六价钼离子快速检测金标试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开一种用于快速检测重金属六价钼离子的金标试纸。金标试纸底层为支撑层，中间层为吸附层，保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水垫，在纤维素膜层上设有偶联六价钼离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹和用兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的六价钼离子单克隆抗体。本实用新型能实现对土壤、水、食品中钼离子污染残留的快速检测，具有特异、敏感、快速、简便、结果形象直观、经济等优点；既可用于大批样品的筛检，又可用于小批样品的快速检测，适用范围广。
【专利说明】六价钼离子快速检测金标试纸
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫学和卫生检验学【技术领域】，特别是涉及一种用于快速检测六价钥离子的金标试纸。
【背景技术】
[0002]我国具有丰富的钥矿资源，总储量840万吨，钥作为一种过渡态金属元素，其化合物呈现五种价态，其中六价钥最为稳定，也与人类的生命活动关系最为密切，缺乏与过量均会影响生命的质量。钥是有机体必需的微量元素之一，人体各种组织都含钥，成人体内总量为9mg，肝脏、肾脏含量最高。钥元素本身没有生物活性，只有六价钥离子与嘌呤结合形成辅酶后才具有生物活性，其生理功能主要有维持正常的新陈代谢，提高动脉壁的弹性，减少心血管疾病，通过抗氧化作用提高机体免疫机能，并可抑制亚硝胺类致癌物质在体内的合成，具有抗癌作用；六价钥缺乏会导致龋齿、肾结石、克山病、大骨节病、食道癌等疾病。但同时六价钥过量能够引起机体中毒，人体摄取量超过10?15mg时，会导致生长发育迟缓，体重下降，甚至发生痛风样综合症、关节疼痛及畸形、肺部变性等病症。动物钥中毒表现类似铜缺乏病，1938年Ferguson首次报道了牧草中钥含量过高，可使放牧牛产生持续性腹泻、被毛脱色为特征的中毒性疾病。英国的“牛腹泻病”、新西兰的“牛泥炭泻”和澳大利亚“牛地方性血尿症”和我国1981年赣南地区发生的耕牛“红皮白毛症”等，都是六价钥中毒的典型事件。在自然状态下六价钥对生物体没有危害，但由于钥被广泛应用于特种钢、机械、石油、化工、国防、航空航天、电子、核工业等诸多领域，钥矿大量开采，六价钥离子以各种形式进入自然界，环境污染急剧加重，加之累积效应和生物富集作用，对环境污染和人类健康构成了严重威胁。因此，对环境土壤、水源、饲料、食品中六价钥含量的检测意义重大。
[0003]目前，检测环境六价钥离子主要采用理化分析方法和免疫分析方法，理化分析方法包括紫外分光光度法(UV)、电化学分析法(EC)、原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)、中子活化分析法(NAA)等。这些方法各有优缺点，紫外分光光度法操作简单，快速，干扰小，但其灵敏度不高；电化学分析法灵敏、简便等，对操作人员的技术要求高；原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、氢化物发生-原子荧光光谱法具有选择性好、测定精度高、简单、快速等优点，但所用仪器比较昂贵，只能在实验室进行检测，且对操作人员技术要求较为严格，限制了其广泛使用；中子活化分析法是一种以核反应为基础的分析方法，具有微量、快速、准确和非破坏性且同时可分析多元素的优点，但所需的设备不易为一般实验室所具备，很难得到广泛应用。
[0004]因此，研制快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的六价钥离子快速检测产品，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。
实用新型内容
[0005]本实用新型要解决的技术问题:针对现有六价钥离子检测技术的不足，提供一种能够快速、简便、敏感、特异的用于快速检测六价钥离子的金标试纸。
[0006]本实用新型的技术方案:
[0007]—种用于快速检测六价钥离子的金标试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水垫，其中在纤维素膜层上设有偶联六价钥离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹和用兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹。
[0008]所述金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的特异性六价钥离子单克隆抗体。
[0009]所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；所述样品垫用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水垫用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体结合垫用玻璃纤维棉制成。
[0010]所述偶联六价钥离子的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白；检测印迹上偶联六价钥离子的载体蛋白的包被量为I μ L/cm，载体蛋白浓度为lmg/mL ;对照印迹上兔抗鼠IgG抗体的包被量为I μ L/cm，抗体浓度为lmg/mL ;所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“ I I ”直线式印迹或“十十”字型排列印迹。
[0011]所述保护膜覆盖在样品垫、金标抗体结合垫和吸水垫上，在样品垫与金标抗体结合垫交界处对应的保护膜上偏向样品垫一侧0.3-0.6 cm处印制有样品标记线。
[0012]本实用新型的积极有益效果:
[0013](I)本实用新型的金标试纸，检测六价钥离子速度快，5min内出检测结果，比理化检测方法(3 d)大大节省了检测时间；
[0014](2)本实用新型的金标试纸，检测方法简便，不需要任何附加仪器和试剂，人人均可操作，携带方便，可现场检测；
[0015](3)本实用新型的金标试纸，敏感性高，检测灵敏度为5ng/mL，符合国家限量标准要求，与理化检测方法灵敏度相当；特异性强，与其它重金属离子无交叉反应；经济，与理化检测方法相比，检测一个样品至少可节省检测费用300元以上。
[0016](4)本实用新型的金标试纸存储方便，保质期长，且对存储温度要求不高，在2_8°C下的有效期为一年，室温干燥条件下保质期为六个月。
[0017](5)本实用新型的六价钥离子金标试纸可应用于快速检测土壤、水、食品中六价钥离子污染残留，具有快速、简便、敏感、特异、经济等特性，既可用于大批样品的筛检，又可进行小批样品的快速检测，不仅为环境、食品安全提供技术支撑，也为食品进出口检验、食品检验执法、环境污染监测评价等提供有效的技术手段和检测方法，对于提高食品安全、保障人民身心健康、保持环境友好与可持续发展具有重要现实意义，并且具有显著的经济效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本实用新型试纸条的俯视结构示意图。
[0019]图2为图1试纸条的侧面结构示意图。
[0020]图中，I为支撑层，2为样品垫，3为金标抗体结合垫，4为纤维素膜层，5为吸水垫，6为检测印迹，7为对照印迹，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。【具体实施方式】
[0021]实施例一、检测微量六价钥离子的试纸条结构，参见图1、图2。图中支撑层I用塑胶薄片条制成，样品垫2用玻璃纤维棉制成，金标抗体结合垫3上吸附有抗六价钥离子的单克隆抗体，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜，吸水垫5用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从右至左依次粘贴固定在支撑层I上，彼此交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上设有检测印迹6和对照印迹7，检测印迹用偶联六价钥离子的牛血清白蛋白(BSA)溶液印制，对照印迹用兔抗小鼠IgG抗体溶液印制，两条印迹平行排列成“ I I ”。8-1为覆盖在样品垫2和金标抗体结合垫3上面的测试端保护膜(白色)，8-2为覆盖在吸水垫5上面的手柄端保护膜(如黄色)，在样品垫2与金标抗体结合垫3交界处、对应的白色保护膜偏向样品垫2 一侧约0.5 cm处印制有样品标记线9，在样品标记线右侧的保护膜上印有箭头及MAX字样。
[0022](I)检测反应原理
[0023]当六价钥离子试纸条测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测六价钥离子及金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并渗入手柄端的吸水垫。扩散过程中待测六价钥离子可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上六价钥离子的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜层上偶联六价钥离子载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而兔抗小鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，形成棕红色对照印迹带“ I ”，即一条棕红色带“ I ”印迹为阳性表示；反之，样品溶液中无六价钥离子，则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联六价钥离子的载体蛋白检测印迹结合，显示棕红色检测印迹“ I ”，同样兔抗小鼠IgG抗体也与金标抗体结合，显示棕红色对照印迹带“ I ”，形成两条棕红色带“ I I ”为阴性表示。如果纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。
[0024](2)待测样品制备及检测步骤:`[0025]用于检测土壤:称取1.0 g 土壤样品于50 mL微波管中，加入ImL双蒸水浸润后加入混酸溶液(2 mL HNO3和6 mL HC1)，室温反应12 h，置于微波消解炉中，180 °C保持15min，冷却至室温，NaOH溶液调节pH至7.4，用50 mL容量瓶定容。在定容后的水样消解液中按照9: I的体积比加入摩尔浓度为100mmoL/L的EDTA鳌合剂，混合均匀，使六价钥离与EDTA充分鳌合，得到土壤样品检测溶液。
[0026]操作方法:将试纸条插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10~20秒钟取出检测试纸条，水平放置，在5 min内观察判定检测结果。
[0027]实施例二:试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于:金标抗体结合垫吸附有抗六价钥离子的多克隆抗体，样品垫用尼龙膜制成，纤维素膜层采用纯纤维素膜，检测印迹和对照印迹均为“十”，覆盖在吸水垫上面的手柄端的保护膜为兰色。
[0028]用于检测猪肉样品:称取猪肉样品1.0g，在聚四氣乙稀?甘祸中加入硝酸2mL，室温反应4h，然后用硝酸4 mL将肉样全部转移到消化管内，加入1.5 mL 30%过氧化氢溶液反应I h，之后置于微波消解炉中，180°C保持15 min，冷却至室温，NaOH溶液调节pH至7.4，用50 mL容量瓶定容。在定容后的水样消解液中按照9: I的体积比加入摩尔浓度为100mmoL/L的EDTA鳌合剂，混合均匀，使六价钥离与EDTA充分鳌合，得到猪肉样品检测溶液。
[0029]实施例三:试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于:样品垫用PVDF膜制成，偶联六价钥离子的载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(OVA)，纤维素膜层采用羧化纤维素膜，覆盖在吸水垫上面的手柄端保护膜为绿色。
[0030]用于检测水样:在水样中按照9: I的体积比加入摩尔浓度为100 mmoL/L的EDTA鳌合剂，混合均匀，使六价钥离与EDTA充分鳌合，得到水样检测溶液。
[0031]实施例四:试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于:样品垫用聚酯膜制成，纤维素膜层采用羧化纤维素膜，偶联六价钥离子载体蛋白溶液为血
[0032]蓝蛋白(KLH)。
【权利要求】
1.一种用于快速检测六价钥离子的金标试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护膜固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水垫，其中在纤维素膜层上设有偶联六价钥离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹和用兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹。
2.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是:所述金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的特异性六价钥离子单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是:所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；所述样品垫用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水垫用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体结合垫用玻璃纤维棉制成。
4.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是:所述偶联六价钥离子的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
5.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是:所述检测印迹上偶联六价钥离子的载体蛋白的包被量为I μ L/cm，载体蛋白浓度为lmg/mL ;对照印迹上兔抗鼠IgG抗体的包被量为lyL/cm，抗体浓度为lmg/mL ;所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“ I I ”直线式印迹或“十十”字型排列印迹。
6.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是:所述保护膜覆盖在样品垫、金标抗体结合垫和吸水垫上，在样品垫与金标抗体结合垫交界处对应的保护膜上偏向样品垫一侧0.3-0.6 cm处印制有样品标记线。
【文档编号】G01N33/577GK203376325SQ201320519408
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月25日 优先权日:2013年8月25日
【发明者】张海棠, 王自良, 王淑云, 范国英, 姜金庆, 黄华国 申请人:河南科技学院