一种用于检测溴氰菊酯的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测农药溴氰菊酯的试剂盒，所述的试剂盒由试剂组和包被板组成，所述试剂组包括浓缩PBS缓冲液、显色底物、浓缩洗涤液、终止液、溴氰菊酯标准溶液、溴氰菊酯酶标抗原，溴氰菊酯半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10万倍。本发明克服了传统的理化分析方法繁琐复杂，成本较高，分析速度较慢的问题，提供了简洁，快速，灵敏，准确的免疫分析技术。
【专利说明】一种用于检测溴氰菊酯的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学分析【技术领域】的一种定量检测农药溴氰菊酯含量的试剂盒及其使用方法，涉及到有机化学合成、免疫化学、生物化学等技术，尤其适用于蔬菜、茶叶中溴氰菊酯残留的快速检测。
【背景技术】
[0002]拟除虫菊酯(Pyrethroids)是一类重要的仿生性杀虫剂,是国家提倡推广的农药产品，据专家预测，仿生农药仍将是21世纪新农药开发的热点。我国从20世纪70年代就开始对这类杀虫剂进行研制，它的合成和应用是继有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯杀虫剂之后的一个新突破，也是杀虫剂史上的第三个重要的里程碑。它是目前使用面积广、用量大的农用及卫生杀虫剂，占杀虫剂总产量的20%，占整个杀虫剂使用面积的25%。随着其使用量和品种的不断增加，这类农药的抗性和残留问题已引起人们的广泛关注。为此，对农药溴氰菊酯的残留限制也越来越严格。我国对于溴氰菊酯在农产品中的残留，有较严格的检测标准
[0003]目前对于溴氰菊酯农药检测的方法主要为气相色谱法，正相高效液相色谱法和微型层析柱净化毛细管气相色谱法。但这些方法都存在检测时间长，前处理复杂，消耗大量溶齐U，需昂贵仪器等缺点，并且不能进行现场在线检测或跟踪监测。因此，迫切需要发明一种简便，快速，灵敏的检测方法。
[0004]酶联免疫吸附分析，即ELISA法。它利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，即保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析，即在反应中的每一步都有洗涤过程，因而除去了未反映物质和干扰物质。
[0005]半抗原是指，能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。
[0006]通常，具有免疫原性的物质分子量应大于10000,而农药的分子量一般均小于1000, 一般不能刺激机体产生针对农药抗原决定簇的特异性抗体，因此必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性，这也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的结构对抗体的选择性至关重要，半抗原分子的设计与合成是小分子免疫分析技术的关键所在。半抗原分子的设计应以农药亲体以及有毒理学意义的代谢产物的分子结构为目标化合物，针对被测定对象是单一农药或某一类农药，设计中应相应地突出特定农药的分子结构或一类农药中共有的基本分子构架(即母核)，合成相应的单一特异性抗体和簇特异性抗体。对不具备活性基团的农药分子通常以直接衍生化或者以原料合成，也可用待测农药代谢或降解产物作为半抗原。对于某些分子太小和不稳定的农药，可合成其衍生化的半抗原。一般理想的半抗原分子应尽量具备与待测物类似的立体化学特征，以减少免疫交叉反应性，提高抗体的特异性；同时，要保证半抗原与载体的大分子复合后，半抗原的特征结构能最大限度地被免疫活性细胞所识别，以制备出具有预期选择性和高亲和力的抗体。人工抗原是半抗原与大分子载体蛋白偶联得到的完全抗原。使用载体不是简单地增加半抗原的分子量，更重要的是利用其较强的免疫原性诱导机体产生免疫应答，从而使机体产生针对半抗原及人工抗原的特异性抗体。
[0007]免疫分析技术的关键是半抗原的分子设计，合成和人工全抗原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该领域重要的研究内容。这一技术已经成为微量分析研究的崭新领域，可与传统分析方法并列成为一项新的分析途径。此类溴氰菊酯人工抗原和特异性抗体以及以此为基础建立免疫分析方法尚未见报道。
[0008]专利申请200810153758.3是关于农药溴氰菊酯人工半抗原及抗体的制备，
[0009]使用了结构式
[0010]
【权利要求】
1.一种用于检测溴氰菊酯的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒由试剂组和包被板组成，所述的试剂组包括: (1)浓缩PBS缓冲液:40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用时用双蒸水5倍稀释； (2)显色底物:四甲基联苯胺-双氧水溶液； (3)浓缩洗涤液:含1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释； (4)终止液:1.25M的硫酸； (5)溴氰菊酯标准溶液:其溴氰菊酯标准溶液母液为lmg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到100yg/mL后，再按1:4稀释6个梯度； (6)溴氰菊酯酶标抗原:溴氰菊酯半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10万倍； 所述的包被板是将制备好的抗体溶于50mmol,pH9~10的碳酸缓冲液中，配制成IOmg/ml的包被液，酶标板每孔加100 μ L包被液，常温静置12-16小时，再将包被好酶标板的每孔用吐温20的磷酸盐缓冲溶液0.05% (ν/ν)洗涤3次；酶标板每孔加入200 μ L，1%的BSA/PBS封闭液，封闭一小时，再将封闭好的酶标板的每孔用吐温20的磷酸盐缓冲溶液0.05%(ν/ν)洗液洗涤3次，冻干后真空包装，于4°C保存； 上述使用的抗体采用如下步骤制得: 免疫:免疫动物采用雄性新西兰大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共进行6次免疫，加强免疫分别在初次免疫后第2周，第4周和第6周进行三次，以后两次为一个月进行一次，从第3次免疫后·开·始采血测效价，采血时间为免疫后第10天； 初次免疫:取Img人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； 加强免疫:取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； 抗体纯化:定时检测动物抗体效价，当抗体对包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化,制备IgG抗体； 上述所述人工抗原采用如下方法制备: (1)合成6-氨基己酸甲酯 反应式:
2.—种权利要求1所述试剂盒用于检测溴氰菊酯的含量，其特征在于，包括如下步骤:(1)室温下样品的前处理； (2)检测前，将试剂盒打开，所有试剂和标本都必须在室温下平衡1-2小时； (3)加样与竞争反应:将用NaOH处理30分钟的待测物溶于PBS中并梯度稀释，溴氰菊酯酶标抗原也溶于PBS中，加样时酶标板每孔加入100 μ L待测物和溴氰菊酯酶标准溶液，竞争反应I小时； (4)显色:显色底物使用四甲基联苯胺-双氧水溶液，酶标板每孔加150μ L四甲基联苯胺-双氧水溶液，显色20分钟后每孔加50 μ L15mol/L的硫酸终止，反应液在自动酶标仪上读数。
【文档编号】G01N33/543GK103529198SQ201310500092
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】温雷 申请人:天津九鼎医学生物工程有限公司