吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种免疫亲和搅拌棒及其制备方法。特 别是一种吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济的发展，人们生活水平的日益提高，对各种动物源性食品的需求量 也逐渐增大，食品安全问题自然成为大家关注的焦点。近年来关于兽药残留引起的对人身 体健康造成危害的报道屡见不鲜，相关食品安全部门也致力于检测方法的研究。由于生物 样品的成分复杂、药物与样品成分之间易互相结合和残留药物浓度低等均给样品中药物的 提取净化带来了很大的困难，因此分析方法的选择性和灵敏度直接决定了检测的成功与 否。
[0003] 免疫亲和搅拌棒（Imunoaffinity stir bar)是免疫亲和固相微萃取 (Immunoaffinity solid phase microextraction, Immunoaffinity SPME) 的一种 装置形式，将固相微萃取（Solid phase microextraction, SPME)与免疫亲和色谱 (IAC, immunoaff inity chromatography)相结合，既具有SPME易于操作、使用溶剂少和节 省时间的优点，又有免疫亲和色谱高度选择性和高亲和性的特点，使SPME在兽药残留分析 中，选择性、亲和性和灵敏度方面得到了很大的提升。Immunoaffinity stir bar常被用作 样品的萃取，尤其适用于复杂基质中痕量分析物的提取，与多种检测手段结合使用进行分 析测定，具有广阔的应用前景。
[0004] 雷索酸内酯类化合物主要有玉米赤霉醇、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉 烯酮、ct-玉米赤霉烯醇和3 -玉米赤霉烯醇，均有雌激素样作用。玉米赤霉醇（Zeranol, ZER)又名"右环十四酮酚"，商品名称"畜大壮"，是玉米赤霉菌在生长过程中产生的次级代 谢产物玉米赤霉烯酮的还原产物，属于雷索酸内酯内非留体类同化激素。玉米赤霉醇是一 种效果理想的皮埋增重剂，系非固醇、非激素类化合物。玉米赤霉醇能用于促进蛋白质和成 和增重，在美国等几十个国家广泛使用了几十年，我国从20世纪80年代末期开始示范及推 广应用。后实验证明其对哺乳动物具有一定的危害性，欧盟已经于1998年明确禁止将玉米 赤霉醇等激素类药物用于畜禽养殖。2002年，我国农业部第193号公告明确规定玉米赤霉 醇禁用于所有食品动物，所有可食动物不得检出。2010年卫生部发布的《食品中可能违法 添加的非食用物质名单(第四批)》中明确将玉米赤霉醇列入非食用物质。
[0005] 玉米赤霉醇以耳根埋植的形式应用，促进蛋白质的合成，能提高胴体瘦肉率及饲 料转化率。但是，玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，在动物中的残留会引起人体性机能紊乱， 及第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，还可能致癌。虽然现已被国家禁用，但由于其 作为增重剂效果好，经济回报高，仍有违法使用的现象。
[0006] 近几十年来，各种食品安全监测机构、各类从事相关工作的研究人员针对食品和 饲料中玉米赤霉醇的残留分析进行了深入全面的研究。动物体内残留的玉米赤霉醇含 量较低，残留检测困难，目前用于ZER检测的主要技术有：薄层色谱法（TLC)、酶联免疫法 (ELISA)、气相色谱-质谱法（GC-MS)、高效液相色谱法（HPLC)及高效液相色谱-串联质谱 法（HPLC-MS/MS)等。TLC法成本低，但灵敏度和选择性不高；ELISA法虽然灵敏度很 高，但由于其有交叉反应特性，选择性较差；GC-MS法灵敏度和选择性均好，但需要衍生 化，操作繁琐费时；HPLC法可直接测定，但对于复杂基质样品，杂质干扰较大，用于定性 确证时存在一定困难；LC-MS/MS法不需要实现待测物质与干扰组分的完全色谱分离，即可 对化合物进行结构确证，具有更高的灵敏度和准确性，但价格昂贵，实际应用中往往受到限 制。生物样品前处理技术主要有液-液萃取和固相萃取，液-液萃取操作繁琐且需要使用大 量的有机溶剂，固相萃取具有使用有机溶剂少、选择性较强、分离时间短等优点，目前测定 玉米赤霉醇常用的是C18和HLB固相萃取小柱，普通的固相萃取小柱虽然操作方便、快捷， 但专属性差。Immunoaffinity SPME技术首次于2001年被提出，用Immunoaffinity stir bar净化雷索酸内酯类化合物目前还尚未见报道，更无商品化的Immunoaffinity stir bar 出售。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒及其制备 方法与应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 一种吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于是由固相载体和与其偶 联的玉米赤霉醇鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的玉米赤霉醇鼠单克隆抗体的偶 联长度与重量比为1 cm :2 mg;所述的单克隆抗体是由单克隆杂交瘤细胞株ZER-1G2注入 小鼠腹腔，纯化小鼠腹水得到。所述的固相载体为10 cmX4 mm玻璃棒，偶联抗体的有效长 度为2. 5 cm。
[0009] 单克隆杂交瘤细胞株ZER-1G2的解释如下： ZER-1G2中ZER代表玉米赤霉醇，1代表细胞融合过程使用第1块96孔板，G2中的字 母和数字分别代表96孔板的横纵编号，96孔板中1-12为横向编号，A-H为纵向编号。G2代 表融合后的杂交瘤细胞株在96孔板中的位置。
[0010] 本发明进一步公开了吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其 特征在于按如下的步骤进行： (1)固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水：浓硫酸=30:70,（v/v) lh， 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其目的是为了进行清洁和形成粗糙表面。
[0011] (2)硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES (3-氨丙基三乙氧基硅烷，有市 售。）乙醇溶液中，其中ATPES:超纯水：无水乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24 h; (3) 氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80 °C并通入氮 气氮吹15 h ; (4) 玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5%的戊二醛PBS (磷酸盐缓冲液，即1L中含有0. 2 g KH2P04，0.2 g KC1，2.9 g Na2HP04.12H20,8.8 g NaCl的溶液。配制缓冲液时所需的试剂均 有市售。）溶液中5h，之后用超纯水冲洗； (5) 偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株ZER-1G2分泌的单克隆抗体PBS溶液， 0? 5 mg/mL 抗体 +0? 05 mg/mLNaN3* 4°C轻微揽祥 24 h ; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3 M)去活化1 h ; (7) 稳固共价键：置于PBS+0.05 mg/mLNaN3+0.2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反应 48h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
[0012] 所述的单克隆抗体指的是对玉米赤霉醇、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉 烯酮、a -玉米赤霉烯醇和0 -玉米赤霉烯醇有特异性反应的单克隆杂交瘤细胞株ZER-1G2 分泌的。
[0013] 本发明进一步公开了吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附6 种雷索酸内酯类化合物的应用。包括：玉米赤霉醇、3 _玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉 烯酮、ct -玉米赤霉烯醇和0 -玉米赤霉烯醇。
[0014] 本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的提纯方法结合色 谱法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于雷索酸内酯类化合物的含量的检 测，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性 低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
[0015]
【主权项】
1. 一种吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于是由固相载体和与其 偶联的玉米赤霉醇鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的玉米赤霉醇鼠单克隆抗体的 偶联长度与重量比为Icm:2mg;所述的单克隆抗体是由单克隆杂交瘤细胞株ZER-1G2注 入小鼠腹腔，纯化小鼠腹水得到；所述的固相载体为10cmX4mm玻璃棒，偶联抗体的有效 长度为2. 5cm。
2. 权利要求1所述吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在 于按如下的步骤进行： (1) 固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸（30:70,v/v)混 合溶液中Ih,依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其中双氧水：浓硫酸的体积比 为 30:70 ; (2) 硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中，其中ATPES:超纯水：无水 乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24h; (3) 氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 气氮吹15h; (4) 玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5% (w/w)的戊二醛PBS溶液中5h，之后用超纯水冲 洗； (5) 偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株ZER-1G2分泌的单克隆抗体PBS溶液， 0? 5mg/mL抗体 +0? 05mg/mLNaN3* 4°C轻微揽祥 24h; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3M)去活化Ih; (7) 稳固共价键：置于PBS+0.05mg/mLNaN3+0.2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反应 48h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
3. 权利要求2所述免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于所述的固相载体表面使用 双氧水：浓硫酸（30:70,v/v)进行清洁和形成粗糙表面。
4. 权利要求2所述免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于所述的单克隆抗体指的是 对玉米赤霉醇、3 _玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、a-玉米赤霉烯醇和3 _玉米 赤霉烯醇这六种雷索酸内酯物具有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株ZER-1G2分泌的单克 隆抗体。
5. 权利要求1所述吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附六种雷索 酸内酯类化合物方面的应用；所述的雷索酸内酯类化合物指的是：玉米赤霉醇、3 _玉米赤 霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、a-玉米赤霉烯醇和卩-玉米赤霉烯醇。
【专利摘要】本发明公开了一种吸附雷索酸内酯类化合物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用，它是由固相载体和与其偶联的玉米赤霉醇鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的玉米赤霉醇鼠单克隆抗体的偶联长度与重量比为1cm:2mg。本发明的提取方法结合色谱法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于雷索酸内酯类化合物的检测，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
【IPC分类】G01N33-543, G01N33-577
【公开号】CN104698175
【申请号】CN201510116392
【发明人】李存, 姚凯, 赵思俊, 张伟, 杨琳燕, 金天明, 李建军, 王翠翠
【申请人】天津农学院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月18日