一类封闭myc细胞增殖途径的染色质肽药物分子的制作方法

专利名称：一类封闭myc细胞增殖途径的染色质肽药物分子的制作方法
技术领域：
本发明属于人类基因组学和恶性肿瘤生物自身治疗途径/技术领域。本发明涉及一类在再生成体组织细胞更新过程中，封闭特定染色质模版上多米诺骨牌表型基因群顺势调控元件Cis-RE的生物活性染色质肽药物分子。这些药物分子能够特异性地牢固地结合到与大部分癌症发生相关的MYC原癌基因族和它们所驱动的下游相关基因染色质模版的增强子/启动子/沉默子上，长久地关闭由于MYC类基因的过度表达而导致的多米诺骨牌/Domino式基因转录调控瀑布/Transcriptional regulatory cascades失控而引起的细胞无控制增殖。通过重新构建癌细胞MYC基因族的运行轨道，将癌细胞由恶性表型转变为正常表型，恢复细胞的有序增殖调控。这些分子是可以用于治疗大部分癌细胞恶性无控制增殖的治本药物。
背景技术：
每天都有成千上万人被恶性肿瘤折磨致死，另外却有更多的人得以死里逃生，带瘤生存好多年，甚至完全痊愈；有证据表明，人体每天产生30-100个癌细胞。每天都有癌细胞在身体里不断地发生和消灭，但是大部分情况下，人却没有因为癌细胞的不断产生而生病。人类的身体本身表现出对癌的顽强的抑制能力，甚至治愈能力。那么身体究竟是通过什么方式治愈了许多患者的癌症，癌细胞又是通过什么机制，逃逸了身体的控制，致许多患者于死地？我们发现在人体内存在一些具有生物活性的染色质肽，它们是某种转录因子和DNA结合的结构域/DNA-binding Domain片段在基因转录过程中，转录因子特异性识别和结合在特征的调控元件/基因启动子上，激活基因的转录；然后变构和脱离调控元件；当转录因子驱动的下游基因多米诺骨牌式连动受到被某些外界条件限制，比如锚地和空间限制，表达的转录因子蛋白过量积累起来，就会激发蛋白酶复合体/proteasome反应而被降解成这些染色质肽，它们保留有原来转录因子对其DNA-底物的特异性亲和力，能够结合到转录因子编码基因和被调控的下游基因的结合位点而负反馈地封闭这些基因表达。许多导致肿瘤发生/恶化的原癌基因的过度转录都是通过这种生命体固有的“断匙关闭效应”封闭了自己和下游被调控基因的过度表达，从而牢固地关闭所在细胞的恶性增殖；这可能是许多癌症患者得以痊愈或者长期带瘤生存的根本原因；更多的患者死于恶性基因的持续过度表达导致的细胞过度增殖，可能是其身体没有能够引发出足够的“断匙关闭效应”的染色质肽，来关闭恶性基因的过度表达。因此，合成和补充这些染色质肽来关闭恶性基因的过度表达，进而关闭其所在肿瘤细胞的恶性化增殖，就有希望成为治愈癌症的最佳途径。我们发现了一些能够关闭某些关键恶性基因表达的染色质肽。
在生物体内每一种反应都受到Cis和Trans两个方向的调节。这种正反方向的调节，维持了生物生命活动的平衡有序。这种调节必然涉及到两个相互关联的调节分子。基于生物进化节俭的原理，一种分子在完成了一个方向的调节后，变构或者一级结构发生改变，减弱或抑制它所促进的反应，而成为另外一个方向的调节分子。Trans染色质肽和它的前体转录因子在功能上是互相诘抗的，通过这种方式，共同来源的分子完成Cis和Trans两个方向的调节。
染色质肽是一种寡聚肽，是生物体内一些转录因子和辅助蛋白的降解产物，一般含有3-100aa。它们是某种转录因子及辅助蛋白和DNA结合的结构域/DNA-binding Domain片段。这些染色质肽能够识别和结合到该转录因子基因本身启动子和它所驱动的下游相关基因启动子上，封闭这些启动子和关闭这些基因的失控表达。
细胞的自主性生长和增殖实质上是一种被其染色质模版规范下的基因转录的多米诺骨牌式连动，当这个连动网络被某些细胞内外因素干扰而阻挡时(比如接触抑制，锚地缺乏)，这个基因表达瀑布的上游就会淤积过多的转录因子蛋白质，进而激发蛋白酶复合体/proteasome/水解反应，降解掉这些垃圾废物，其中那些转录因子和其作用底物DNA之间识别和亲和的结构域/DNA-binding Domain/片段被保留下来，结合在底物DNA上，封闭和关闭了这个失控的基因表达瀑布和细胞生长/增殖活动，就像一把断柄的钥匙，封闭了锁孔，阻断了其它钥匙再来开门一样；因此，基因钥匙/转录因子的断匙反应和染色质肽是一种生命进化出来的防卫内源性基因突变导致的基因表达失控的生理功能。染色质肽是一类类似于抗体的物质，在恶性转录因子过度淤积后，身体会产生足够量的的染色质肽，一般情况下，可以监护和清除身体本身变异产生的“异物”，如，癌变细胞。当自身的防卫能力不足以击败这种“异物”，维护生命永久的生存时，通过补充染色质肽方式，补充和增强生命自身的防卫能力，就能够维护生命更长久的延续。我们用补充相关的染色质肽的方法，就可以控制内源性病原体-恶性细胞疾病。
Trans转录因子和其衍生的染色质肽之间的关系是功能拮抗。这种蛋白质/衍生肽之间功能拮抗现象有，HIF-1α/C-FOS/C-MYC这三个细胞增殖启动基因的启动子上都包含有组织发生的Cis-转录调控元件(即组织分化的Trans-转录调控元件)，HIF-1α上的红细胞发生的Cis-NFE2元件，C-FOS上的B-细胞发生的Cis-MITF元件和MYC上的T-细胞发生的Cis-NFAT元件，它们分明是在细胞发育成熟时，启动组织分化功能基因群的同时，在HIF-1α/C-FOS/C-MYC基因转录运动的染色质轨道上，封闭了胚胎干细胞转录因子的结合位点，从而重构了细胞的染色质表型，把胚胎期干细胞累进性增殖表型重构为成熟期分化细胞的动态平衡性增殖表型。
蛋白质/蛋白质或者蛋白质/DNA之间的特异性识别和结合是生命分子通讯活动的基本方式，二者之间的结合一般是硬性结构之间的镶嵌/钥匙-锁方式的结合。二种全序列分子的调节亚基/结构域之间结合，会引发功能亚基的变构和功能的行使，然后二种分子则相互分离，实现动态的功能或者信息传递的反式调节/Trans-regulating功能作用；当一种降解分子的结构域和另一种全序列分子的结构域之间结合时，就会形成某种静态和长久的顺式调节/Cis-regulating表型结合。因此，染色质肽/转录因子是一种生命分子网络稳定效应，而基因表达网络的断匙关闭效应则是一种细胞染色质模版和生长表型的稳定效应，关闭细胞于稳定的表型。从动态波动到静态稳定，这就是细胞/系增殖的动态平衡原理。
转录因子的结构域序列，即染色质肽序列，当序列足够长时，含有较多的疏水氨基酸，当它们处于游离态时，因为有低的水溶性而较难被蛋白水解酶所降解；当二者之间处于结合态时，这个结构域部分也会因为蛋白酶分子难以接近而不能被降解；由于结构域的这些化学特征，导致这些结构在蛋白酶复合体反应中经常幸免于难，疏水衍生肽也比全序列蛋白半衰期长，有效功能剂量要低得多。另外，我们选择用于药物治疗的染色质肽，含有较多的碱性氨基酸，有利于药物向微酸环境的癌块部位集中。
综上所述，细胞的自主性增殖活动，被限制在细胞内一个有限的空间里；基因表达和表达物蛋白质作用这两个多米诺骨牌式连动交织在一起的定向运动，实际上是一种多个基因群开关连动，一个基因群启动，活动后即关闭，接着启动下游基因群的活动；每个蛋白质正向活动完成后，需要将自己降解掉，为后面的活动让出活动空间；有时还要关闭这个蛋白质的表达或者作用，以便进入下一个蛋白质的连动；于是生命体在长期的进化中，修炼出这种一个蛋白质分子，完成一个功能活动的启动和关闭两个开关动作的省力协调效应。
传统的杀伤治疗是针对处于增殖状态的细胞的，实际上，许多重要的健康细胞，骨髓，上皮细胞等等都增殖得比肿瘤细胞还快。这些治疗都是以牺牲更多健康细胞为代价；这就是传统化疗，放疗和中医疗法的共同弊病。免疫治疗和基因治疗，是可以做到对恶性细胞的选择性的，特别是抗血管治疗甚至不伤及正常细胞。免疫治疗不能奏效是因为没有肿瘤细胞特异性的免疫原，现有的研究表明，恶性肿瘤细胞的抗原与正常细胞比较，只有量的差异，而没有性质的区别；目前，基因治疗不能奏效是因为选错了药物的作用靶位即把药物靶位定位在基因产品，瞬间表达后就瞬间消失的动态mRNA或者蛋白质上面，只能暂时地改变和干扰细胞的恶性动能，而不能永久地改变和封闭其恶性表型。只有把药物靶位定位在稳定静态的规范基因多米诺骨牌式连动的DNA轨道和基因表达的调控元件上，才能长久地改变和封闭细胞的恶性表型而实现根治。
MYC基因家族是一类与细胞接触通讯有关的转录因子编码基因。MYC类基因的表达和抑制与细胞的空间和锚地依赖性生长控制有关。目前在人体发现的MYC基因家族基因包括MYC，NMYC，LMYC三种基因。MYC家族基因具有相似的结构和密切的同源性。研究表明它们在生物体内有相似的功能。它们均含有3个外显子和2个内含子。虽然它们的第一个外显子没有显示同源性，但是这个外显子没有编码蛋白质。然而在外显子2和3中具有同源性的区域达到5个。羧基端序列同源性存在于MYC家族的85个氨基酸中，其中一个重要的碱性区域，三种MYC编码蛋白的氨基酸组成和序列有高度保守性和同源性，这是它们与DNA结合的结构域。这样，就提示一种可能性，设计一个或者一类分子，可以封闭所有MYC家族的基因。
正常情况下，人类MYC基因位于8q24上；NMYC基因定位于2p25；LMYC定位于1p32上。
自MYC被克隆和鉴定来，20多年医学研究文献有关MYC家族基因的研究论文已经超过万篇。MYC成为研究原癌基因和癌的治疗方法的重要靶位基因。
MYC编码的核内磷酸蛋白Myc，在核内分别与另外两种核内蛋白Max和Mad形成异源二聚体Myc/Max和Myc/Mad。同其它大部分转录因子一样，Myc有两个功能不同的结构域与其它蛋白及和DNA结合的Binding Dormain以及发挥调节功能活性的结构域。C端的85个氨基酸对于Myc与Mad，Max及DNA的结合是必需的。N端含有Myc的转录激活结构域，以及转录抑制，细胞周期调节，转化，细胞凋亡等所需的区域。N端除了与RB家族的蛋白P107相互作用外，还与α微管蛋白和一些新的衔接子蛋白BIN1，MM1，TAM，TRRAP和AMY1等相互作用，这些蛋白的结构以及它们对MYC作用的效应表明，它们和Myc的相互作用与转录调节系统以及细胞周期调节，染色质构建和细胞凋亡有联系。除了与Max和Mad结合外，Myc C端还参与若干促生长基因的转录抑制，在Myc介导的细胞转化中发挥重要作用。而它的C端与Mad和Max结合形成而异源二聚体Myc/Mad和Myc/Max，分别完成对MYC基因和它调控相关基因的Trans和Cis调节，就像开关的开与关闭的两个结构一样，主导MYC和相关基因的转录活性。除此之外，C端还与其它细胞蛋白YY1，AP2，BRCA1，TFIII和MIZ1相互作用；另外，人体内很多基因的表达活性和MYC有关，表明其调节功能的复杂性。
现在已经知道，Myc是一类转录因子。这个转录因子和它调控的相关基因，具有多方面的功能。细胞周期，细胞分化，细胞凋亡，细胞转化，血管生成，基因稳定性等，都与MYC有关。有研究表明，另外的一些与癌症发生有关的一些基因，如，Ras，它只有通过MYC的激活，才能导致癌细胞的恶性增殖。
现有的研究数据表明，人类大多数癌症患者恶性细胞内都伴随有MYC的过度表达，还有一些患者癌细胞内MYC拷贝数成倍数，甚至百倍数增加。研究表明，MYC基因在Burkitt淋巴瘤，非Burkitt淋巴瘤，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，胃肠癌，骨肉瘤，黑素瘤，畸胎瘤，粒细胞和浆细胞及B淋巴细胞白血病，恶性胶质瘤，神经母细胞瘤和小细胞肺癌，鼻咽癌恶性细胞内过度表达；另外一方面，现在大家认识到，激活原癌基因的协同作用是使细胞恶性转化的关键大多数情况下，癌症的发生与两个或者多个原癌基因突变有关，例如宫颈癌的发生与MYC和HRAS有关；乳腺癌与MYB，MYC，EGFR，HER2，HRAS和p53相关，肺癌与JUN，MYCN，MYCL，HRAS，RB1，p53，RAF1相关，这样的情况在人类癌症具有广泛性。随着对人类癌症的基因表达情况的调查积累的资料的增加，将可能会发现更多的恶性细胞内有MYC的异常表达。我们推测，在不同基因变异导致的细胞恶性化繁殖中，MYC起着关键的协同作用。
细胞的生长被其细胞核内染色质轨道所规范，阻止恶性生长只有从封闭和构型它的染色质轨道上做起。美国Stanford University的W.Felsher研究小组通过转基因鼠动物实验，把MYC简单地关闭，就转变/重构了细胞表型，从恶性表型(失控性增殖)重构成为良性(分化/凋亡)表型，分别实现了肝癌癌块在体内的萎缩和消亡(Nature.2004 Oct 28；431(7012)1112-7.Epub2004 Oct 10.)，骨肉瘤在活体内的萎缩和凋亡(Bernard WeinsteinScience 297(5578)Issue of 5 Jul 2002，pp.63-64.))和血液恶性肿瘤的消失(Felsher，D.W.& Bishop，J.M.Reversible tumorigenesis byMYCin hematopoietic lineages.Mol.Cell 4，199-207(1999)。这些试验结果证明了重构染色质表型的可行性。
封闭MYC基因或者清除和抑制表达产物活性的方法，都可以实现癌细胞的逆转。但是，采用封闭MYC的方法，可以从源头切断MYC转录因子的的来源。相对于后两种方法，封闭原癌基因有几点优势，第一，可以长久地防止表型良性化的癌细胞再次实现向恶性表型的逆转，第二，方法简便，第三，对人体没有副作用，而目前临床上使用的靶位为DNA的药物，对正常细胞有很强的副作用。
基于以上分析，封闭MYC基因和相关基因，重构MYC的染色质运行轨道，对多种癌症的治疗，有广泛的意义。

发明内容
本发明涉及的染色质肽，实质上是MYC族基因表达的转录因子和一类与其相关的转录因子及辅助蛋白的降解的寡聚肽分子，它们参与人类身体本身的细胞增殖的调控。转录因子分为两类，Trans转录因子和Cis转录因子。Trans转录因子来源的染色质肽，其作用一般与它们的衍生前体转录因子相反；Cis转录因子来源的染色质肽，其作用和它们的衍生前体转录因子作用相同。一些染色质肽的仿生分子与天然的染色质肽有相同的作用；这些转录因子突破控制的无序过度表达导致人体自身对癌细胞恶性生长监视和清除系统的失控，启动了肿瘤细胞恶性增殖，而从它们衍生/降解而成的染色质肽关闭了这些肿瘤细胞的MYC类基因的无序过度表达，从而不断地实现了许多癌症患者的“不治而愈”，仿生分子也有类似的作用；本技术包括，从人类基因组数据库中筛选出的儿种染色质肽和这些染色质肽的衍生物，它们可以封闭原癌基因MYC家族和其调控的下游相关基因，实现MYC类基因运行轨道的重构，使癌细胞由恶性表型向正常细胞表型转化。对于逆转表型的癌细胞，如果是分化的细胞，将会逐步死亡或凋亡；如果是有分化能力的细胞，如各种干细胞，将会按照正常的细胞增殖或者分化。这些染色质肽可以用于人类各种恶性肿瘤的治疗和预防，是具有治本疗效和预防作用的生物活性药物和仿生药物。
因此，本发明的目的是提供1、一类能够特异性封闭人类和哺乳动物癌细胞MYC细胞增殖途径的染色质肽药物分子，该类分子是从基因数据库筛选出来的DNA亲和结构域序列或它们的仿生分子，通过对MYC蛋白转录因子调控元件的顺反子分析得到，包含3-100个氨基酸残基，它们能够特异性牢固地结合到MYC家族基因的启动子和其表达的转录因子驱动的下游基因启动子上，长久地关闭MYC家族基因和相关下游基因，终止由于MYC家族基因突变和相关基因变异引起的MYC家族基因的过度表达，和/或终止MYC家族基因调控的下游转录因子和细胞生长因子基因的过度表达，从而长期关闭通过MYC家族基因逃脱细胞增殖调控而因起的细胞恶性增殖途径。
2、以上第1项的染色质肽药物分子，其为3-100aa范围的任何能够封闭MYC家族基因和与MYC增殖调控途径相关基因的所有氨基酸序列的染色质肽。
3、以上第1项的染色质药物分子，其选自如序列表序列1-7中的7个染色质肽药物分子(表1，序列表)中的一种或多种，或者与这些分子有最小3个氨基酸同源系列的能够封闭MYC家族基因或与MYC增殖调控途径相关基因的所有氨基酸序列的染色质肽。
4、与以上第2项中所述7个药物分子具有3个氨基酸最小同源系列而且能够封闭MYC家族基因启动子或MYC类转录因子调控的下游相关基因的任何氨基酸序列。
5、对以上第1，2，3或4项所述的的染色质肽药物分子的N端和/或C端和/或侧链基团进行化学修饰，或者通过氨基酸增删，替代所得到的所有能够封闭MYC家族基因启动子或MYC类转录因子调控的下游基因的染色质肽衍生物。
6、一种药物组合物，其包含了药学有效量的如以上第1-5项的任何一项所述的染色质肽药物分子或衍生物和任选的药学可接受的载体。
7、根据以上第6项的药物组合物，其为注射制剂，口服胶囊和缓释剂。
8、以上第1-5项的任何一项所述的染色质肽药物分子或衍生物在制备预防或治疗人或哺乳动物恶性肿瘤的药物中的应用。
9、以上第1-5项的任何一项所述的染色质肽药物分子或衍生物，包括用任何方法获得的封闭MYC细胞增殖途径染色质肽。
封闭MYC家族基因的封闭剂是通过对MYC类蛋白转录因子调控元件的顺反子分析筛选出来的。
MYC家族基因封闭剂-染色质肽药物分子能够封闭细胞MYC增殖途径的相关基因的DNA-亲和结构域。
MYC基因封闭剂-染色质肽药物分子封闭MYC家族基因及下游相关基因，具有高度特异性，除了封闭MYC家族基因及其下游相关基因外，对其它基因的活性没有影响。另外它们对肿瘤细胞的MYC家族基因及下游相关基因DNA-亲和结构域有比正常细胞等位基因DNA-亲和结构域高得多的亲和力。
这些药物分子能够透过细胞膜，核膜，到达靶部位，因此，可以通过肌肉注射，静脉注射，口服胶囊，静脉输液途径及肿块部位原位注射和皮肤渗透的方法给药。给药量根据病人的具体情况，例如体重，年龄，具体的疾病和病情，以及医生的临床经验来决定，但通常可以是0.05-30mg/天，可以分一次或多次给药。
另外，这些药物分子不能抵抗胃酸和胃蛋白酶的消化水解作用，因此，不能直接口服用药。
这些药物分子通过抑制MYC家族基因和下游相关转录因子及相关的生长因子的过度表达，可以使与MYC家族基因相关的恶性肿瘤细胞由恶性表型向正常细胞表型转变，用于与MYC家族基因相关的恶性肿瘤的治疗和预防。
目前的研究资料表明，大多数恶性肿瘤的发生，伴随着MYC家族基因过度表达，有些是由于MYC家族基因本身的突变造成的，有些是其它基因突变导致了MYC基因的激活；另外从理论上讲，MYC家族基因调控的下游转录因子和相关的生长因子的突变，也可以导致与激活MYC家族基因相同的细胞恶性表型，因此，封闭MYC家族基因和下游相关基因，对大部分恶性肿瘤的预防和治疗，有广泛意义。
这些药物分子对人体安全，不影响器官和组织的正常代谢，不影响组织和细胞更新，不影响人的生长发育。
这些药物分子，可以封闭MYC基因家族所有的成员的表达，包括C-MYC，NMYC和LMYC和它们调控的下游相关基因，这保证了药物的广谱疗效。
对这些染色质肽进行化学加工修饰，可能能够提高细胞膜，核膜的通透能力，延长半衰期，加大对靶位的亲和力，因此提高疗效。
这些药物分子，不管用什么方法获得，只要有本专利设计的分子特征，都有同等效果。
附图简述

图1七种染色质肽药物对小白鼠4T1乳腺癌的生长的抑制作用。原始肿瘤部位的耐6-thioguanine细胞计数。
近年来，对MYC这个原癌基因的研究资料很多。研究发现，大部分实体恶性肿瘤患者和流体癌症患者的恶性细胞内，MYC的表达量很高，有些癌组织内MYC基因有几倍甚至100倍于正常细胞的拷贝数。在成年人的正常组织细胞内，MYC表达量甚微。甚至测不出它的表达，而在胎儿和儿童的快速生长的组织器官内，MYC有较高的表达量。
有人简单封闭或者删除MYC基因，就能实现癌细胞表型向正常细胞表型的转化；用单克隆抗体清除MYC的表达产物，也可以暂时抑制细胞的恶性繁殖。这些研究说明，许多恶性肿瘤的发生与MYC类基因的过度表达有关。MYC类基因的易位和点突变可以激活它们的表达。另外，可能存在其它的基因突变导致MYC类基因的激活，如P53的失活。目前的研究，封闭MYC基因的方法主要是反义RNA和DNA，没有获得突破性进展，因而没有解决根本问题。第一，RNA的稳定性比较差；第二，在人体内，RNA和DNA很难自然透过细胞膜和核膜；第三，通过病毒载体传输反义DNA和RNA，技术复杂，而且其风险很难判断。而通过单克隆抗体封闭MYC的表达产物，不能彻底阻断恶性蛋白的源头，只能暂时缓解肿瘤的恶性增殖，另外由于蛋白在体内的半衰期比较短，抗MYC编码蛋白的单克隆抗体的作用和效用时间是非常有限的。
目前了解到，MYC途径的细胞增殖调控是通过细胞生存空间(细胞之间直接接触通讯)的控制在身体发育成熟后，当有些组织细胞受伤和死亡时，就需要启动临近细胞的增殖补充，这种细胞增殖仍然要受到身体有限空间的限制，正常实体组织细胞都是受到临近细胞的接触抑制和锚地依赖性的增殖控制。实体组织细胞，包括骨髓细胞和某些流体恶性肿瘤(其来源在骨髓和其它的造血器官)逃逸了这两种控制，才能够导致细胞原位恶性增殖和血液循环中异位转移。现在已经知道，逃逸这种细胞增殖的身体空间控制的出口就是这个著名的原癌基因MYC，它的上游调控元件MAD/MAX接受细胞接触抑制等转录抑制通讯信号，调控元件Myc/MAX则接受细胞锚地依赖性等转录促进通讯信号，这个基因表达的转录因子蛋白Myc启动大量的促进细胞增殖的生长因子，并且直接启动细胞增殖/Cell cycle基因群。这种细胞通讯网络上任何一个抑制性信号蛋白的编码基因发生缺失或者突变，都可能导致细胞进入恶性/累进性增殖/Progressive Proliferation途径；于是，Myc驱动的Cell cycle基因群转录瀑布就突破了这种身体空间控制的防线。实际上，MYC的过度表达确实是许多恶性细胞的共同特征，因此，有效地关闭这个MYC基因的转录，已经成为一种在研究阶段的通常的癌症治疗策略。
用染色质肽分子关闭MYC基因，有很多优点。我们设计关闭MYC类基因的染色质肽，是人体自身具有的的天然分子或者仿生分子，对正常细胞和组织器官没有伤害。染色质肽具有较小的分子量(我们采用的染色质肽为3-100肽)易于透过细胞膜和核膜。此外，这些染色质肽有较多的碱性氨基酸，整个分子呈碱性，有利于药物分子向偏酸性的恶心肿块部位集中。此外这些染色质肽在有较大的分子量时，带有较多的疏水氨基酸，这些疏水氨基酸使药物分子在水溶液里，形成特殊的水相内结构，可以抗拒蛋白酶的水解，因此，这些药物分子具有较好的体内稳定性和较长的半衰期。
最重要的是，这些药物分子靶向的特异性比较高。第一，除了和转录因子MYC基因的启动区及其下游调控的相关基因的启动区结合外，人类基因组没有其它部位可以和这些药物分子结合，这种特异性保证了除了MYC类基因和下游被调控的相关基因外，其它基因不会被封闭，这是这些药物分子安全性的一个重要方面；第二，很少正常细胞的MYC及相关基因被封闭，而癌细胞的等位基因能与这些染色质肽特异结合，这可能是正常细胞的MYC基因编码区域的DNA处于高度凝缩状态，不易与这些染色质肽结合；而在恶性细胞，MYC编码基因被激活，处于舒展状态，易于和染色质肽药物分子结合。
但是，研究表明，尤其是在胎儿和儿童发育期，MYC能够直接驱动cycle基因群的启动分子ClycD的转录，如果用这些染色质肽封闭cycle基因群，实际上就关闭了许多身体所必需的血液细胞和上皮细胞等正常细胞增殖更新的重要功能途径。但是，正与我们对转录因子HIF-1α的分析一样，转录调控瀑布是一个复杂的网络而不是单一通路。除了转录因子MYC直接驱动cycle基因群的启动分子ClycD的转录，可能还有有别的转录因子驱动cycle基因群的启动分子ClycD的转录。现有的研究结果证明，与MYC类基因相关的细胞增殖调控网络，不是直接单一通道，而是网络系统。
在正常成体内，MYC表达量很低或者根本测不出它的表达，但是，从进化角度看，确实如大家的共识那样，人类进化过程没有任何理由保留一个专门的致癌基因。我们推测，MYC可能在幼体发育和成体某些紧急情况下启动，促进细胞繁殖。在成年人的正常组织内，MYC基因处于沉默状态或者表达量相对低微。
从上述分析看，我们设计的封闭MYC基因和相关基因的染色质肽药物分子对人体是安全的。但是关于人类基因调控网络细节，很多部分目前还处于未知状态，Myc的全部作用还不是完全被认识。任何靶向目标为MYC基因的药物分子的安全性应该通过其它能够直接证明其安全性的试验来说明。动物学安全性试验结果表明，兔和小白鼠在注射剂量达到4mg/kg体重时(相当于人体设计用量的80倍)，长期观察，动物的健康没有受到任何影响。选择平均体重在1500g的大白兔和15g的小白鼠进行试验，结果表明，药物对大白兔和小白鼠的体重增长，没有任何影响(参见实施例)。
基于以上分析和试验，我们设计了封闭MYC家族基因和调控网络相关基因的染色质肽药物分子，用于人类恶性肿瘤的治疗。药物分子和靶向位置见表1和序列表。
表1药物分子，药物分子在MYC上的靶位和药物分子衍生来源的转录因子及辅助蛋白

说明所有列出的染色质肽序列，都可以封闭MYC-HUMAN。
表2 染色质肽衍生来源的转录因子及辅助蛋白和它们的功能作用

实施例以下通过实施例来举例说明本发明。
实施例1通过固相肽合成技术(SPPS)合成序列表中序列1-7的多肽，包括将用保护基保护的氨基酸分步添加到增长的寡肽链上，该寡肽链锚固于化学稳定的颗粒上，以便能通过简单过滤将合成的肽与试剂和溶剂分离，合成结束后，将链从载体上裂解下来，再进行提纯。
实施例2封闭MYC细胞增殖途径的染色质肽药物分子动物药效试验封闭MYC细胞增殖途径封闭剂对小白鼠乳腺癌的抑制作用接种后动物用药材料方法雌性裸鼠HHc，6-8周龄，购自青岛Hailand研究开发中心。
白鼠乳腺肿瘤细胞4T1，来自于青岛Hailand研究开发中心。
试验用染色质肽药物(序列1-7)，化学合成。纯度98.5％。
乳腺部位用0.1ml含癌4T1细胞(105)的PBS悬浮液无菌接种到健康雌性鼠的乳腺。接种量根据经验确定，一般以在接种后25天，没有给予药物的老鼠，长出直径10mm的肿瘤为准。接种后第十天，当肿块直径达到4-5mm时，开始每5天通过肌肉注射给药一次，对照组注射PBS，剂量为0.08mg/kg体重。每五天给药一次，直到第25天，共给药4次。每组5只鼠。第30天，观察测量乳腺肿块大小(结果见表2)并取乳腺原癌变部位组织用colongenic方法细胞进行培养鉴别试验(1)。取老鼠原始癌症乳腺部位组织块5mm×5mm×5mm，再取中央部位0.1g，切碎，用5ml酶混合物37℃振荡消化(1XPBS，1mg/ml四型胶原酶)2小时，消化后，样品用直径70微米的细胞尼龙过滤器过滤，用PBS洗涤2次。悬浮细胞，用含有60μM thioguanine RPM培养基1640在细胞培养器里进行系列稀释，检测恶性增长。因为4T1细胞对thioguanine有抗性，培养14天后，扩散的癌细胞形成肿块。用甲醇固定，用0.03％亚甲基绿染色，对细胞计数。(结果见图1)结果分析表3 染色质肽药物对小白鼠4T1乳腺癌生长的影响

附 接种肿瘤后第30天用卡尺测量。因为肿块部位肿块形状不规则，取最大径和最小径平均值。染色质肽编号与序列表同。
图1示出了七种染色质肽药物对小白鼠4T1乳腺癌的生长的抑制作用。原始肿瘤部位的耐6-thioguanine细胞计数。染色质肽编号与序列表同。
用药后30天，1-7号染色质肽药物处理组的试验鼠肿块完全消失。所有给药治疗组癌块在给药第5天开始萎缩，其中，1号和2号多肽处理组消失最快，分别在第一次治疗后第9天和第16天，肿块完全消失。
细胞计数表明，所有药物处理组的癌变原始部位的耐6-thioguanine癌细胞数都降低到未用药物处理对照组的10％以下。
上述结果表明，1-7号染色质肽对小白鼠乳腺癌有较强的抑制作用。需要说明的是，MYC类染色质肽封闭剂，逆转了癌细胞的表型。但是，可能存在少量没有死亡或凋亡的逆转了的有致癌基因突变的细胞。这些细胞是否会逆转，再次引发恶性生长，需要进一步试验加以证明。
参考文献1 Pulaski，B.A.& Ostrand-Rosenberg，S.(1998)Cancer Res.58，1486-1493.[Abstract]实施例3狗晚期乳腺癌，大范围转移。先测定乳腺癌病狗C-MYC，LMYC，NMYC基因表达量，结果NMYC表达量为正常组织的128倍。用KRRTHNVLERQRR氨基酸序列的染色质肽封闭剂治疗，皮下直接注射，每次2mg，每5天一次。第5天癌肿开始萎缩，第30天检查癌肿彻底消失，乳腺部位有疤痕。
利用这个序列的染色质肽可以封闭因为NMYC过度表达而导致的分化细胞的去分化而引起的恶性肿瘤细胞的无序增殖。在肿瘤发生早期可以直接用药而无需手术及放射治疗。在肿块比较大时，可以在手术前用药，在合适时间切除已经转变为良性细胞表型并且萎缩的肿块。也可以手术后用药，对手术可能没有完全清除的少量恶性细胞进行表型转化。
实施例4专利第一发明人，鼻咽癌，两次化疗。第二次化疗后3年，复发。测定鼻咽癌病人恶性细胞C-MYC拷贝数为55，并且异常表达。经过检查，肺部转移，没有其它部位的转移扩散。用0.05mg氨基酸序列为RSTHNELEKNRR的染色质肽和0.05mg序列为NSLDPGLFVEST的染色质肽，配成5ml生理盐水注射液，对准肿块部位4个边角和肿块中心，直接注射，15天一次；通过静脉注射给药，每次10mg，每15天一次；连续用药3个月。原发部位和肺部肿块在第一次用药后3个月消失，活体切片，无癌细胞。
实施例5测定胃癌病人恶性细胞C-MYC异常表达，主瘤块65mm×70mm×44mm，且扩散到肝部。用静脉注射的方法第一次给药缺氧封闭剂生理盐水溶液(5mg/250ml)(我们发明设计的药物分子)，第六天主癌块吐出。10天后同样方法再次给药(2mg/100ml)，20天后检查，大部分癌组织坏死，癌块疏松吐出。用氨基酸序列为VKRRTHNVLERQRR的染色质肽生理盐水溶液静脉注射，第一次剂量为5mg/250ml，以后每间隔15天同样方法注射，每次2mg/100ml，连续用药4个月。4个月后活组织检查，无癌细胞，病理部位细胞C-Myc表达微量，恢复到正常部位水平。
SEQUENCE LISTING<110>王成球 卞小庄 何谧<120>一类封闭MYC细胞增殖途径的染色质肽药物分子<130>
<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13<212>PRT<213>人工设计<220>
<223>针对MYC基因的启动子设计<400>1Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg1 5 10<210>2<211>14<212>PRT<213>人工设计<220>
<223>针对MYC基因的启动子设计<400>2Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg1 5 10<210>3<211>12<212>PRT<213>人工设计<220>
<223>针对MYC基因的启动子设计<400>3Arg Ser Ser His Asn Glu Leu Glu Lys His Arg Arg1 5 10<210>4<211>13<212>PRT<213>人工设计<220>
<223>针对MYC基因的启动子设计<400>4Lys Arg Ala His His Asn Ala Leu Glu Arg Lys Arg Arg1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>人工设计<220>
<223>针对MYC基因的启动子设计<400>5Arg Ser Thr His Asn Glu Leu Glu Lys Asn Arg Arg1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>人工设计<220>
<223>针对MYC基因的启动子设计<400>6Asn Ser Leu Asp Pro Gly Leu Phe Val Glu Ser Thr1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>人工设计<220>
<223>针对MYC基因的启动子设计<400>7Arg Glu Val His Asn Lys Leu Glu Lys Asn Arg Arg1 5 10
权利要求
1.一类能够特异性封闭人类和哺乳动物癌细胞MYC细胞增殖途径的染色质肽药物分子，该类分子是DNA亲和结构域序列或它们的仿生分子，包含3-100个氨基酸残基，它们能够特异性牢固地结合到MYC家族基因的启动子和其表达的转录因子驱动的下游基因启动子上，长久地关闭MYC家族基因和相关下游基因，终止由于MYC家族基因突变和相关基因变异引起的MYC家族基因的过度表达，和/或终止MYC家族基因调控的下游转录因子和细胞生长因子基因的过度表达，从而长期关闭通过MYC家族基因逃脱细胞增殖调控而因起的细胞恶性增殖途径。
2.根据权利要求1的染色质肽药物分子，其为3-100aa范围的任何能够封闭MYC家族基因和与MYC增殖调控途径相关基因的所有氨基酸序列的染色质肽。
3.根据权利要求1的染色质药物分子，其选自如序列表序列1-7中的7个染色质肽药物分子中的一种或多种，或者与这些分子有最小3个氨基酸同源系列的能够封闭MYC家族基因或与MYC增殖调控途径相关基因的所有氨基酸序列的染色质肽。
4.与权利要求3中所述7个药物分子的任意一个具有3个氨基酸最小同源系列而且能够封闭MYC家族基因启动子或MYC类转录因子调控的下游相关基因的任何氨基酸序列。
5.对权利要求1，2，3或4所述的的染色质肽药物分子的N端和/或C端和/或侧链基团进行化学修饰或者通过氨基酸增删所得到的所有能够封闭MYC家族基因启动子或MYC类转录因子调控的下游相关基因的染色质肽衍生物。
6.一种药物组合物，其包含了药学有效量的如权利要求1-5的任何一项所述的染色质肽药物分子或衍生物和任选的药学可接受的载体。
7.根据根据权利要求6的药物组合物，其为注射制剂，口服胶囊或者缓释剂。
8.权利要求1-5的任何一项所述的染色质肽药物分子或衍生物在制备预防或治疗人或哺乳动物恶性肿瘤的药物中的应用。
9.权利要求1-5的任何一项所述的染色质肽药物分子或衍生物，包括用任何方法获得的封闭MYC细胞增殖途径染色质肽。
全文摘要
一类能够特异性封闭人类和哺乳动物癌细胞MYC细胞增殖途径的染色质肽药物分子，该类分子是DNA亲和结构域序列或它们的仿生分子，包含3－100个氨基酸残基，它们能够特异性牢固地结合到MYC家族基因的启动子和其表达的转录因子驱动的下游基因启动子上，长久地关闭MYC家族基因和相关下游基因，终止由于MYC家族基因突变和相关基因变异引起的MYC家族基因的过度表达，和/或终止MYC家族基因调控的下游转录因子和细胞生长因子基因的过度表达，从而长期关闭通过MYC家族基因逃脱细胞增殖调控而因起的细胞恶性增殖途径。
文档编号A61K38/02GK1785432SQ20051011661
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月26日 优先权日2005年10月26日
发明者卞小庄, 王成球, 何谧, 窦德献 申请人:王成球, 卞小庄, 何谧