专利名称：快速检测创伤弧菌的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测创伤弧菌的试剂盒，进一步涉及使用快速检测创伤弧菌的试剂盒快速检测创伤弧菌的方法。
背景技术：
近年来，我国海水养殖业迅猛发展，在过去10年间海水养殖产量增加了5-6倍。但是，前阶段海水养殖的大发展带有很大的盲目性、甚至破坏性，导致这两年海水养殖产量增长开始放缓，尤其是病害的问题变的愈来愈严重。其中弧菌病是危害养殖鱼虾贝藻类等多种海水养殖生物的重要病原之一。弧菌是海洋起源的土著细菌，在海水和海洋生物中广为分布；病原性弧菌能引起养殖生物爆发性死亡，而且可以与病毒，其它细菌或寄生虫等一起造成共同感染。在我国海水养殖生物中，创伤弧菌是最常见的病原性弧菌之一，每年由创伤弧菌造成的损失十分巨大。当前的弧菌病原检测技术主要有以下几种1，常规生化检测技术，它是将纯化后的细菌接种到含不同生化物质的培养基中，由于不同种的细菌代谢的物质不完全相同，与培养基中显色剂反应的结果也不同，将这些结果与标准菌株和文献记录结果对照，就可以得出结论。(参考文献娄永新 王金良 主编《实用临床细菌学检验与进展》1992天津科技翻译出版公司)，这种方法结果比较准确但十分耗时，而且对新的种类的检测结果并不十分可靠；2，API-20E等快速细菌鉴定试剂盒，它采用检测少数几个生化指标后统计分析得出鉴定结论，相对比较节约时间，但结果不太可靠。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测创伤弧菌的试剂盒，特别是提供一对创伤弧菌特异性引物VP01和VP02，并提供一种使用快速检测创伤弧菌的试剂盒快速测检和监测多种样品中创伤弧菌的方法，从而为健康养殖提供科学的依据。
本发明的主要原理为试剂A和B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，试剂C和D为多聚酶链式反应技术试剂，通过试剂D中所含的创伤弧菌特异DNA片段引物和试剂C中的热聚合酶等成分，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，由于我们设计的引物为创伤弧菌所特有，因此，如果样品中含有创伤弧菌，那么它的DNA的特异片段在经过扩增后，浓度将达到108mol(克分子)以上，这样，在电泳和溴乙锭染色后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有创伤弧菌，则不能扩增到同样分子量的目的条带。
本发明的目的是这样实现的一种快速检测创伤弧菌的试剂盒，包括(a)DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，
试剂A含有NaCl0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通(Triton)X-100；试剂B含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)；(b)聚合酶链式反应(PCR反应)试剂包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，试剂C含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶(Taq酶)和灭菌双蒸水(ddH2O)，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位(5个单位/μl)和1 8-35.5μl；试剂D包括特异引物对VP01和VP02、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl2，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；试剂D中的特异引物对VP01和VP02为进行PCR反应的特异引物和必需成分，VP01特指5′-ACCAGTGATTGTCTTGCACCACAA；VP02特指5′-GCGAACTCGCTTATCTCCGCTAA；(c)电泳和显色试剂，包括试剂E和试剂F，试剂E为50倍TAE(电泳缓冲液)，含Tris-乙酸和EDTA，浓度分别为0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA；试剂F含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml的溴乙锭。
每管反应试剂的最佳组成为试剂C5.0μl 10×PCR Buffer，0.5μl Taq(5U/μl)，35.5μlddH2O，试剂D4.0μl dNTP(2.5mM each)，3.0μl MgCl2(25mM)，10pM VP0110pM VP02。
试剂A为DNA提取缓冲液，为DNA的提取提供适宜的缓冲环境并抑制DNA的降解；试剂B为细胞裂解试剂，使细菌裂解并释放出DNA；试剂C为PCR反应预混试剂，为PCR反应试剂的主要成分之一，试剂D为PCR引物试剂，也是PCR反应的主要成分，包含有本试剂盒最为关键的特异引物VP01和VP02。试剂E为50倍TAE(电泳缓冲液)，为样品电泳提供合适的pH值、离子强度等的缓冲体系；试剂F为电泳介质琼脂糖+显色剂溴乙锭。
使用上述快速检测创伤弧菌的试剂盒快速检测创伤弧菌的方法依次包括下列步骤(a).样品处理取0.1-0.5克样品，用100-400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；(b).DNA提取用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-100μl试剂B混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破裂，释放出DNA；10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2倍(240-800μl)的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5-10分钟，10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中；即为DNA提取液；(c).PCR扩增以0.5-1μl提取的DNA作为PCR扩增的模板；取21-42μl试剂C与4-8μl试剂D混合；在热循环仪上对提取的DNA模板进行扩增，通过94℃-98℃解链2-5分钟；然后在93-95℃变性30秒-1分钟，54-64℃复性30秒-1分钟，72℃延伸30秒-1.5分钟，如此循环25-35次，最后在72℃保温8-12分钟，将创伤弧菌的特异片段增加到108mol以上；(d).电泳和显色检测取5-10μl扩增后的样品，与2-6μl V/V为0.25％的溴酚蓝混合，W/V为0.8-1.2％的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条300核苷酸对的条带，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有创伤弧菌感染或污染，反之则没有。
本发明的优点和积极效果基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术(聚合酶链式反应技术)，相对其它的弧菌病原检测技术和其它的病原检测技术而言，本方法有几个显著的优点首先，该方法检测十分快速，3-4小时即可得知检测结果，而其它方法则至少需要3天或一个星期以上；其次，该方法检测灵敏度极高，检测下限低至10个左右的细菌，其它方法必须要有一定时间的纯培养增殖达到105后才能进行检测。本发明可以应用于多种样品的检测；可以检测养殖动物受创伤弧菌感染的情况，也可以监测养殖水体环境中病原创伤弧菌，还可以检测养殖饲料和鲜活饵料是否受创伤弧菌污染。
具体实施例方式
下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。
实施例1按以下配方制作快速检测创伤弧菌的试剂盒试剂A0.1M NaCl，10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，5％Triton X-100试剂B10mg/ml溶菌酶，10mM Tris.Cl(pH8.0)试剂C5.0μl 10×PCR Buffer，0.5μl Taq(5U/μl)，35.5μl ddH2O试剂D4.0μl dNTP(2.5mM each)，3.0μl MgCl2(25mM)，20pM VP0120pM VP02试剂E50×TAE试剂F琼脂糖(1％)+溴乙锭(0.5μg/ml)按照以下程序进行检测1.样品处理和DNA的提取取鱼组织约0.1-0.5克，在样品中加入400μl试剂A，灭菌牙签捣碎，12000g离心2分钟，弃上清，用350μl试剂A和50μl试剂B重新悬浮沉淀，混匀。室温放置5分钟，100℃水浴5分钟。冷却至室温，12000g离心10分钟，取上清，加入800μl无水乙醇，室温放置5分钟，12000g离心5分钟，彻底去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇挥发，将沉淀溶于30μl灭菌双蒸水，即为DNA提取液。
2.创伤弧菌的特异片段扩增在一管试剂C中加入1μl DNA提取液，再加入8μl试剂D，10000g离心30秒。在PCR热循环反应仪上进行如下反应
94℃加热变性4分钟；然后在95℃解链1分钟，62℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共循环35次；在72℃保温10分钟后停止反应。
3.电泳和显色检测反应结束后，取5-10μl反应液，与4μl V/V为0.25％溴酚蓝混合，用W/V为1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下检测，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有创伤弧菌感染或污染；反之则没有。
实施例2按以下配方配制各种溶液试剂A0.3M NaCl，10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，试剂B5mg/ml溶菌酶，10mM Tris.Cl(pH8.0)试剂C2.5μl 10×PCR Buffer，0.25μl Taq(5U/ul)，35.5μl ddH2O试剂D2.0μl dNTP(2.5mM each)，1.5μl MgCl2(25mM)，10pM VP01(0.5μl)，10pM VP02(0.5μl)试剂E50×TAE试剂F琼脂糖(1.2％)+溴乙锭(0.8μg/ml)按照以下程序进行操作1.样品处理和DNA的提取取鱼组织约0.1-0.5克，在样品中加入200μl试剂A，灭菌牙签捣碎，12000g离心2分钟，弃上清，用150μl试剂A和50μl试剂B重新悬浮沉淀，混匀。室温放置5分钟，100℃水浴1分钟。冷却至室温，12000g离心10分钟。取上清，加入400μl无水乙醇，室温放置5分钟，12000g离心5分钟，彻底去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇挥发，将沉淀溶于30μl灭菌双蒸水，即为DNA提取液。
2.创伤弧菌的特异片段扩增在一管试剂C中加入1μl DNA提取液，再加入8μl试剂D，10000g离心30秒。在PCR热循环反应仪上进行如下反应94℃加热变性3分钟；然后在95℃解链45秒钟，62℃复性30秒钟，72℃延伸30秒钟，共循环30次；在72℃保温10分钟后停止反应。
3.电泳和显色检测；反应结束后，取5-10μl反应液，与4μl V/V为0.25％溴酚蓝混合，用W/V为1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下检测，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有创伤弧菌感染或污染；反之则没有。
权利要求
1.一种快速检测创伤弧菌的试剂盒，包括(a)DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，试剂A含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；试剂B含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM三羟基甲基氨基甲烷；(b)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，试剂C含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；试剂D包括特异引物对VP01和VP02、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl2，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；VP01特指5′-ACCAGTGATTGTCTTGCACCACAA；VP02特指5′-GCGAACTCGCTTATCTCCGCTAA；(c)电泳和显色试剂，包括试剂E和试剂F，试剂E为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；试剂F含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml溴乙锭。
2.根据权利要求1中所述的一种快速检测创伤弧菌的试剂盒，其特征是每管反应试剂的配方为5.0μl 10倍聚合酶链式反应缓冲液，2.5单位热聚合酶，35.5μl灭菌双蒸水，4.0μl2.5mM dNTP，3.0μl 25mM MgCl2，10pM VP01，10pM VP02。
3.一种使用权利要求1中的试剂盒快速检测创伤弧菌的方法依次包括下列步骤(a).样品处理取0.1-0.5克样品，用100-400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；(b).DNA提取用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-100μl试剂B混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破裂，释放出DNA；10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2倍即240-800μl的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5-10分钟，10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中；即为DNA提取液；(c).聚合酶链式反应扩增以0.5-1μl提取的DNA作为聚合酶链式反应扩增的模板；取21-42μl试剂C与4-8μl试剂D混合；在热循环仪上对提取的DNA模板进行扩增，通过94℃-98℃解链2-5分钟；然后用93-95℃变性30秒-1分钟，54-64℃复性30秒-1分钟，72℃延伸30秒-1.5分钟，如此循环25-35次，最后在72℃保温8-12分钟，将创伤弧菌的特异片段增加到108mol以上；(d).电泳和显色检测取5-10μl扩增后的样品，与2-6μl V/V为0.25％的溴酚蓝混合，W/V为0.8-1.2％的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条300核苷酸对的条带，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有创伤弧菌感染或污染，反之则没有。
全文摘要
本发明涉及检测创伤弧菌的试剂盒及检测方法。试剂盒包括(a)DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，(b)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，试剂D中的特异引物对VP
文档编号G01N33/535GK1527057SQ03146929
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月25日 优先权日2003年9月25日
发明者陈偿, 胡超群, 陈 偿 申请人:中国科学院南海海洋研究所