布鲁菌外膜蛋白抗体检测elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 布鲁菌病是由布鲁菌属细菌引起的重大人兽共患疾病，严重影响着家畜的生产力 和动物性产品的生物安全，给畜牧业发展造成严重的经济损失。据世界统计资料表明，每年 因布鲁菌病造成的经济损失近30亿美元。我国每年牛、羊、猪感染有百万头之多，所造成的 经济损失可达十几亿元。我国就新疆、甘肃两地概算，每年因布鲁菌病造成的直接经济损失 约1亿元。据农业部统计，2011年12月，仅1个月我国河北、内蒙古、辽宁、黑龙江、浙江、甘 肃、新疆等地区牛和绵羊共发生布鲁菌病468次，发病数约1万头，捕杀近8000头。同时， 野生动物布鲁菌病的存在，也是对畜牧业的发展和人类健康的一种潜在威胁。
[0003] 布鲁菌病的诊断技术从总体上分为细菌学检测、免疫学检测和PCR检测等几类方 法。细菌学检测是诊断布鲁菌感染的金标准，由于布鲁菌培养条件苛刻，操作人员存在被感 染风险，没有广泛应用。血清学检测是发现部分疫情和了解疫情的重要手段。0IE指定布鲁 菌检测试验有缓冲布氏杆菌抗原试验、ELISA和补体结合试验，而我国布鲁菌病诊断国标是 2002年制订的动物布鲁菌病诊断技术（GB/T18646-2002)，检测方法有虎红平板凝集试验、 乳牛全乳环状试验、试管凝集试验和补体结合试验。虎红平板凝集试验和试管凝集试验试 验因假阳性、假阴性结果较多而易造成误判；乳牛全乳环状试验结果易受动物机体内环境 影响而造成误判；补体结合试验因操作繁琐、费时而在实际应用中较少。
[0004] ELISA近年来以操作简易、贮存方便、高敏感性和高特异性等优势逐渐成为布鲁菌 病检测的重要手段，而我国尚未推广快速、敏感、高通量的ELISA检测方法用于实际生产及 口岸检测。此外，完整的细菌作为ELISA包被抗原是最经典的，但因为布鲁菌培养条件苛 亥IJ、不易培养，而且存在生物安全隐患。国内外在选用ELISA作为检测布鲁菌病的常用方法 时，大多是从牛种布鲁菌S1119-3或S99株中提取光滑型脂多糖（sLPS)作为抗原，这种抗 原易与其它菌发生交叉反应，减低试验的准确性。因而利用生物工程技术表达单一性抗原 表位作为检测抗原，既安全有效，又解决了脂多糖作为抗原易与其它病原菌发生交叉反应 的问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种快速、敏感、简便的布 鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供一种布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒， 其特征在于，其利用大肠杆菌表达的布鲁菌外膜蛋白0MP28作为抗原包被酶标板，用布鲁 菌标准阳性血清和阴性血清分别作为阳性对照血清和阴性对照血清，以HRP标记的羊抗牛 IgG作为酶标抗体。
[0007] 本研究在筛选ELISA抗原时，选用了 0MP19和0MP28两种蛋白作为候选对象，但试 验中发现经克隆表达的0MP19蛋白不稳定，易降解，不易纯化；与之相比，0MP28则相对稳 定、多次试验均易获得高纯度的可溶性蛋白。优化好条件，以0MP14、0MP15、0MP39作为包 被抗原检测临床阴性血清和阳性血清时，〇D450nm值几乎没有区别，特异性差；与之相比， 0MP28作为包被抗原检测临床阴性血清和阳性血清时，P/N在3. 0以上，特异性强。因此， 0MP28是具有较好反应原性的稳定蛋白质，可作为ELISA试剂盒的包被抗原。
[0008] 进一步地，所述大肠杆菌表达的布鲁菌外膜蛋白0MP28的制备方法如下：
[0009] (1)设计引物
[0010] 参照NCBI中提供的牛型布鲁菌0MP28的基因序列（CP003176)，用Primer5. 0软件 设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物为:5，-CGCGGATCCATGAAC ACTCGTGCTAGC-3'；下游引物为:5'-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACG-3'。为了便于后续的 克隆，在上、下游引物的5'端分别添加BamHI和Xhol酶切位点(下划线标出）。
[0011] (2 ) 0MP28基因的扩增
[0012] 以牛型布鲁菌A544株基因组DNA为模板，扩增0MP28基因，用胶回收试剂盒回收 PCR产物。
[0013] (3)克隆载体和表达载体的构建
[0014] 用BamHI酶和Xhol酶将回收的0MP28PCR产物定向克隆于原核表达载体pET-28a (+ )，转化大肠杆菌DH5 a，筛选得到阳性重组质粒。
[0015] (4)重组蛋白的制备
[0016] 将重组质粒pET-28a ( + ) -0MP28转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，经IPTG诱导表 达。表达产物进行SDS-PAGE分析，用Ni-NTA琼脂糖亲合层析纯化，纯化的蛋白即为0MP28 蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。
[0017] 其中，所述步骤（2)0MP28基因的扩增中，PCR扩增的工作体系为25iiL:DNA 模板 1.〇1^，1〇11111〇1/1上游引物？1.〇111，1〇11111〇1/1下游引物1?1.〇1^，2\]\&18七6『 Mixl2. L，灭菌去离子水 9. L;反应参数：95°C 5min ;95°C 30s，57°C 30s，72°C lmin，35 个循环，72°C延伸7min，冷却至4°C。
[0018] 其中，所述步骤（3)中筛选得到阳性重组质粒的具体过程为，将转化后的大肠杆菌 DH5 a细胞涂布到含50 ii g/mL卡那霉素的LB平板上，于37°C培养过夜，次日，从LB平板上 随机挑取5个菌落，接种于含50 y g/mL卡那霉素的LB培养基中，于37°C培养16h，提取质 粒，进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的质粒再进行酶切鉴定，将酶切鉴定为阳性的质粒测 序，得到阳性重组质粒。
[0019] 进一步地，所述酶标板的制备方法如下：
[0020] (1)抗原包被：无菌条件下，将纯化的重组蛋白0MP28于pH9. 6的碳酸缓冲液中按 1 y g/ml稀释，100 ii L/孔加到96孔酶标板中，湿盒内37°C包被lh;
[0021] (2)洗涤：以pH值为7. 4的PBST作洗涤液，300iiL/孔，每次室温作用2min，洗涤 4次。最后一次甩掉洗涤液后，在吸湿纸上用力排干；
[0022] (3)封闭：用含5%脱脂乳的PBST按160ul/孔，加入至酶标板中，37°C封闭30min， 洗涤4次。最后一次甩掉洗涤液后，在吸湿纸上用力排干，后自然晾干；
[0023] (4)包装：将封闭好的酶标板放于铝箔袋中，加入包装为lg的干燥剂，用真空包装 机将酶标板包装好，贴标签。
[0024] 进一步地，所述阳性对照血清和阴性对照血清的制备方法如下：
[0025] (1)阳性对照血清的制备：在无菌条件下，将从中国兽医药品监察所购买的布鲁菌 标准阳性血清（lml干粉包装)用2ml高压好的蒸馏水稀释，加入0. 01%硫柳汞以防腐，然后 分装，贴好标签。
[0026] (2)阴性对照血清的制备：在无菌条件下，将从中国兽医药品监察所购买的布鲁菌 标准阴性血清（lml干粉包装)用2ml高压好的蒸馏水稀释，加入0. 01%硫柳汞以防腐，然后 分装，贴好标签。
[0027] 进一步地，所述酶标抗体为HRP标记的羊抗牛IgG，其来自美国ROCKLAND公司购买 的 anti-bovine HRP IgG F(C)(GOAT)。
[0028] 进一步地，前述试剂盒还配以洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液。
[0029] 其中：所述洗涤液的制备方法如下：无菌条件下，用0.22 滤器过滤后的 Tween-20加到经高压灭菌的20 XPBS中，配成1%的20 XPBST贮存液。
[0030] 所述底物溶液A、底物溶液B来自北京康为世纪科技有限公司购买的TMB底物显色 试剂盒(可溶型)，其中的TMB液规定为底物溶液A、TMB-显色液规定为底物溶液B。
[0031] 所述终止液为2mol/L硫酸。
[0032] 本发明的有益效果在于：
[0033] 本发明所述布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒，利用生物工程技术表达单一 性抗原表位作为检测抗原，经过敏感性、特异性、重复性、保存性试验证明所研制的试剂盒 安全稳定可靠。此外，在检测时间方面，研制的试剂盒检测96个样本仅需1. 5~2h，而用 IDEXX试剂盒检测96个样本则需2-3h，这说明用本试剂盒做检测更加快捷高效；在检测成 本方面，研制的试剂盒对于96个样本的检测成本不足100元，而检测同样的样本，IDEXX试 剂盒需1500元左右。这说明，所研究的试剂盒更加快捷经济，适于在生产中推广使用，可满 足我国对牛群中布鲁菌的抗体进行检测监测的防疫要求。
【附图说明】
[0034] 图1为0MP28基因的PCR扩增结果，其中泳道M为DNA标准DL2000，1为PCR产物。
[0035] 图2为重组0MP28蛋白的SDS-PAGE电泳分析，其中泳道1为纯化的重组蛋白，2为 诱导前的重组表达菌，3为诱导后的重组表达菌，4为重组表达菌裂解液沉淀，5为重组表达 菌裂解液上清，M为蛋白质分子质量标准。
【具体实施方式】
[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0037] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 所用试剂均为市售。
[0038] 实施例1大肠杆菌表达的布鲁菌外膜蛋白0MP28制备
[0039] 1?材料
[0040] 1. 1菌种与血清
[0041] 牛型布鲁菌A544株由中国兽医药品监察所提供、原核表达载体pET-28a( + )、大肠 埃希菌BL21 (DE3)由首都医科大学免疫学实验室保存。
[0042] 1. 2 试剂
[0043] DNA聚合酶、各种限制性内切酶和T4DNA连接酶购自NEB公司；S印hadex G25、 Superdex75预装柱购自GE公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自大连宝生物工程 有限公司。
[0044] 2.引物的设计
[0045] 参照NCBI中提供的牛型布鲁菌0MP28的基因序列（CP003176)，用Primer5. 0软件 设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物为:5，-CGCGGATCCATGAAC ACTCGTGCTAGC-3' ；下游引物为:5'-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACG-3'。为了便于后续的 克隆，在上、下游引物的5'端分别添加BamHI和Xhol酶切位点(下划线标出）。
[0046] 3. 0MP28基因的扩增
[0047] 以牛型布鲁菌A544株基因组DNA为模板，扩增0MP28基因，用胶回收试剂盒回收 PCR产物。PCR扩增的25iiL工作体系为：DNA模板1.〇1^，1〇11111〇1/1上游引物？1.〇111， 10μmol/L 下游引物 R1. 0 ii L，2XMaster Mixl2. 5 ii L，灭菌去离