDA1氨基 酸序列的同源度达到90%。
[0021] 实施例2 ;飞幢几了质去己酷基酶基因1的dsRNA合成
[0022] 1.飞幢几了质去己酷基酶基因IdsRNA引物的设计
[0023] 基于飞幢几了质去己酷基酶基因序列，采用primer premiers. 0软件设计。设计 dsRNA 引物，其序列分别为 taatacgactcactatagggTCTGTAACGGCGAGAAGGAC(SEQ ID NO ;5) 和taatacgactcactatagggCCATCATGGTGAACTGGTTG(SEQ ID N0;6)(斜体部分为T7启动子）。 所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。
[0024] 2、飞幢几了质去己酷基酶基因1特异性dsRNA合成
[0025] W上述几了质去己酷基酶基因1提取质粒为模板，用含有T7启动子序列上下游引 物进行PCR扩增。得到一段长度为586bp基因片段（SEQ ID N0;7)，采用Gel Extraction Kit(Omega)试剂盒将PCR产物纯化后按照T7I?iboMAX? Express RNAi System(Promega)试 剂盒说明体外转录合成dsRNA。使用NaNo化op 2000(Thermo scientific)进行定量，使其 终浓度达到2. 5 y g/ y 1。保存于-80°C超级低温冰箱备用。
[0026] 实施例3 ;飞幢几了质去己酷基酶基因1的dsRNA致死飞幢实验
[0027] 1、特异性dsRNA注射
[002引选取28头生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄2天若虫进行实验。使用25 y 1 规格微量注射器将2. 5 y 1 (6. 25 y g)合成的dsRNA轻轻注射进入若虫侧腹部的二、=腹节 之间。同时选取28头若虫设立为对照组，注射相同体积和浓度的dsGFP至对照组体内。将 注射后飞幢置于30°C恒温生化培养箱中饲养（光照：黑暗时间=1化：10h，温度30±2°C， 湿度60% )，每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦款。
[0029] 2、飞幢几了质去己酷基酶基因1沉默检测
[0030] 各收集9头注射dsGFP和dsLmCDA12化后若虫虫体进行总RNA提取，并反转录成第 一链cDNA，采用Real-time PCR方法分别检测目的基因（LmCDAl)和管家基因（e-actin) 的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsRNA后，处理 组几了质去己酷基酶基因表达显著降低（图2)。每组设置3个生物学重复，每个生物学重 复3头若虫。
[0031] 3、注射dsRNA后五龄若虫表型观察
[0032] 五龄若虫注射dsRNA后，对照组虫体在5龄第7天全部成功晚皮至成虫，且晚皮后 成虫发育状态良好。注射ds LmCDAl后，若虫同样在第7天出现晚皮现象，但只有翅芽张开、 背部弓起，旧表皮难W从虫体上脱去直到死亡（图3)，死亡率达到94. 7% W上。
【主权项】
1. 一种飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO :1。
2. 如权利要求1所述的飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1编码的氨基酸序列，其特征在于 氨基酸序列为SEQ ID NO :2。
3. 如权利要求1所述飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1合成的dsRNA。
4. 如权利要求3所述dsRNA的合成方法，其特征在于包括如下步骤：按照飞蝗几丁 质去乙酰基酶基因1的核苷酸序列，设计含有T7启动子（斜体部分）的上游引物taat acgactcactatagggTCTGTAACGGCGAGAAGGAC 和下游引物 taatacgactcactatagggCCATCATG GTGAACTGGTTG，通过PCR扩增获得两端为T7启动子的模板，经试剂盒纯化后按照 T7RiboMAX?Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成得到。
5. 如权利要求3所述飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1合成的dsRNA在飞蝗防治中的应 用。
【专利摘要】本发明提供一种昆虫几丁质去乙酰基酶基因1(CDA1)全长序列及其在农业害虫防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取几丁质去乙酰基酶基因1片段，进一步调取获得序列为SEQ ID NO：1基因全长。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，从而使飞蝗难以脱去旧表皮导致死亡。多次实验表明其致死率达到94.7％以上。由于本发明的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。
【IPC分类】C12N15-10, C12N9-80, A01N57-16, A01P7-04, C12N15-113, C12N15-55
【公开号】CN104630247
【申请号】CN201510080636
【发明人】张建珍, 于荣荣, 张敏, 李大琪, 马恩波
【申请人】山西大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月13日