专利名称：一种敲除光滑球拟酵母线粒体基因的方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种线粒体基因缺失的光滑球拟酵母 及其敲除方法。
背景技术：
光滑球拟酵母是一种单倍体酵母，没有有性生殖阶段。光滑球拟酵母被广泛用于 丙酮酸和a-酮戊二酸的生产。某些光滑球拟酵母菌株还是临床上的机会致病菌。光滑球 拟酵母的基因工程研究目前还处于起步阶段。在酵母中最常用的遗传标记是可以完成互补 的营养缺陷型标记。目前国内研究光滑球拟酵母分子生物学的机构较少，仍处于研究的初步阶段。筛 选光滑球拟酵母营养缺陷型菌株是对其进行深入研究的重要基础工作之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因 (ARG8m)，线粒体基因被敲除的光滑球拟酵母。所述光滑球拟酵母ATP6基因被敲除。所述光滑球拟酵母ATP8基因被敲除。所述光滑球拟酵母ATP9基因被敲除。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种敲除光滑球拟酵母线粒体上基因 的方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为用带有目的基因的片段转化精氨酸缺陷型光滑球拟酵母，通过厌氧培养富集与筛 选得到线粒体基因缺失的光滑球拟酵母。所述目的基因片段是指目的基因左边和右边分别为待敲除基因的左端和右端，目 的基因片段的中间含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)。所述转化采用基因枪法，参数为载体为0. 6um的金粉，距离为6cm，采用llOOpsi的 破裂盘，真空度为29. 5MPa。所述光滑球拟酵母为感受态细胞。敲除线粒体上基因的具体步骤如下(1)根据乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)及待敲除基因序列设计扩增含有 同源片段及ARG8m基因的引物，在5’和3’端分别引入BamHI (ggatcc)酶切位点，以携带 ARG8m基因的载体为模板进行PCR扩增，得到含有待突变基因同源序列及ARG8m基因的片 段，所述载体优选 pDS24 (Steele, etc. Proc. Natl. Acad. Sci.，1996，93，5253-5257.)；(2)PCR产物经BamHI酶切后相同酶切的pUC19质粒连接，得到一个含有待突变基 因敲除框的质粒；(3)将所得质粒用基因枪转化光滑球拟酵母精氨酸缺陷型菌株；
(4)单个菌落经过亚克隆后，放入液体基本培养基中，用氮气排出空气，密封后于 30°C培养24h，取培养物适当稀释涂布于基本培养基(MM)平板上；(5)挑取单菌落分别影印至YPD和YPG平板上，在YPG平板上出现的而不在YPD平 板上生长的，提取基因组进行鉴定，即可得到线粒体基因敲除的光滑球拟酵母。本发明具有的优点(1)本发明得到的光滑球拟酵母为线粒体同质型菌株，解决 了酵母细胞内通常含有多个不同质型线粒体的问题，将极大促进后续代谢工程改造和微生 物生理学研究；线粒体基因有缺失，易于识别和保护；(2)本发明的敲除方法为双倍体或多 倍体酵母的基因工程改造提供了一种新的途径和方法；(3)本发明的敲除方法简单、高效， 保持酵母的原有特性不变，可以在5-7天内实现上的线粒体基因的敲除。
图1线粒体DNA同质体转化子在YPD和YPG上的生长情况图2mtDNA转化子同质性的PCR验证(a)弓 | 物 PCR 位点示意图；(b)弓 | 物 ARG8m_F/R 的 PCR 产物；M lkb DNALadder ； 1 野生型菌株；2 出发菌株；3 :ATP8敲除菌株；4 :ATP6敲除菌株；5 :ATP9敲除菌株；6 pDS24(阳性对照)；(c)ATP869-F/R 的 PCR 产物 M :lkb DNA Ladder ；1 野生型菌株；2 出 发菌株；3 :ATP8敲除菌株；4 :ATP6敲除菌株；5 :ATP9敲除菌株。
具体实施例方式实施例1光滑球拟酵母染色体基因ATP6的敲除方法1.含有目的片段的pUC_atp6 :ARG8m质粒的获得用引物对Con-ATP6-F 5 ’ GCggatccAATATTATTTATTATATAATAATATTAATTTTAATAAGTTATAATATATATTTATAAAG TATGACACATTTAGAAAGAAG 3，Con-ATP6-R 5’ GCGggatccTATTAATAATAATTAATTAAAGAATATTATAATATAATTAATTTATTTGTATTATATA AATTAAGCATATACAGCTTCG 3，从含有ARG8m基因的质粒pDS24中扩增得到用于敲除ATP6的敲除框 A atp6: :ARG8m。引物中从5’端开始，分别为酶切位点保护碱基(大写字母)、BamHI酶切 位点(小写字母)、与ATP6同源的片段(大写字母)和ARG8m(下划线)的同源序列。PCR 条件为:95°C,3min ； {95 °C, 50s ；55 °C,60s ；72°C，lmin}，循环 30 次；72°C, 15min ；-20°C保存。PCR产物经过BamHI酶切后，插入经过相同酶切的pUC 19质粒，得到一 个含有ATP6基因敲除框的质粒，命名为pUC-atp6: :ARG8m，测序验证。2.基因枪转化1)挑单菌落接种于5mL YPD培养基中，30°C过夜培养至饱和；2)0. 接种至100mL YPD培养基中，30°C培养24h，细胞密度约为1 X 109细胞/ mL ；3)培养物分装至两个50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清；
4)用适量(约2mL)预冷的lmol L-1山梨醇重悬，使最终菌悬液0D600 = 200 ；5)按每份100 u L涂布于匪上，直接转化；6)将溶于2 u L去离子水中的2 u g的质粒附着在金粉颗粒上，并涂布于破破裂盘 上，用于基因枪转化；转化的参数为载体为0. 6 y m的金粉，距离为6cm，采用1 lOOpsi的破 裂盘，真空度为29. 5MPa ；7)转化完毕后，将平板置于30°C培养，直至单个菌落出现。3.光滑球拟酵母线粒体基因敲除同质体的获得1)单个菌落经过亚克隆后，放入液体基本培养基中，用氮气排出空气，密封后于 30°C培养24h，取培养物适当稀释涂布于基本培养基平板上；2)挑取单菌落分别影印至YPD和YPG平板上，在YPG平板上出现的而不在YPG平 板上生长的，即为只含有转化后的线粒体的纯合子。4.线粒体敲除同质体的验证用引物对ATP869-F 5' cactattggtggtatgacag3，ATP869-R :5，GTGTTGGCACATCATTACTA3，，对所获的菌株进行菌落PCR验证，结果见 图1。转化子与出发菌种分别接种于YPD及YPG培养基上进行培养基验证，结果见图2。5.相关培养基YPD培养基酵母抽提物10g L—1，胰蛋白胨2. 0g L—1，葡萄糖20g L-1 ；YPG培养基酵母抽提物10g L—1，胰蛋白胨2. 0g L-1，甘油20g L-1 ；基本培养基(MM)葡萄糖20g I71，KH2P041. 0g I71，MgS04 7H20 0. 5g I71， (NH4)2S0410g r1，尿嘧啶 80mg I71 ；相应的YPD，匪平板均加入20g L—1琼脂粉。实施例2光滑球拟酵母染色体基因ATP8的敲除方法1.含有目的片段的pUC_atp8 :ARG8m质粒的获得用引物对Con-ATP8-F 5 ’ GCggatccATAATAATTTATTTATTATTAATGTTGTATTTATATTAAATATATAAAAAATATATAAA TATGACACATTTAGAAAGAAG 3，Con-ATP8-R 5 ’ GCGggatccATAATTATATATTATTAATTATATTATATTATAATTATATATTATTATTATTAATTAT ATTTAAGCATATACAGCTTCG 3'从含有ARG8m基因的质粒pDS24中扩增得到用于敲除ATP6的敲除框 A atp6: :ARG8m。引物中从5’端开始，分别为酶切位点保护碱基(大写字母)、BamHI酶切 位点(小写字母)、与ATP8同源的片段(大写字母)和ARG8m(下滑线)的同源序列。PCR 条件为:95°C,3min ； {95 °C, 50s ；55 °C,60s ；72°C，lmin}，循环 30 次；72°C, 15min ；-20°C保存。PCR产物经过BamHI酶切后，插入经过相同酶切的pUC19质粒，得到一 个含有ATP8基因敲除框的质粒，命名为pUC-atp8: :ARG8m，测序验证。2.基因枪转化1)挑单菌落接种于5mL YPD培养基中，30°C过夜培养至饱和；
5
2)0. 接种至100mL YPD培养基中，30°C培养24h，细胞密度约为1 X 109细胞/ mL ；3)培养物分装至两个50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清；4)用适量(约2mL)预冷的lmol L—1山梨醇重悬，使最终菌悬液0D6(1(1 = 200 ；5)按每份100 u L涂布于基本培养基上，直接转化；6)将溶于2 u L去离子水中的2 u g的质粒附着在金粉颗粒上，并涂布于破破裂盘 上，用于基因枪转化；转化的参数为载体为0. 6um的金粉，距离为6cm，采用llOOpsi的破 裂盘，真空度为29. 5MPa；7)转化完毕后，将平板置于30°C培养，直至单个菌落出现。3.光滑球拟酵母线粒体基因敲除同质体的获得1)单个菌落经过亚克隆后，放入液体基本培养基中，用氮气排出空气，密封后于 30°C培养24h，取培养物适当稀释涂布于基本培养基平板上；2)挑取单菌落分别影印至YPD和YPG平板上，在YPG平板上出现的而不在YPG平 板上生长的，即为只含有转化后的线粒体的纯合子。4.线粒体敲除同质体的验证用引物对ATP869-F 5' cactattggtggtatgacag3，ATP869-R :5，GTGTTGGCACATCATTACTA3，，进行菌落PCR验证，转化子与出发菌种分 别接种于YPD及YPG培养基上进行培养基验证，结果见图2。5.相关培养基YPD培养基酵母抽提物10g L—1，胰蛋白胨2. 0g L—1，葡萄糖20g L-1 ；YPG培养基酵母抽提物10g L—1，胰蛋白胨2. 0g L-1，甘油20g L-1 ；基本培养基(MM)葡萄糖20g L-1，KH2P041. 0g L-1，MgS04 7H20 0. 5g L-1， (NH4)2S0410g r1，尿嘧啶 80mg I71 ；相应的YPD，匪平板均加入20g L—1琼脂粉。实施例3光滑球拟酵母染色体基因ATP9的敲除方法1.含有目的片段的pUC_atp9 :ARG8m质粒的获得用引物对Con-ATP9-F 5 ’ GCggatccATATATATATATATATTAATTATTTAAATATATAATAAAGATTATAAAAAATATAATAT TATGACACATTTAGAAAGAAG 3，Con-ATP9-R 5 ’ GCGggatccAAATATTTATTTATTAAGAATATTATAATATTACTATATTAATAGTAAACATTATTAT TATTAAGCATATACAGCTTCG 3'从含有ARG8m基因的质粒pDS24中扩增得到用于敲除ATP6的敲除框 A atp9: :ARG8m。引物中从5’端开始，分别为酶切位点保护碱基(大写字母)、BamHI酶切 位点(小写字母)、与ATP9同源的片段(大写字母)和ARG8m(下滑线)的同源序列。PCR 条件为:95°C,3min ； {95 °C, 50s ；55 °C,60s ；72°C，lmin}，循环 30 次；72°C, 15min ；-20°C保存。PCR产物经过BamHI酶切后，插入经过相同酶切的pUC19质粒，得到一
6个含有ATP9基因敲除框的质粒，命名为pUC-atp9: :ARG8m，测序验证。2.基因枪转化1)挑单菌落接种于5mL YPD培养基中，30°C过夜培养至饱和；2)0. 接种至100mL YPD培养基中，30°C培养24h，细胞密度约为1 X 109细胞/ mL ；3)培养物分装至两个50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清；4)用适量(约2mL)预冷的lmol L—1山梨醇重悬，使最终菌悬液0D6(1(1 = 200 ；5)按每份100 u L涂布于基本培养基上，直接转化；6)将溶于2 u L去离子水中的2 u g的质粒附着在金粉颗粒上，并涂布于破破裂盘 上，用于基因枪转化；转化的参数为载体为0. 6um的金粉，距离为6cm，采用llOOpsi的破 裂盘，真空度为29. 5MPa ；7)转化完毕后，将平板置于30°C培养，直至单个菌落出现。3.光滑球拟酵母线粒体基因敲除同质体的获得1)单个菌落经过亚克隆后，放入液体基本培养基中，用氮气排出空气，密封后于 30°C培养24h，取培养物适当稀释涂布于基本培养基平板上；2)挑取单菌落分别影印至YPD和YPG平板上，在YPG平板上出现的而不在YPG平 板上生长的，即为只含有转化后的线粒体的纯合子。4.线粒体敲除同质体的验证用引物对ATP869-F 5' cactattggtggtatgacag3，ATP869-R :5，GTGTTGGCACATCATTACTA3，，对所获的菌株进行菌落PCR验证，转化子 与出发菌种分别接种于YPD及YPG培养基上进行培养基验证，结果见图2。5.相关培养基YPD培养基酵母抽提物10g L—1，胰蛋白胨2. 0g L—1，葡萄糖20g L-1 ；YPG培养基酵母抽提物10g L—1，胰蛋白胨2. 0g L-1，甘油20g L-1 ；基本培养基(MM)葡萄糖20g I71，KH2P041. 0g I71，MgS04 7H20 0. 5g I71， (NH4)2S0410g r1，尿嘧啶 80mg I71 ；相应的YPD，匪平板均加入20g L—1琼脂粉。
权利要求
一种敲除光滑球拟酵母线粒体基因的方法，其特征在于用带有目的基因的片段转化精氨酸缺陷型光滑球拟酵母，通过厌氧培养富集与筛选得到线粒体基因缺失的光滑球拟酵母。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因片段是指目的基因左边和右边 分别为待敲除基因的左端和右端，目的基因片段的中间含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基 ARG8m。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述转化采用基因枪法，参数为载体为 0. 6um的金粉，距离为6cm，采用llOOpsi的破裂盘，真空度为29. 5MPa。
4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述光滑球拟酵母为感受态细胞。
5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)及待突变基因序列设计扩增含有同源 片段及ARG8m基因的引物，在5’和3’端分别引入BamHI (ggatcc)酶切位点，以携带ARG8m 基因的载体为模板进行PCR扩增，得到含有待突变基因同源序列及AR G8m基因的片段，所 述载体优选PDS24;(2)PCR产物经BamHI酶切后与相同酶切的pUC19质粒连接，得到一个含有待突变基因 敲除框的质粒；(3)将所得质粒用基因枪转化光滑球拟酵母精氨酸缺陷型菌株；(4)单个菌落经过亚克隆后，放入液体基本培养基中，用氮气排出空气，密封后于30°C 培养24h，取培养物适当稀释涂布于基本培养基(MM)平板上；(5)挑取单菌落分别影印至YPD和YPG平板上，在YPG平板上出现的而不在YPD平板上 生长的，提取基因组进行PCR鉴定，即可得到线粒体基因敲除的光滑球拟酵母。
6.一种根据权利要求1所述方法得到的光滑球拟酵母，其特征在于所述的光滑球拟酵 母含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)，线粒体上目的基因被敲除。
7.权利要求6所述的光滑球拟酵母，其特征在于所述光滑球拟酵母ATP6基因被敲除。
8.权利要求6所述的光滑球拟酵母，其特征在于所述光滑球拟酵母ATP8基因被敲除。
9.权利要求6所述的光滑球拟酵母，其特征在于所述光滑球拟酵母ATP9基因被敲除。
全文摘要
本发明公开了一种敲除光滑球拟酵母线粒体基因的方法，属于基因工程技术领域。本发明主要采用长末端引物得到含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)及待敲除线粒体基因的侧翼序列的同源重组片段，基因枪转化酵母线粒体，厌氧培养消除线粒体异质性得到只含有改造后的线粒体的上的转化子。本发明所得酵母菌，易于识别和保护；敲除方法为双倍体或多倍体酵母的基因工程改造提供了一种新的途径和方法；敲除方法简单、高效，保持酵母的原有特性不变，可以在5-7天内实现上的线粒体基因的敲除。
文档编号C12R1/645GK101831449SQ201010135609
公开日2010年9月15日 申请日期2010年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者刘立明, 周景文, 堵国成, 陈坚 申请人:江南大学