检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂 盒及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 梅毒（Syphilis)是由苍白（梅毒）螺旋体（Treponema pallidum)引起的慢性、 系统性性传播疾病。亦称苍白螺旋体（Tr印onemia pallidum，TP)，1905年由法国科学家 Schaudinn与Hoffmanu发现并报告的。在分类学上属螺旋体体目（Spirochaetales)，密螺 旋体科（Treponemataceae)，密螺旋体属（Genus Treponema)。菌体细长，带均勾排列的6~ 12个螺旋，长5~20 y m，平均长6~10 y m，横径0. 15 y m上下，运动较缓慢而有规律，实 验室常用染料不易着色，可用暗视野显微镜或相差显微镜观察菌体。主要通过性途径传播， 临床上可表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒（胎传梅毒）等。梅 毒是人类独有的疾病，显性和隐性梅毒患者是传染源，感染梅毒的人的皮损及其分泌物、血 液中含有梅毒螺旋体。感染后的头2年最具传染性，而在4年后性传播的传染性大为下降。
[0003] 梅毒侵入人体后经过2-3周潜伏期，即发生皮肤损害（典型损害为硬下疳）这是 一期梅毒。发生皮肤损害后机体产生抗体，从兔实验性梅毒的研宄证明，梅毒初期的组织学 特征是单核细胞侵润在感染的第6天，即有淋巴细胞浸润，此时梅毒螺旋体见于硬下疳中 的上皮细胞间隙中，以及位于上皮细胞的内陷或吞噬体内，或成纤维细胞浆细胞、小的毛细 血管内皮细胞之间及淋巴管和局部淋巴结中。由于免疫的作用使梅毒螺旋体迅速地从病 灶中消除，在感染的第24天后，免疫荧光检测未发现梅毒螺旋体的存在螺旋体大部分被杀 死，进入无症状的潜伏期此即一期潜伏梅毒。现在应用基因诊断能快速准确的检测出来。
[0004] 梅毒患者的皮肤、粘膜中含梅毒螺旋体，未患病者在与梅毒患者的性接触中，皮肤 或粘膜若有细微破损则可得病，而性接触是梅毒的主要传播途径，约占其95%以上。感染 TP的早期传染性最强。如果是显性梅毒，可发生性行为接触的任何部位的硬下疳，如生殖 器、肛周、直肠、乳头、舌、咽、手指等部位的硬下疳。随着病期的延长传染性越来越小，一般 认为感染后2年以上性接触就不再有传染性。
[0005] 一期梅毒患者，如果没有及时科普治疗、或者没有在正规医院里治疗，梅毒螺旋体 就会由淋巴系统进入血液循环，并大量繁殖、播散，侵犯皮肤、粘膜、骨、内脏、心血管及神经 系统，进而出现多种症状。在这个阶段，通常可能先出现流行性感冒一样的全身症状，随后 会有全身淋巴结的肿大及皮肤粘膜的多种损害。皮肤损害有斑瘆、斑丘瘆、脓疱瘆；黏膜损 害有梅毒性咽炎、粘膜斑、梅毒性秃发等症状；部分患者会出现声音撕哑，甚至完全无法发 音。90%的患者都会出现梅毒瘆，这是二期梅毒的基本特征。
[0006] 二期梅毒的主要表现可以概括为三个特点：类感冒症状、梅毒瘆和全身淋巴结肿 大。患梅毒瘆时由于无明显痛苦，常易被患者忽略。临床上如见到分布广泛、对称，而自觉 症状轻微的皮瘆时，就要详细询问病史，以免漏诊。二期梅毒瘆表面梅毒螺旋体很多，因此 传染性也最强。
[0007] 梅毒螺旋体可侵犯中枢神经系统，可引发脊髓痨、麻痹性痴呆、视神经萎缩等；也 会侵害心血管系统，可导致主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全、主动脉瘤等；当螺旋体侵害骨骼 系统，引起组织和器官破坏，功能丧失，导致残疾或死亡。梅毒螺旋体还有很强的变异性，而 且变异后毒性增强，对身体器官的损伤程度加重，变异后病情发展迅速，加之传统治疗效果 差，致使梅毒对身体的致残率和致死率增加。不及时治疗将导致器官的功能丧失，甚至危及 生命。目前来说，"早预防、早发现、早治疗"成为预防治疗梅毒的关键，针对梅毒的快速有效 的检测手段更加显得重要。
[0008] 目前，梅毒的检测通常采用血清学检查，免疫血清学检查具有方便、快捷和准确等 优点，已经普遍应用于医疗检测和诊断领域。较常见的免疫血清学检查方法有免疫荧光技 术（ABS)、放射免疫分析法（RIA)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、免疫胶金体技术（ICA)及化 学发光免疫分析（CLIA)等。
[0009] 其中，酶联免疫法价格便宜，但灵敏度较低，是目前国内应用最多的方法，而且酶 免只可以作为定性判断，且手工操作误差较大，难以适应市场发展的需求。胶体金法的优点 是及时、快速，适宜于现场检测，其特异性和灵敏度远差于酶联免疫法。化学发光法可用于 定量测定，无论从方法学和自动化程度看，都要优于酶联免疫法。
[0010] 常规技术中，还有采用电化学发光法检测梅毒的，电化学发光法是通过在电极表 面由电化学引发的特异性化学发光反应。也有采用双抗原夹心法进行测定的，即一株重 组抗原包被固相，另一株重组抗原标记发光物，通过测定发光信号，计算出样本中梅毒抗体 (Treponema pallidum antibodies, TP)的含量。
[0011] 但是，常规技术中的TP检测常存在灵敏度低、特异性差的问题。
【发明内容】
[0012] 基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测梅毒螺旋体抗体 的试剂盒及其检测方法和应用，采用该试剂盒及检测方法，能够提高检测灵敏度。
[0013] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0014] 一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，包括以下组分：
[0015] 1)标记物体系：包括直接连接或间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1， 或包括直接连接或间接连接标记示踪物的金黄葡萄球菌A蛋白；
[0016] 2)桥连物体系：包括直接连接第一桥连物的梅毒螺旋体重组抗原2 ;
[0017] 3)磁性微球体系：包括直接连接第二桥连物的磁性微球；
[0018] 所述梅毒螺旋体重组抗原1和梅毒螺旋体重组抗原2与待测梅毒螺旋体抗体结合 的位点互不相同，所述第一桥连物可与第二桥连物结合。
[0019] 上述"直接连接"为直接结合的连接，上述"间接连接"为通过生物素和链霉亲和 素，或异硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方 式连接。上述第一桥连物与第二桥连物为常规可用的搭桥物质对，如生物素和链霉亲和素， 硫氰酸荧光素（FITC)和抗异硫氰酸荧光素抗体，标签蛋白和标签蛋白抗体等。其中，抗异 硫氰酸荧光素抗体既可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。
[0020] 本发明人通过大量研宄实验考察后发现，常规技术的梅毒螺旋体抗体（TP)检测 中，如使用磁性微球作为固相载体，是将梅毒螺旋体重组抗原包被于磁性微球中，加样反应 时使待测抗体直接与包被于磁性微球的重组抗原结合，而由于磁性微球相对体积较大，具 有较大的空间位阻，常常导致抗原-抗体结合反应并不充分，致使检测灵敏度低。
[0021] 在上述研宄发现的基础上，本发明对常规技术进行了改进，测定时，先不将重组抗 原包被到磁性微球，而是通过一个小分子的第一桥连物标记重组抗原，让连接标记示踪物 的梅毒螺旋体重组抗原1，和连接第一桥连物的梅毒螺旋体重组抗原2先与待测抗体（TP) 反应，形成双抗原夹心结构的复合物，由于此时重组抗原上连接的标记示踪物和桥连物的 体积均小于磁性微球，空间位阻较小，能够促进抗原-抗体结合反应充分进行，使所有待测 抗体均与抗原形成双抗原夹心复合物，在不清洗的前提下，加入磁性微球，依赖磁性微球上 包被的桥连物与上述形成的双抗原夹心复合物结合，磁性微球起到作为固相载体固定待测 物和标记示踪物的作用，此时，外加磁场固定磁性微球，清洗掉没有通过待测抗体形成双抗 原夹心复合物的连接标记示踪物的重组抗原。最后通过发光底物与标记示踪物作用发出的 相对光强度，计算出待测抗体的含量。
[0022] 本发明的试剂盒，由于在形成双抗原夹心复合物的过程中，与标记重组抗原的都 是小分子物质，其空间位阻远远小于磁性微球的空间位阻，能够促进抗原-抗体结合反应 充分进行，使所有待测抗体均与抗原形成双抗原夹心复合物，从而提高了检测灵敏度。
[0023] 在上述技术方案中，标记物体系中，标记示踪物的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ ml，梅毒螺旋体重组抗原1的工作浓度优选50ng/ml-5000ng/ml ;桥连物体系中，第一桥连 物（如生物素等）的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml，梅毒螺旋体重组抗原2的工作浓度优 选50ng/ml-5000ng/ml