可溶的免疫反应性的苍白密螺旋体TpN47抗原的制作方法
【专利摘要】本发明涉及苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)的可溶的变体，所述变体包含完整TpN47蛋白分子的至少结构域B，或至少结构域A和B，任选地结构域D，条件是全部抗原缺少TpN47的结构域C(氨基酸224至351)。TpN47抗原可以与蛋白伴侣融合。此外，本发明涵盖编码抗原的DNA，生产这些抗原的方法以及这些抗原在用于在分离的样品中检测针对苍白密螺旋体的抗体的免疫诊断测定法中的用途。
【专利说明】可溶的免疫反应性的苍白密螺旋体TpN47抗原发明领域
[0001]本发明涉及苍白密螺旋体抗原47 (TpN47)的可溶的，稳定的和免疫反应性的变体，所述变体包含至少TpN47蛋白分子的氨基酸残基63至174 (即结构域B)，条件是抗原缺少TpN47的氨基酸224至351 (即结构域C),其中TpN47与蛋白伴侣(chaperone)融合。本发明还涉及包含结构域B和D或结构域A+B和D的可溶的苍白密螺旋体抗原47 (TpN47抗原)，条件也是这些抗原缺少结构域C。此外，本发明涉及生产这些可溶的，稳定的和免疫反应性的TpN47变体的方法以及这些抗原在免疫诊断测定法中的用途，所述免疫诊断测定法目的在于检测分离的样品中针对苍白密螺旋体的抗体。
_2] 发明背景
[0003]苍白密螺旋体属于螺旋体细菌家族并且是梅毒的病原体。梅毒，也称为梅毒(Lues)，主要是通过性接触传染的。苍白密螺旋体也能够在怀孕期间从母亲传递到婴儿。该疾病的特征是不同的临床阶段和长时间的潜伏的、无症状的感染。许多人并未注意到症状并且因此很多年并未意识到其梅毒感染。初期感染是有限的并且通常导致小的无痛溃疡(初始阶段，“梅毒I”)。如果未用青霉素治疗，疾病进入第二阶段梅毒II (约感染后8周)，引起流感样症状，不痒的皮疹和肿胀的淋巴结。在一些年后，在梅毒III阶段，在全身出现梅毒性节。最终阶段(梅毒IV)特征是中枢神经系统的破坏，最终导致神经学和心脏病学病症、全身麻痹、共济失调、痴呆和失明。
[0004]尽管自从在20世纪中期引入青霉素以来已经获得了有效的疗法，梅毒仍然是重要的全球卫生问题。强制鉴别患有密螺旋体属感染的患者，以支持抗生素疗法并因此预防梅毒传播。因此，有必要提供可靠的诊断工具例如免疫测定法，用于检测针对苍白密螺旋体的抗体。但是，为了用作血清学应用中的特别的化合物，重组蛋白必须符合若干要求例如溶解性，稳定性和抗原性。
[0005]苍白密螺旋体(梅毒感染的病原体)的膜缔合多肽中的一种是TpN47，由434个氨基酸残基组成的大的蛋白质。在针对密螺旋体属的体液免疫应答中，TpN47已经被描述为免疫优势的(Folia Microb1l.(2003) 48 (4)，549-553)，并且针对TpN47的抗体常见于来自密螺旋体属感染的个体的人血清中。因此，重组TpN47的可溶的并且抗原性的变体是建立用于检测密螺旋体属抗体的、组合了高灵敏性和特异性的免疫测定法的无价成分。在最好的情况下，此类抗原应当使得能够检测IgG和IgM分子。
[0006]文献中已经描述了TpN47 的重组变体。在 Journal of Immunology (1996) Jul 15 ；157(2):720-31, Baughn等人中报告了涵盖TpN47的整个序列的12_mer多肽(重叠8个氨基酸残基，平移4个氨基酸残基)的表位扫描。基于此扫描，作者描述了多达10个免疫优势的TpN47片段，范围从9至29个氨基酸残基长。也已经描述了 TpN47的晶体结构和结构域拓扑学(Journal of B1logical Chemistry (2002)，277 (4)，41857-41864，Deka 等人)。
[0007]用于检测密螺旋体属抗体的免疫测定法是本领域已知的。例如，Rostopira等人(Folia Microb1l.48 (4)，549-553，2003)描述了使用 TpN17 和 TpN47 抗原的组合诊断梅毒的免疫测定法，将TpN47鉴定为免疫优势抗原之一。在此公开物中，全长TpN47用作抗原。
[0008]我们在大肠杆菌宿主(BL21/DE3)中过量生产了 TpN47的全长变体并且成功地将TpN47抗原制备为均质。但是，我们使用全长形态的TpN47的初始实验清晰地揭示了该蛋白质在高于35°C的温度倾向于聚集。尽管融合了串联蛋白伴侣融合体例如EcSlyD-EcSlyD或甚至(更加热稳定的)EcSlpA-EcSlpA，全长TpN47在高于35°C的温度不可避免地聚集成高分子量缔合物。因为已知苍白密螺旋体是相当温度敏感的病原体，其主要膜蛋白之一共享温度敏感性的这一发现可能看起来并不令人惊讶。无论如何，蛋白质成分的热诱导的聚集过程在免疫测定法中通常导致信号丢失或特异性丢失。因此，全长TpN47 (甚至与增强溶解性的蛋白伴侣例如SlyD或SlpA融合)甚至在适度升高的温度(>35°C )倾向于聚集的事实，清楚地排除了此分子在DAGS形式的敏感免疫测定法中的简单和直接应用。
[0009]尽管有关于TpN47的详尽的结构知识(Deka等人Journal of B1logical Chemistry (2002)，277 (4)，41857-41864)，现有技术并未公开TpN47的显著的热稳定性，也未公开这样的TpN47抗原变体，所述变体克服热诱导的聚集和在目的在于检测样品中针对苍白密螺旋体的抗体的免疫测定法中伴随的敏感性丢失的问题。
[0010]Guo 等人(Xiamen Daxue Xuebao-Ziran Kexue Ban (2008), 47 (6), 874-878)描述了在大肠杆菌中重组表达的特别的可溶的TpN47N-或C-末端截短的突变体。然而，并未解决全长TpN47蛋白的热不稳定性和聚集倾向的问题。此外，Guo等人的数据提示TpN47的结构域C和D的组合(C190)几乎等于全长TpN47蛋白的抗原性。
[0011]通过生成苍白密螺旋体抗原47 (TpN47抗原)的可溶的，稳定的和免疫反应性的变体，本发明已经解决了稳定性问题，所述变体包含至少TpN47蛋白分子的结构域B(aa63-174)条件是抗原缺少TpN47的结构域C(aa224_351)，其中TpN47抗原与蛋白伴侣融合。
[0012]此问题的其他解决方案是包含结构域B和D (SEQ ID N0.1的aa63_174和352至434)的可溶的TpN47抗原或包含结构域A+B和D (SEQ ID N0.1的aa26至223和352至434)的TpN47抗原。这两种变体都缺少TpN47的结构域C。
[0013]发明概沭
[0014]本发明涉及可溶的苍白密螺旋体抗原，即，涉及包含至少结构域B(SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174)或至少结构域A+B (SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223)的TpN47抗原，条件是TpN47抗原缺少结构域C (SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351)，其中TpN47抗原与蛋白伴侣融合。本发明也涉及包含至少结构域B (SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174)和结构域D (SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434)，或结构域A+B (SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223)和结构域D (SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434)的可溶的TpN47抗原，条件是这些抗原也缺少结构域C (SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351)。这些抗原也可与蛋白伴侣或与另一融合伙伴融合以进一步增加其溶解性。
[0015]本发明还涉及编码所述TpN47抗原的重组DNA分子并且也涉及含有有效连接的或整合的上述编码TpN47抗原的DNA的表达载体。本发明也涉及用所述表达载体转化的宿主细胞和生产所述TpN47抗原的方法。
[0016]此外，本发明涉及用于检测梅毒的体外诊断方法，即，涉及使用所述TpN47抗原变体检测针对TpN47的抗体的方法，并且也涉及包含根据本发明的TpN47抗原的试剂测试试剂盒。本发明还涉及至少两种苍白密螺旋体抗原的组合物，包含例如TpN47抗原和TpN17或TpN15抗原。在另一个实施方案中，所述组合物包含TpN47抗原和TpN17和TpN15抗原。额外地，本发明涉及生产这些抗原的方法以及这些抗原在用于检测分离的样品中的针对苍白密螺旋体的抗体的免疫诊断测定法中的用途。
[0017]附图简沭
[0018]图1-6 显示了在 Superdex200HR10/30 柱上的不同的 EcSlyD-EcSlyD_TpN47 结构域构建体的分析性凝胶过滤谱，也见实施例5。将约200 μ I的1.3mg/ml蛋白质溶液(融合蛋白溶解于150mM磷酸钾pH8.0，10mM KCl, 0.5mM EDTA中)应用到SEC柱上，并且在280nm处监控洗脱，流速0.8ml/min。FPLC标准品(浅灰虚线)含有β -半乳糖苷酶(465000Da)，羊IgG(150000Da)，羊IgG Fab片段(50000Da)，马肌红蛋白(17000Da)，和二肽甘氨酸-酪氨酸(238Da)。
[0019]在相同的缓冲剂浓度下(150mM磷酸钾pH8.0, 10mM KCl, 0.5mM EDTA)，在过夜孵育中(18h)，使浓度为1.3mg/ml (等于15.2μΜ-26.5μΜ的摩尔浓度)的全部蛋白构建体经受升高的温度(35°C，40°C)。在热胁迫后，对蛋白质样品进行离心并通过如上所述的FPLC分析方法评估其聚集的倾向。
[0020]展示了通过在Superdex200柱上的分析性凝胶过滤评估的EcSlyD-EcSlyD-TpN47/AB (26-223)的热稳定性。将230 μ I应用到柱上，对应于300 μ g蛋白质。在4°C，35°C和40°C孵育后的TpN47/AB的洗脱谱很好地一致。没有聚集或缔合过程的迹象。甚至在升高的温度如40°C，由280nm处的吸收监测的洗脱谱指向可溶的蛋白片段TpN47/AB。
[0021]图2展示了通过在Superdex200柱上的分析性凝胶过滤评估的EcSlyD-EcSlyD-TpN47/B (63-174)的热稳定性。将270 μ I应用到柱上，对应于350 μ g蛋白质。在4°C，35°C和40°C孵育后的TpN47/B的洗脱谱几乎完美地一致。没有聚集或缔合过程的迹象。由280nm处的吸收监测的洗脱谱给出了有说服力的证据，即甚至在升高的温度如40°C，蛋白片段TpN47/B是可溶的并且稳定的。
[0022]图3图解了通过在Superdex200柱上的分析性凝胶过滤评估的EcSlyD-EcSlyD-TpN47/C (224-351)的热稳定性。将154 μ I应用到柱上，对应于200 μ g蛋白质。在4°C和35°C孵育后的TpN47/C的洗脱谱几乎完美地一致。然而，甚至在35°C，非常少部分的TpN47C在凝胶过滤柱的空隙体积中洗脱出(深灰实线)，指向聚集过程的开始。在40°C孵育后，几乎三分之一的融合蛋白在SEC柱的空隙体积中洗脱出，提示形成大的聚集的蛋白质颗粒。从图3显而易见，TpN47结构域C在高于35°C的温度具有聚集的实质性倾向。
[0023]图4显示了通过在Superdex200柱上的分析性凝胶过滤评估的EcSlyD-EcSlyD-TpN47/CD (224-434)的热稳定性。将195 μ I应用到柱上，对应于250 μ g蛋白质。在4°C孵育后的TpN47/CD的洗脱谱展示好的对称峰，提示可溶且均质的蛋白质。当在35°C孵育时，ECSlyD-ECSlyD-TpN47/CD形成大的聚集的蛋白质颗粒，这是通过对应的谱所判断的，所述谱显示出一大部分的蛋白质在SEC柱的空隙体积中洗脱(深灰实线)。在40°C孵育后，最大的份额的CD融合蛋白在凝胶过滤柱的空隙体积中洗脱(黑实线)。从图4显而易见，TpN47的C末端部分，即融合蛋白⑶，甚至在适度升高的温度如35°C具有聚集的闻固有倾向。
[0024]图5图解了通过在Superdex200柱上的分析性凝胶过滤评估的EcSlyD-EcSlyD-TpN47/D (352-434)的热稳定性。将331 μ I应用到柱上，对应于430 μ g蛋白质。在4°C，35°C和40°C孵育后的TpN47/D的洗脱谱几乎不可区分并且完美地一致。没有任何聚集或缔合过程的迹象。由280nm处的吸收监测的洗脱谱给出了有说服力的证据，即甚至在升高的温度如40°C，蛋白片段TpN47/D是完美可溶的并且稳定的。
[0025]图6显示了通过在Superdex200柱上的分析性凝胶过滤评估的全长TpN47变体EcSlyD-EcSlyD-TpN47/ABCD (21-434)的热稳定性。将90 μ I应用到柱上，对应于117 μ g蛋白质。在4°C孵育后的TpN47/ABCD的洗脱谱展示在13.5ml洗脱体积处的好的峰，提示可溶的和均质的蛋白质。当在35°C孵育时，ECSlyD-ECSlyD-TpN47/ABCD形成大的聚集的蛋白质颗粒，这是通过对应的谱所判断的，所述谱显示出多于66%的蛋白质在SEC柱的空隙体积中洗脱(深灰实线)。在40°C孵育后，几乎96%的全长TpN47在凝胶过滤柱的空隙体积中洗脱(黑实线)。从图6显而易见，全长TpN47甚至在适度升高的温度如35°C具有聚集的巨大固有倾向。
[0026]由于全长蛋白的稀缺,仅117 μ g EcSlyD-EcSlyD应用于Superdex柱(导致较低的吸收信号)，当与其他TpN47变体比较时这仅是零数。然而，已经在相同的条件下对于每种TpN47变体进行热胁迫评估。
[0027]Ml显示了在寻找免疫优势的TpN47抗原变体中的B细胞表位作图的策略。上部:全长TpN47 (21-434，包含结构域ABCD)，具有融合至TpN47N_末端的EcSlyD-EcSlyD。中间部分:单个TpN47多肽片段(未显示与EcSlyD融合)，以梯样顺序:根据SEQ ID N0.8_16的TpN47 多肽片段 30-66、106-132、137-170、197-219、225-250、273-296、321-362、368-388、391-434;根据实施例4的这些多肽的免疫反应性的实验结果显示在表2(图8a-c)中。底部:TpN47结构域B、AB 、C、D和CD (未显示与EcSlyD-EcSlyD的融合)相对于全长TpN47的位置；根据实施例4的这些TpN47融合变体的免疫反应性(即抗原性)的实验结果显示在表3(图9)中。
[0028]图8a_c显示了表2，含有在实施例4中获得的结果:与EcSlyD蛋白伴侣融合的短(线性)非结构的TpN47片段的免疫学反应性。通过使用Elecsys? 2010分析仪进行免疫测定法。相对于密螺旋体属阴性样品获得的平均值归一化信号动力学。从BocaB1listics (Coconut Creek, FL, USA)购得密螺旋体属阳性血清,密螺旋体属阴性对照是内部供血者。注意右列(实验10，全长TpN47)在图8a，b和c每者中分别相同。
[0029]Ml显示了表3，含有在实施例4中获得的结果:与EcSlyD-EcSlyD串联蛋白伴侣融合的大TpN47片段(结构域)的免疫学反应性(即抗原性)。通过使用Elecsys? 2010分析仪进行免疫测定法。相对于密螺旋体属阴性样品获得的平均值归一化信号动力学(SD)。从Boca B1listics (Coconut Creek, FL, USA)购得密螺旋体属阳性血清，阴性对照是内部供血者。
[0030]图10 显示了表 4:在热胁迫(42°C，72h)后 TpN47 结构域 AB (26-223) &B (63-174)的残余抗原性。结构域AB和结构域B均如描述地与增强溶解性的串联蛋白伴侣模块
EcSlyD-EcSlyD融合。通过使用Elecsys? 2010分析仪进行免疫测定法。相对于密螺旋体属阴性样品获得的平均值归一化信号动力学(SD)。从SeraCare (MA，USA)购得密螺旋体属阳性血清，从Trina B1reactives AG( Nanikon,瑞士 )购得密螺旋体属阴性对照。
[0031]Mll 显示了表 5:在热胁迫(42°C，72h)后 TpN47 结构域 C (224-351) &D (352-434)的残余抗原性。结构域C和D均如描述地与增强溶解性的串联蛋白伴侣模块EcSlyD-EcSlyD
融合。通过使用Elecsys? 2010分析仪进行免疫测定法。相对于密螺旋体属阴性样品获得的平均值归一化信号动力学(SD)。从SeraCare (MA，USA)购得密螺旋体属阳性血清，从Trina B1reactives AG (Niinikon,瑞士)购得密螺旋体属阴性对照。
[0032]图12 显示了表 6:在热胁迫(42 °C，72h)后 TpN47/CD (224-434)和全长TpN47 (21-434)的残余抗原性。结构域⑶和全长TpN47均如描述地与增强溶解性的串联蛋白伴侣模块EcSlyD-EcSlyD融合。通过使用Elecsys? 2010分析仪进行免疫测定法。相对于密螺旋体属阴性样品获得的平均值归一化信号动力学(SD)。WSeraCare(MAdSA)购得密螺旋体属阳性血清，从Trina B1reactives AG( NSnikon,瑞士 )购得密螺旋体属阴性对照。
[0033]如进一步在序列表中所详述的，下列蛋白序列用于本说明书中:
[0034]SEQ ID N0.1显示了与两个大肠杆菌SlyD分子融合的全长TpN47:EcSlyD-EcSlyD-TpN47 (Swiss Prot P29723 的 aa21_434TpN47 有下划线)；在 315 位，已经用丙氨酸替换了半胱氨酸，并且出于纯化目的已经在C末端添加了六组氨酸标签。
[0035]MKVAKDLVVS L AYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGGGGSSHH ETHYGYATLS YADYffAGELG QSRDVLLAGNAEADRAGDLDAGMFDAVSRA THGHGAFRQQ FQYAVEVLGE KYLSKQETED SRGRKKffEYETDPSVTKMVRASASFQDLGE DGEIKFEAVE GAVALADRAS SFMVDSEEYK ITNVKVHGMKFVPVAVPHELKGIAKEKFHF VEDSRVTENT NGLKTMLTED SFSARKVSSM ESPHDLVVDTVGTGYHSRFGSDAEASVMLK RADGSELSHR EFIDYVMNFN TVRYDYYGDD ASYTNLMASYGTKHSADSffffKTGRVPRISA GINYGFDRFK GSGPGYYRLT LIANGYRDVV ADVRFLPKYEGNIDIGLKGKVLTIGGADAE TLMDAAVDVF ADGQPKLVSD QAVSLGQNVL SADFTPGTEYTVEVRFKEFGSVRAKVVAQL EHHHHHH
[0036]SEQ ID N0.2显示了与两个大肠杆菌SlyD分子融合的TpN47的结构域AB:EcSlyD-EcSlyD-TpN47/AB(Swiss Prot P29723 的 aa26_223TpN47 有下划线)；出于纯化目的已经在C末端添加了六组氨酸标签。
[0037]MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGGGETHYG YATLSYADYff AGELGQSRDY LLAGNAEADRAGDLDAGMFDAVSRAHGHGA FRQQFQYAVE VLGEKVLSKQ ETEDSRGRKK ffEYETDPSVTKMVRASASFQDLGEDGEIKF EAVEGAVALA DRASSFMVDS EEYKITNVKV HGMKFVPVAVPHELKGIAKHiFHFVEDSRV TENTNGLKTM LTEDSFSARK VSLEHHHHHH
[0038]SEQ ID N0.3显示了与两个大肠杆菌SlyD分子融合的TpN47的结构域B:EcSlyD-EcSlyD-TpN47/B (Swiss Prot P29723 的 aa63_174TpN47 有下划线)；出于纯化目的已经在C末端添加了六组氨酸标签。
[0039]MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGGGDLDAG MFDAVSRATH GHGAFRQQFQ YAVEVLGEKVLSKQETEDSRGRKKffEYETD PSVTKMVRAS ASFQDLGEDG EIKFEAVEGA VALADRASSFMVDSEEYKITNVKVHGMLEH HHHHH
[0040]SEQ ID N0.4显示了与两个大肠杆菌SlyD分子融合的TpN47的结构域C:EcSlyD-EcSlyD-TpN47/C (Swiss Prot P29723 的 aa224_351TpN47 有下划线)；在315 位，已经用丙氨酸替换了半胱氨酸，并且出于纯化目的已经在C末端添加了六组氨酸标签。
[0041]MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGGGSMESP HDLVVDTVGT GYHSRFGSDA EASVMLKRADGSELSHREFIDYVMNFNTVR YDYYGDDASY TNLMASYGTK HSADSffffKTG RVPRISAGINYGFDRFKGSGPGYYRLTLIA NGYRDVVADV RFLLEHHHHH H
[0042]SEQ ID N0.5显示了与两个大肠杆菌SlyD分子融合的TpN47的结构域CD:EcSlyD-EcSlyD-TpN47/CD (Swiss Prot P29723 的 aa224_434TpN47);在315 位，已经用丙氨酸替换了半胱氨酸，并且出于纯化目的已经在C末端添加了六组氨酸标签。
[0043]MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGGGSMESP HDLVVDTVGT GYHSRFGSDA EASVMLKRADGSELSHREFIDYVMNFNTVR YDYYGDDASY TNLMASYGTK HSADSffffKTG RVPRISAGINYGFDRFKGSGPGYYRLTLIA NGYRDVVADV RFLPKYEGNI DIGLKGKVLT IGGADAETLMDAAVDVFADGQPKLVSDQAV SLGQNVLSAD FTPGTEYTVE VRFKEFGSVR AKYVAQLEHH HHHH
[0044]SEQ ID N0.6显示了与两个大肠杆菌SlyD分子融合的TpN47的结构域D:EcSlyD-EcSlyD-TpN47/D(Swiss Prot P29723 的 aa352_434TpN47)。
[0045]MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGGGPKYEG NIDIGLKGKV LTIGGADAET LMDAAVDVFADGQPKLVSDQAVSLGQNVLS ADFTPGTEYT VEVRFKEFGS VRAKVVAQLE HHHHHH
[0046]SEQ ID N0.7显示了实施例1中描述的接头序列(GGGS) 5GGG。富含甘氨酸的柔性接头序列插入到两个大肠杆菌SlyD分子之间以及SlyD和TpN47抗原之间。
[0047]GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGG
[0048]SEQ ID N0.8 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p02_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸30-66:
[0049]GYATLSYADY WAGELGQSRD VLLAGNAEAD RAGDLDA
[0050]SEQ ID N0.9 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p03-l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸106-132:
[0051]SRGRKKffEYE TDPSVTKMVR ASASFQD
[0052]SEQ ID N0.10 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p04_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸137-170:
[0053]GEIKFEAVEG AVALADRASS FMVDSEEYKI TNVK
[0054]SEQ ID N0.11 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p05_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸197-219:
[0055]EDSRVTENTN GLKTMLTEDS FSA
[0056]SEQ ID N0.12 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p06_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸225-250:
[0057]MESPHDLVVD TVGTGYHSRF GSDAEA
[0058]SEQ ID N0.13 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p07_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸273-296:
[0059]NFNTVRYDYY ⑶DASYTNLM ASYG
[0060]SEQ ID N0.14 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p08_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸321-362:
[0061]FDRFKGSGPG YYRLTLIANG YRDVVADVRF LPKYEGNIDI GL
[0062]SEQ ID N0.15 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/p09_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸368-388:
[0063]TIGGADAETL MDAAVDVFAD G
[0064]SEQ ID N0.16 显示了 TpN47 肽 EcSlyD-TpN47/plO_l，根据 Swiss Prot P29723 的苍白密螺旋体47抗原序列的氨基酸391-434:
[0065]KLVSDQAVSL GQNVLSADFT PGTEYTVEVR FKEFGSVRAK VVAQ
[0066]发明详沭
[0067]本发明涉及可溶的苍白密螺旋体抗原，更准确地密螺旋体属抗原TpN47的可溶的变体。根据本发明的TpN47抗原缺少结构域C (SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351)并且既稳定又在体外诊断免疫测定法中有免疫反应性。
[0068]我们成功地从经转化的原核宿主细胞中纯化全长TpN47至均质。我们使用TpN47的全长形态的初始实验清楚地揭示当暴露于适度升高的温度时此蛋白质倾向聚集。在高于35°C的温度，全长TpN47不可避免地聚集成高分子量缔合物，尽管高度溶解的串联蛋白伴侣融合物例如EcSlyD-EcSlyD或甚至(更加热稳定的)EcSlpA-EcSlpA与全长抗原的融合。为了解决由全长TpN47引起的稳定性问题，我们克隆并且在大肠杆菌中过量生产了作为蛋白伴侣融合蛋白的短TpN47片段，将片段纯化至均质(通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶判断)并且评价其各自的抗原性。简而言之，此方法完全失败。令我们吃惊的是，十个片段中仅一个表现出了显著的(虽然相当差的)抗原性(见表2/图8a，TpN4730-66)。其余的有希望的短TpN47片段根本没有活性。此发现令人惊讶地与Baughn等人，J.1mmunol.(1996) 157 (2)，720-731中给出的文献数据不一致。因此，我们不得不寻找另一方法以避免全长TpN47的热诱导的聚集。
[0069]并非集中于短的并且假定非结构的TpN47的肽片段上，我们寻求设计TpN47的构象地折叠的部分。在 Journal of B1logical Chemistry (2002)，277 (4)，41857-41864 中，Deka等人呈现了 TpN47的晶体结构并且揭示了此蛋白质的结构域拓扑学。根据此工作，TpN47由四个结构域组成，即TpN47包含四个自主折叠的单位。然而,Deka等人并未说明关于鉴定的结构域的免疫学特征。
[0070]令人惊讶地，我们能够在大肠杆菌宿主中成功地表达TpN47结构域和结构域组合八8、8、(:、^和0。在本发明的一个实施方案中，TpN47抗原与蛋白伴侣模块(例如SlyD、FkpA> SlpA和Skp)融合生产。将全部这些构建体纯化至均质并在自动化的Elecsys分析仪中评估其与人抗梅毒血清的抗原性。结果是相当清晰的:抗原性相当高并以顺序C<D<OT<B<<AB增加。令人感兴趣的是，在温度胁迫测定法中，结构域C能够被鉴定为不稳定的(在>35°C的温度孵育后结构域C和结构域组合⑶强烈聚集，而AB、B和D保持完美可溶的)。简而言之，AB、B和D被鉴定为与全长TpN47相比具有稍微降低的抗原性但显著提高的溶解性的TpN47片段。因此，我们设计实验的数据提供了有说服力的证据，即缺少C结构域的TpN47变体关于溶解性和稳定性是显著提高的。
[0071]在本发明的一个实施方案中，抗原因此包含苍白密螺旋体抗原47 (TpN47)的结构域B并且少TpN47的结构域C，即本发明涉及包含SEQID N0.1的氨基酸残基63至174 (结构域B)的可溶的苍白密螺旋体抗原47 (TpN47抗原)，前提是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)并且其中TpN47抗原与蛋白伴侣融合。
[0072]本发明的另外的实施方案是包含结构域A和B并且缺少结构域C的TpN47抗原。这意味着本发明涵盖包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223 (结构域A+B)的可溶的TpN47抗原，条件是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)。在另外的实施方案中TpN47抗原包含结构域B或结构域A+B，其中结构域D是TpN47抗原的额外的部分。然而，在这些实施方案中结构域C也是缺失的。结构域D包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434。在这些实施方案中TpN47抗原也与蛋白伴侣融合。
[0073]额外的实施方案涉及包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174 (结构域B)的可溶的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)，条件是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)，所述抗原额外地包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434 (结构域D)。
[0074]另外的实施方案涉及包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223 (结构域A+B)的可溶的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)，条件是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)，所述抗原额外地包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434 (结构域D)。
[0075]根据本发明术语密螺旋体属是生物苍白密螺旋体-引起梅毒的病原体-的完整术语的简短形式并且这两个术语可互换使用。
[0076]“TpN47抗原”是适合作为用于免疫学测定法中的抗原的含有TpN47氨基酸序列的蛋白质。这意味着根据本发明的抗原在生理缓冲剂条件下，例如在没有添加变性剂的环境温度的磷酸盐缓冲剂系统中是可溶的。抗原也能够结合或被TpN47特异性的抗体(例如存在于分离的样品如人血清中的抗TpN47抗体)识别和结合。
[0077]根据本发明也包括TpN47抗原的变体。术语“变体”在此上下文中涉及与所述蛋白质基本相似的蛋白质或蛋白片段(即多肽或肽)。特别地，变体可以是同种型，所述同种型相比最普遍的蛋白同种型显示氨基酸交换，缺失或插入。在一个实施方案中，此类基本相似的蛋白质与蛋白质最普遍的同种型具有至少80%，在另一个实施方案中具有至少85%或至少90%，还在另一个实施方案中具有至少95%的序列相似性。术语“变体”也指翻译后修饰的蛋白质例如糖基化的或磷酸化的蛋白质。根据本发明，只要保持体外诊断免疫测定法中的免疫反应性，即变体仍然能够结合并检测样品中存在的抗TpN47抗体，则变体分类为TpN47抗原。“变体”也是这样的蛋白质或抗原，其例如已经通过将标签或运载体部分共价或非共价附着至蛋白质或抗原而被修饰。可能的标签是放射性的、荧光的、化学发光的、电化学发光的、酶或其他例如异羟基洋地黄毒苷或生物素。本领域技术人员知晓这些标签。
[0078]根据本发明的抗原可以与另一蛋白质融合。术语“融合蛋白”如本发明所用指这样的蛋白质，其包含对应于根据本发明的TpN47抗原的至少一个蛋白部分和充当融合伙伴作用的源自另一蛋白质的至少一个蛋白部分。
[0079]根据本发明的另一实施方案TpN47抗原可以与蛋白伴侣融合。蛋白伴侣，被称为经典的折叠助手，是辅助其他蛋白质的折叠和结构完整性的维持的蛋白质。折叠助手的实例在W003/000877中详细描述。根据本发明肽基脯氨酰异构酶类别的蛋白伴侣例如FKBP家族的蛋白伴侣可用于与TpN47抗原融合。适合作为TpN47抗原的融合伙伴的FKBP蛋白伴侣的实例是FkpA、SlyD和SlpA。适合作为TpN47的融合伙伴的其他蛋白伴侣是Skp，来自大肠杆菌的周质三聚蛋白伴侣，不属于FKBP家族。并不是总必需使用蛋白伴侣的完整序列。也可以使用仍然拥有所需要的能力和功能的蛋白伴侣的功能性片段(所谓的有结合能力的模块)(参见W098/13496)。
[0080]根据本发明的其他实施方案，FKBP蛋白伴侣(例如大肠杆菌SlyD、SlpA或FkpA)中的至少一个或至少两个模块被用作用于表达TpN47抗原的融合部分。蛋白伴侣Skp也可用作融合伙伴。两个FKBP-蛋白伴侣结构域的融合导致获得的融合多肽的提高的溶解性。融合部分可位于TpN47抗原的N末端或C末端或两端(夹心样)
[0081]可以通过重组DNA技术的手段生成并且制备根据本发明的TpN47抗原。因此本发明的另一个方面是编码如上进一步定义的TpN47抗原和其变体的重组DNA分子。
[0082]术语“重组DNA分子”指这样的分子，其是由两个否则是分离的序列区段的组合制备的，所述组合是由通过遗传改造技术或通过化学合成的多核苷酸的分离的区段的人工操作完成的。为此，可以将具有想要的功能的多核苷酸区段连接在一起以生成想要的功能组合。本领域公知用于在原核或低等或高等真核宿主细胞中表达蛋白质的重组DNA技术。其已经由例如，Sambrook 等人(1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual)描述。
[0083]本发明的其他主题涉及编码苍白密螺旋体抗原47 (TpN47)的重组DNA分子，所述重组DNA分子包含编码TpN47抗原的核苷酸序列，所述TpN47抗原包含根据SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174 (结构域B)的氨基酸序列，条件是所述重组DNA分子缺少SEQ IDN0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)的编码区。
[0084]在本发明的另一个实施方案中，重组DNA分子编码TpN47抗原，所述TpN47抗原包含根据SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223 (结构域A+B)的氨基酸序列，条件是所述重组DNA分子缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)的编码区。
[0085]在本发明的另外的实施方案中，重组DNA分子编码TpN47抗原，所述TpN47抗原包含根据SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174 (结构域B)或氨基酸残基26至223 (结构域A+B)的氨基酸序列。此外，重组DNA分子编码包含结构域D，即SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434的氨基酸序列。如上所述，在这些实施方案中也适用这样的条件，即所述重组DNA分子缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)的编码区。
[0086]根据本发明的重组DNA分子也可以含有这样的序列，所述序列编码在TpN47抗原和融合部分之间和也在若干融合部分之间的10至100个氨基酸残基的接头肽。此类接头序列可例如携带蛋白水解切割位点。
[0087]本发明的其他方面是表达载体，所述表达载体包含有效连接的根据本发明的重组DNA分子，即编码TpN47抗原的重组DNA分子或者编码融合蛋白的重组DNA分子，所述融合蛋白包含TpN47抗原和肽基脯氨酰异构酶蛋白伴侣，例如FKBP-蛋白伴侣，其中FKBP-蛋白伴侣选自FkpA、SlyD和SlpA。在备选的实施方案中，重组DNA分子编码包含TpN47抗原和Skp的融合蛋白。根据本领域公知的方法，包含根据本发明的重组DNA的表达载体可用于在无细胞翻译系统中表达TpN47抗原或可用于转化宿主细胞用于表达TpN47抗原。本发明的另一个方面因此涉及用根据本发明的表达载体转化的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中重组TpN47抗原是在大肠杆菌细胞中生产的。
[0088]也考虑生产可溶的，稳定的并且免疫反应性的TpN47抗原的方法，所述抗原也可以作为含有TpN47抗原和蛋白伴侣例如Skp或肽基脯氨酰异构酶类别蛋白伴侣例如FKBP蛋白伴侣的融合蛋白生产。在本发明的其他实施方案中，所述FKBP蛋白伴侣选自由SlyD、FkpA和SlpA组成的组。
[0089]该方法包括步骤
[0090]a)培养用含有编码TpN47抗原的基因的上述表达载体转化的宿主细胞
[0091]b)表达编码所述TpN47抗原的基因
[0092]c)纯化所述TpN47抗原。
[0093]任选地，作为额外的步骤d)，需要进行功能性溶解使得通过本领域已知的重折叠技术使TpN47抗原成为可溶的和免疫反应性的构象。
[0094]本发明的额外的方面涉及用于检测分离的人样品中的抗密螺旋体属抗体的方法，其中使用根据本发明的TpN47抗原作为抗体的结合伙伴。本发明因此涵盖用于检测分离的样品中的密螺旋体属特异性的抗体的方法，所述方法包括
[0095]a)通过混合体液样品与根据本发明的TpN47抗原形成免疫反应混合物
[0096]b)保持所述免疫反应混合物一段时期，所述时期足以允许存在于体液样品中的针对所述TpN47抗原的抗体与所述TpN47抗原免疫反应以形成免疫反应产物；和
[0097]c)检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
[0098]在其他方面，所述方法适用于检测IgG和IgM亚类的密螺旋体属抗体。
[0099]用于检测抗体的免疫测定法是本领域公知的，并且用于实施此类测定法和实际应用的方法和流程也是本领域公知的。根据本发明的TpN47抗原可用于不依赖于使用的标签并且不依赖于检测模式(例如放射性同位素测定法，酶免疫测定法，电化学发光测定法等)或测定法原理(例如测试条测定法、夹心测定法、间接测试概念或均质测定法等)地提高用于检测抗密螺旋体属抗体的测定法。专家已知的所有生物学液体能够用作用于检测抗密螺旋体属抗体的样品。样品通常是体液例如全血、血清、血浆、尿或唾液。
[0100]本发明的另外的实施方案是根据所谓的双抗原夹心概念(DAGS)实施的用于检测分离的样品中的抗密螺旋体属抗体的免疫测定法。有时，此测定法概念也称为双抗原桥概念，因为两个抗原通过抗体分析物桥接。在此类测定法中，需要并且利用抗体用其两个(IgG、IgA、IgE)或十个(IgM)互补位结合给定抗原的至少两个不同分子的能力。
[0101]更详细地，通过孵育含有抗密螺旋体属抗体的样品与两种不同的TpN47抗原，即，第一(“固相”)TpN47抗原和第二 TpN47( “检测”)抗原，进行根据双抗原桥形态的用于测定抗密螺旋体属抗体的免疫测定法，其中所述抗原中的每一个与所述抗密螺旋体属抗体特异性结合。第一抗原能够直接或间接与固相结合并且通常携带效应子基团，所述效应子基团是生物亲族(b1affine)结合对(如生物素和抗生物素蛋白)的部分。例如，如果第一抗原与生物素缀合，则用抗生物素蛋白或链霉亲和素包被固相。第二抗原携带标签。因此形成包含第一抗原、样品抗体和第二抗原的免疫反应混合物。在向所述抗原添加样品前，或在形成免疫反应混合物后，添加第一抗原能够结合的固相。保持此免疫反应混合物一段时期，所述时期足以允许体液样品中的针对所述TpN47抗原的抗密螺旋体属抗体与所述TpN47抗原免疫反应以形成免疫反应产物。下一步是分离步骤，其中分离液相与固相。最后，在固相或液相或两者中检测任何所述免疫反应产物的存在。
[0102]在所述DAGS免疫测定法中，“固相抗原”和“检测抗原”的基础结构是基本上相同的。在双抗原桥测定法中，也能够使用相似但不同的TpN47抗原，所述TpN47抗原是免疫学交叉反应性的。实施此类测定法的本质要求是相关的一个或多个表位存在于两个抗原上。根据本发明，能够对每个TpN47抗原使用不同的融合部分(例如，SlyD与固相侧的TpN47融合而FkpA与检测侧的TpN47融合)因为此类变异显著减轻非特异性结合的问题并因此降低假阳性结果的风险。
[0103]本发明的另外的实施方案因此是根据双抗原桥概念的免疫测定法，其中使用第一TpN47抗原或根据本发明的融合蛋白，和第二 TpN47抗原或根据本发明的融合蛋白。
[0104]本发明还涉及TpN47中的至少一种抗原在用于检测抗密螺旋体属抗体的诊断测试中的用途。
[0105]本发明的额外的主题是用于检测针对密螺旋体属的抗体的试剂盒，所述试剂盒除了用于免疫测定法的通常的测试添加剂外，含有适于特异性结合待测定的密螺旋体属抗体并且如果必要可能携带标签以及其他通常的添加剂的TpN47抗原中的至少一种抗原。特别地，试剂盒含有包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174 (结构域B)的TpN47抗原或包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223 (结构域A+B)的TpN47抗原，条件是每个所述抗原缺少对应于SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)的序列。是所述试剂盒的部分的抗原与蛋白伴侣融合。
[0106]在另外的实施方案中所述试剂盒包含如上文所定义的TpN47抗原，所述TpN47抗原包含结构域B或A+B并且还包含结构域D，即SEQ ID N0.1的氨基酸残基352-434。也在此实施方案中TpN47抗原缺少结构域C，即氨基酸残基224-351不存在于此TpN47抗原中。
[0107]此外，以上定义的试剂盒含有对照和标准溶液以及在一种或多种溶液中的试剂，具有通常的添加剂，缓冲剂，盐，去垢剂等，如本领域普通技术人员所用的。
[0108]另一方面是根据本发明的TpN47抗原作为疫苗的用途。本领域知晓含有免疫原性多肽作为活性成分的疫苗的制备。此类疫苗通常制备为可注射剂，作为液体溶液或悬液。活性成分，即，TpN47抗原或其融合蛋白与赋形剂混合，所述赋形剂是可药用的并且与活性成分相容，例如水、水性生理缓冲剂、盐、葡萄糖、甘油、乙醇。通过注射，常规地肠胃外施用疫苗。
[0109]另一实施方案是至少两种苍白密螺旋体抗原的组合物，所述组合物包含根据本发明的TpN47抗原和至少一种额外的选自由TpN17抗原和TpN15抗原组成的组的苍白密螺旋体抗原，使得所述组合物包含TpN47抗原、TpN17抗原或TpN15抗原或TpN15和TpN17抗原。而另外的实施方案是至少三种苍白密螺旋体抗原的组合物，所述组合物包含根据本发明的TpN47抗原和TpNl7和TpNl5抗原。
[0110]本发明也涉及根据本发明的TpN47抗原在用于检测抗苍白密螺旋体抗体的体外诊断测试中的用途。
[0111]实施例章节进一步说明了本发明。特别地，实施例说明了我们已经开发并生成了比全长TpN47蛋白分子更可溶并且显著更不热不稳定的TpN47的变体。提高了溶解性和稳定性。我们的TpN47变体能够例如在大肠杆菌中大量地过表达，易于通过固定化的金属螯合层析(IMAC)纯化和重折叠，表现出令人满意的稳定性性质并且可用于可靠地检测人血清中的抗密螺旋体属抗体(在另外的实施方案中与TpN17和/或TpN15组合，来自苍白密螺旋体的两种其他的免疫优势膜蛋白)。值得注意的是FkpA-TpN47/AB和Skp_TpN47/AB融合蛋白形成具有足以检测甚至IgM分子的表位密度的天然寡聚体。因为我们的目标是开发用于检测总免疫球蛋白(即检测IgG和IgM)的免疫测定法，寡聚种类的FkpA-TpN47/AB和Skp-TpN47/AB可以有利地用作DAGS形态两侧上的说明符(例如FkpA_TpN47/AB-生物素和Skp-TpN47/AB-钌，或反之亦然)。
[0112]实施例1
[0113]TpN47和TpN47蛋白伴侣融合多肽的克隆和纯化
[0114]表达盒的克隆
[0115]在Novagen (Madison, WI, USA)的pET24a表达质粒的基础上，基本如所述(Scholz, C.等人，J.Mol.B1l.(2005) 345，1229-1241)获得编码 EcSlyD-EcSlyD-TpN47 融合蛋白的表达盒。从SwissProt数据库检索TpN47抗原的序列(SwissProt ID P29723)。编码具有与N末端符合读框融合的富含甘氨酸的接头区的成熟TpN47aa21-434(省去了横跨氨基酸残基1_20的信号肽)的合成基因购自Medigenomix (Martinsried,德国)。将在315位的TpN47的独有的半胱氨酸残基改变为丙氨酸以防止不想要的副作用例如氧化或分子间二硫桥接。BamHI和XhoI限制性位点分别在TpN47_编码区的5’和3’端。编码经由富含甘氨酸的接头区连接的两个EcSlyD单位(根据SEQ ID N0.1的残基1-165，SwissProt登录号P0A9K9)和涵盖C末端的另外的接头区的部分的另外的合成基因同样购自Medigenomix。NdeI和BamHI限制性位点分别在此盒的5’和3’端。设计基因和限制性位点以使得能够通过简单连接进行蛋白伴侣部分EcSlyD-EcSlyD和TpN47抗原部分的符合读框地融合。为了避免偶然的重组过程和为了增加大肠杆菌宿主中的表达盒的遗传稳定性，同样地简并编码EcSlyD单位的核苷酸序列和编码延伸的接头区的核苷酸序列，即，使用不同的密码子组合编码相同的氨基酸序列。
[0116]用NdeI和XhoI消化pET24a载体并插入包含与密螺旋体属TpN47片段21-434 (Cys315Ala)符合读框融合的串联-SlyD的盒。相应地构建包含SlyD或Skp或FkpA的表达盒，以及包含与全长TpN47不同的靶多核苷酸，特别地结构域和结构域组合 B(TpN4763-174)、AB(TpN4726-223)、C(TpN47224-351)、CD(TpN47224-434)和D(TpN47352-434)的表达盒。全部重组融合多肽变体含有C末端六组氨酸标签以协助N1-NTA辅助的纯化和重折叠。使用 QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, USA)和标准PCR技术以在各表达盒中生成点突变、缺失、插入和延伸变体或限制性位点。
[0117]下图显示了具有与其N末端符合读框融合的两个SlyD蛋白伴侣单位的密螺旋体属TpN47全长抗原21-434的不意图。为了表不SlyD融合伙伴的大肠杆菌来源，已经将描绘的融合多肽命名为 ECSlyD-ECSlyD-TpN47 (21-434)。
[0118]
【权利要求】
1.可溶的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)，所述抗原包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174 (结构域B)，条件是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)，其中TpN47抗原与蛋白伴侣融合。
2.可溶的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)，所述抗原包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223 (结构域A+B)，条件是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)，其中TpN47抗原与蛋白伴侣融合。
3.根据权利要求1或2(结构域B或A+B)的可溶的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)，额外地包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434 (结构域D)。
4.可溶的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)，所述抗原包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基63至174 (结构域B)条件是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)，所述抗原额外地包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434 (结构域D)。
5.可溶的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)，所述抗原包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基26至223 (结构域A+B)条件是所述抗原缺少SEQ ID N0.1的氨基酸残基224至351 (结构域C)，所述抗原额外地包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基352至434 (结构域D)。
6.编码根据权利要求1至5中任一项的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)的重组DNA分子。
7.表达载体，其包含有效连接的根据权利要求6的重组DNA分子。
8.用根据权利要求7的表达载体转化的宿主细胞。
9.生产可溶的和免疫反应性的苍白密螺旋体抗原47(TpN47抗原)的方法，所述方法包括步骤为 -培养根据权利要求8的宿主细胞 -表达所述TpN47抗原和 -纯化所述TpN47抗原。
10.至少两种苍白密螺旋体抗原的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至5的TpN47抗原和选自由TpN17抗原和TpN15抗原组成的组的至少一种额外的苍白密螺旋体抗原。
11.用于在分离的样品中检测苍白密螺旋体特异性的抗体的方法，其中使用根据权利要求I至5的TpN47抗原或根据权利要求10的抗原的组合或组合物作为捕获试剂和/或作为所述苍白密螺旋体抗体的结合伙伴。
12.用于在分离的样品中检测苍白密螺旋体特异性的抗体的方法，所述方法包括 a)通过混合体液样品与根据权利要求1至5中任一项的TpN47抗原或与根据权利要求10的至少两种苍白密螺旋体抗原的组合物形成免疫反应混合物 b)保持所述免疫反应混合物一段时期，所述时期足以允许存在于体液样品中的针对所述密螺旋体属抗原或密螺旋体属抗原的组合物的抗体与所述密螺旋体属抗原或密螺旋体属抗原的组合物免疫反应以形成免疫反应产物；和 c)检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
13.根据权利要求1至5中任一项的TpN47抗原或根据权利要求10的苍白密螺旋体抗原的组合物在用于检测抗苍白密螺旋体抗体的体外诊断测试中的用途。
14.用于检测抗苍白密螺旋体抗体的试剂盒，所述试剂盒包含至少根据权利要求1至5中任一项的TpN47抗 原或根据权利要求10的抗原组合物。
【文档编号】C07K14/20GK104080801SQ201380005559
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年1月16日 优先权日:2012年1月19日
【发明者】E·法特兹, P·沙尔施密特, U·施密特, C·舒尔茨 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司