一种单克隆抗体、以其为活性成分的组合物与应用的制作方法

专利名称：一种单克隆抗体、以其为活性成分的组合物与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域，具体而言，涉及一种新型单克隆抗体，更具体而言，涉及一种新型抗VEGF人源化ScFV-FC基因工程抗体，和包含该新型单克隆抗体的药物组合物， 以及该新型单克隆抗体在治疗CNV类眼部疾病中的应用。
背景技术：
下面对本发明背景技术的论述仅仅提供用于帮助读者理解本发明，并没有承认所作描述都构成本发明的现有技术。眼新生血管形成(CNV)是很多眼部疾病的共同病理改变，最常发生于角膜、虹膜、 脉络膜和视网膜，包括角膜新生血管形成、老年性黄斑病变(AMD)、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变(ROP)、新生血管性青光眼等，其伴随的渗出、水肿、增生以及瘢痕化可严重破坏眼部正常视觉功能结构和功能，造成视力损坏，甚至失明。单单是糖尿病人，中国就有 9240万人，其中80%为II型糖尿病，也就是7392万人有糖尿病引起的CNV毛病。解决了 CNV就可以解决每年数十万人的失明问题，数千万人的视力衰退问题。正常的角膜是透明无血管的，在各种致病因素的作用下，形成角膜新生血管 (corneal neovascularization, CNV)。虽然新生血管增强了角膜的防御能力，促进了损伤和炎症的修复，但CNV可破坏角膜正常微环境，使相关免疫偏离消失，显著增加了角膜移植片排斥反应的危险，而且瘢痕形成使角膜失去透明，严重影响视力。现在由角膜新生血管而致盲的患者日益增加。其治疗很棘手，近年来，国内外针对CNV治疗研究的动物实验和临床试验亦大量进行，其中的许多结果显示出良好的临床应用前景。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是新生血管形成过程中的关键性因子。VEGF家族有6个异构体 VEGF-A、-B、-C、-D、-E及胎盘生长因子；其分子量为35 44，分别特异地与血管内皮生长因子受体(VEGFR-l、-2、及-3)相结合。VEGF及其受体系统在眼血管形成过程中起着非常重要的作用。保持眼内VEGF在一定的水平是确保正常眼部血液供应，维持和保护视网膜神经节细胞功能必不可少的，但过量表达可诱发病理性新生血管形成。因此，通过控制VEGF-A 可以大大抑制CNV以及CNV类眼部疾病。然而不幸的是，尽管本领域已经开发出了各种用于CNV治疗的抗体，但是这些现有的抗体普遍存在着人源化程度低，免疫原性大，副作用明显，安全性差；相对分子量大，穿透力和亲和力差；注射量大；成本相对高的各种缺点。本申请的发明人通过反复实验和不断努力获得了明显改善上述缺点的用于CNV治疗的新型单克隆抗体。目前还没有与本发明的单克隆抗体完全一样的抗体。本发明的单克隆抗体能够解决CNV引起的失明问题和视力衰退问题，且对上述存在的缺点有显著的改善，因此将会得到广泛应用，并带来巨大的社会及经济效益。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种新型单克隆抗体，具体而言，一种新型抗VEGF-A人源化ScFV-FC基因工程抗体，该抗体的总分子式为C2156H3272N561O681S12，分子量为46KD，其特点是特异性针对VEGF-A的、可与其发生高亲和力结合的全人源化抗体分子，可用于各种CNV 类眼病的治疗。本发明的又一个目的是提供编码该单克隆抗体的核酸分子，和包含该核酸分子的载体，以及包含该核酸分子和载体的细胞。本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的上述单克隆抗体。本发明的还有一个目的提供上述单克隆抗体在治疗CNV类眼病中的应用，该CNV 类眼病包括角膜新生血管形成、老年性黄斑病变(AMD)、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变(ROP)、新生血管性青光眼等等。本发明单克隆抗体的获得，可以采用现有技术中的公知方法进行。例如可以用多肽自动合成仪进行化学合成，也可以通过生物学的方法产生，这些方法都是本领域普通技术人员所熟知的。本发明的单克隆抗体能有效治疗CNV眼病，同时具有人源化程度高，免疫原性低， 副作用小，安全性高；相对分子量小，穿透力和亲和力强；注射量小；成本低廉的显著优点。本发明的药物组合物以本发明的单克隆抗体为活性成分，含有治疗有效量的本发明的单克隆抗体。需要的时候，在上述药物组合物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体， 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。本发明的药物可以制成液体、半固体、固体、膏状、粉末、胶囊等多种剂型，优选液体和膏状形式。根据不同的药剂形式，本发明的药物可以通过点滴、涂敷、口服、注射、输注等方式给药。本发明抗体的用量可根据患者的年龄、性别、体重、疾病的严重程度等各种因素进行适当的调整，这在医师的能力范围之内。


图1为单克隆抗体杂交瘤细胞株制备及单克隆抗体培养制备过程的示意图。
具体实施例方式本发明的下述实施列用于举例说明的目的，并不是对本发明范围的限制。实施列1.本发明单克隆抗体的生产方法单抗采用单克隆方法生产，是目前比较流行实用的制备单抗的工艺。Georges J. F. Kohler和Cesar Milstein在1975年首先在世界上制备了单克隆抗体。由于他们提出了单克隆抗体的制备方法而在1984年获得了诺贝尔医学与生理学奖。科学家早就知道怎样来制备抗体。他们在动物上注射抗原(比如病毒和肿瘤细胞)。动物免疫系统中的B细胞就会把抗体分子(与抗原特异性结合的分子)释放在血液里。但是，从血清中成批提取所需要的纯抗体几乎是不可能的。利用抗体的实验，比如疾病诊断试验，以前都依靠非纯制品，这样使试验标准化以及获得一致的重复结果显得非常的困难。既然单个的B细胞及其后代只产生一种抗体，获得纯抗体制品的一条显而易见的途径就是在实验室内培养B细胞。但是，这是一个不现实的方法，因为B细胞不能在培养基上长时间生存。Kohker和Milstein的历史性突破的发现就是，在实验室中一个B细胞可以与一种能无限增生的脊髓癌细胞融合，从而获得“永生”(immortal)。由此得到的杂合细胞被称为“杂交瘤”(hybridoma)。当杂交瘤细胞生长在培养液中时，它的在遗传上相同的后代会继续产生具有B母细胞特征的抗体。在那群遗传上相同的后代中的一个被称为一个纯种细胞系(克隆，clone)，因此由单个杂交瘤纯种细胞产生的抗体就叫做单克隆抗体。为了生成杂交瘤，Kohler和Milstein首先在一只老鼠上注射抗原，老鼠的B细胞开始产生与之对抗的抗体。然后他们割去老鼠的脾脏，再把脾脏细胞分开，然后与骨髓肿瘤中的瘤细胞(myeloma cells)培养在一起。脾脏组织含有大量的B细胞，在适当的环境下， 一些B细胞能与骨髓瘤融合产生杂合细胞。两位科学家筛选出能产生他们所需抗体的杂交瘤细胞(hybridoma)，并进行选择性培养。“杂交瘤”被证明具有所希望的、来自两个亲本的特性它们能无限地生长，同时无休止地释放出单种抗体。由于象骨髓瘤细胞一样生长非常迅速，它们能快速产生大量的抗体。新兴的生物技术工业在前几年中发展了大规模生产杂交瘤的方法。各种提高培养液中细胞的密度的技术包括气升式发酵罐培养(一种最初用来大量培养细菌的方法)，或者是能截获抗体的包囊法。在加富培养基(如含牛血清)里培养，同样能增加产量。此外， 还有一些防止骨髓瘤细胞生成自身的抗体，并能促进B细胞与骨髓瘤细胞融合的新技术。 这些改进的方法使工厂以克甚至千克计，而不是以前实验室内毫克数量级地生产纯抗体。 但生产杂交瘤的基本技术与Kohler和Milstein的最初实验方法是一样的。Kohler和Milstein从未为他们的技术申请过专利，该技术现在已被全世界的实验室自由采用，并且已经成为商业性抗体生产的基础。此外，还有许多制备单克隆抗体的方法，这些方法是本领域普通技术人员公知并熟练掌握的，本发明也可以用这些单克隆抗体制备方法中的任一种方法制备，但不限于这些方法。实施列2.本发明单克隆抗体有效性的鉴定对制备的单抗的有效性进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述5个方面的鉴定。第一，抗体特异性的鉴定。除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其他抗原进行交叉试验，方法可用ELISA法、IFA法。第二，单抗的Ig类与亚类的鉴定。一般在用酶标或荧光素标记的第2抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标记或荧光素标记的兔抗鼠IgG或 IgM，则检测出的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3% )更有利于沉淀线的形成。第三，单抗中和活性的鉴定。用动物或细胞的保护实验来确定单抗的生物学活性。 如果是确定本发明的单克隆抗体的中和活性，则可用抗体和VEGF同时接种于敏感细胞，来观察细胞是否受到抗体的影响。
第四，单抗识别抗原表位的鉴定。用竞争结合实验测相加指数的方法测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别表位是否相同。第五，单抗亲和力的鉴定。用ELISA或RIA竞争结合实验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。经实验鉴定，本发明的单克隆抗体在上述五个方面都符合所述领域的要求。輔歹丨丨3· H日月I·秘·斯口口口·愧本申请的发明人将本发明的单克隆抗体与目前市场上已有的两种同类产品 AVASTIN和LUCENTIS进行了比较，显示出具有优异的特性。(1).本发明单克降抗体与Avastin的比较Avastin (阿瓦斯汀)是美国Genentech公司生产的抗癌药物，于2004年2月26日获得FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌。它是第1个被批准上市的VEGF抑制剂。 Avastin为一种重组的全长人源化单克隆IgGl抗体，相对分子质量为148，000，包含93% 人类片段和7%鼠源结构，人源化部分可以延长其半衰期，降低其免疫源性。其作用机制是 Avastin对VEGF-A的所有亚型都具有亲和力，以VEGF为靶点，能竞争性地与内源性VEGF受体(VEGFR 1和VEGFR 2)结合，从而抑制血管内皮细胞的有丝分裂，防止血管渗漏，减少新生血管形成。Avastin没有被美国FDA批准用来治疗CNV，原因是制造商美国Genentech公司没有向FDA申请。但是，它被美国眼科医生广泛应用。根据美国法律，医生将已被FDA批准上市的药物，用在治疗未被FDA批准的领域(俗称off-label)是合法的。Avastin与本发明的单克隆抗体相比，一是其仍然含有7%的鼠源结构，比本发明的单克隆抗体的副作用大，二是其相对分子质量大，为148，000 (而本发明的单克隆抗体仅为46，000)，穿透力与亲和力都明显不如本发明的单克隆抗体。三其是注射量大，每次0. 05 毫升，而本发明的单克隆抗体则只需要0. 02毫升。Avastin每两周注射一次，而本发明的单克隆抗体每月注射一次。故本发明的单克隆抗体明显优于Avastin。(2).本发明单克隆抗体与Lucentis的比较Lucentis由美国Genentech公司生产，2006年6月FDA批准其用于CNV治疗。 Lucentis抗体是第二代人源化重组抗VEGF单克隆抗体片段Fab部分，相对分子质量为 48，000，含5个可变区和1个恒定区，由可降低免疫原性的非结合性人源化片段以及鼠高亲和力抗原决定簇两部分组成。Lucentis抗体对人类VEGF的所有亚型均有特异性的亲和力， 由于分子量小，能很好地穿透视网膜，药物经玻璃体腔内注射可大部分到达视网膜内，抑制新生血管的形成，故可对CNV起到治疗作用。临床研究证实，Lucentis对于眼底新生血管疾病如湿性老年性黄斑变性、增生型糖尿病视网膜病变和黄斑囊样水肿等疾病均有确切的疗效。但是由于其价格和重复注射率高，造成Lucentis治疗成本极高，故多项试验(包括 P IER、Pronto、SAILOR)正在探求减少重复治疗的可能性。与Lucentis相比，申请人的本发明的单克隆抗体，相对分子质量更低(46，000对比48，000)，穿透力与亲和力更好，Lucentis每次注射0. 05毫升，而本发明的单克隆抗体只需要0.02毫升。本发明的单克隆抗体的优势在于成本明显低。目前Lucentis的售价为每次注射为1，900美元，每个疗程8 20次注射。平均费用达到15万人民币。我们的本发明的单克隆抗体，大约只需4 6次注射，可以将总的费用控制在2万元人民币以内，同时疗效相当。故本发明的单克隆抗体在上述方面明显优于Lucentis。
由上面的比较可知，本发明的单克隆抗体具有人源化程度高，免疫原性低，副作用小，安全性高；相对分子量小，穿透力和亲和力强；注射量小；成本低廉的众多优点，同时能有效治疗CNV眼部疾病。輔歹丨14.絲日月I·秘白低M勿·云力力對式I发明人也对本发明单克隆抗体进行了药代动力学研究。对兔子和猴子进行的药代动力学研究表明，眼内注射，眼睛玻璃体内单克隆抗体浓度在六小时后达到最高水平，半衰期为3天。抗体从眼睛经过体循环到达人体内后，血液中的克隆抗体水平非常低，仅仅是眼内玻璃体0. 005%的水平。_歹丨丨5. H日肪口口口_師、剂U合··伺潴本发明的药物可以制成液体、膏状、半固体、固体、粉末、胶囊等多种形式，优选液体和膏状形式。根据不同的药剂形式，本发明的药物可以口服、注射、点滴等方式给药。本发明的药物可以是单剂型或多剂型形式。本发明单克隆抗体非限制性地可以制成无色透明，PH值为7的无菌液体。包装可以采用1毫升一次性玻璃小瓶和0. 02毫升一次性注射微型针筒，于2°C 8°C环境中避光保存。每小瓶例如含单克隆抗体10毫克。每个针筒含0.2毫克。每次注射0.2毫克。直接接触药品的是玻璃小瓶，这是被工业界认可的最广泛使用单抗包装瓶。考虑到单克隆抗体的单次注射量非常小，只有0. 2毫克，采用一次性微型针筒，方便患者的使用，剂量准确。 而使用1毫升的小品，是考虑到专科医院的使用，方便一次为多个患者提供治疗。包括药品瓶标签、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，发明人参照国家食品药品监督管理局颁布的《药物说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量标准。虽然参照示例性实施方式和实施例描述了本发明，所述描述不意图于被解释为限制性意义。因此，参考本说明书后，示例性实施方式以及本发明其它实施方式的各种修改对本领域技术人员将是显而易见的。因此考虑，所附权利要求书将覆盖任何这样的修改或实施方式。
权利要求
1.一种单克隆抗体，其总分子式为C2156H3272N561O681S1215
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，进一步的特征是其为特异性针对VEGF-A的、可与其发生高亲和力结合的全人源化抗体分子。
3.—种核酸，其编码如权利要求1或2所述的单克隆抗体。
4.一种药物组合物，包含作为活性成分的如权利要求1或2所述的单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的药物组合物，还包含一种或多种药学上可接受的载体。
6.如权利要求4所述的药物组合物，所述载体选自药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂。
7.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备用于治疗眼部疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述眼部疾病为眼新生血管形成引起的眼部疾病， 选自角膜新生血管形成、老年性黄斑病变、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变和新生血管性青光眼。
9.如权利要求7所述的应用，其中所述药物是液体、半固体、固体或膏状形式的。
10.一种试剂盒，其包括如权利要求1或2所述的单克隆抗体或如权利要求4所述的药物组合物，以及其使用说明书。
全文摘要
本发明的名称为一种单克隆抗体、以其为活性成分的组合物与应用。本发明的单克隆抗体是一种新型抗VEGF-A人源化ScFv-Fc基因工程抗体，该抗体的总分子式为C2156H3272N561O681S12，分子量为46KD，其特点是特异性针对VEGF-A的、可与其发生高亲和力结合的全人源化抗体分子，可用于CNV类眼病的治疗。本发明的单克隆抗体将会得到广泛应用，并带来巨大的社会及经济效益。
文档编号C12N15/12GK102190727SQ201010136079
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者叶亚东, 理查德·霍普 申请人:叶亚东