子水 9. 5 ii L;反应参数： 95°C 5min;95°C 30s，57°C 30s，72°C lmin，35 个循环，72°C延伸 7min，冷却至 4°C。
[0048] 4.克隆载体和表达载体的构建及鉴定
[0049] 用BamHI和Xhol将回收的0MP28PCR产物定向克隆于原核表达载体pET_28a( + )， 转化大肠杆菌DH5a。将转化后的细胞涂布到含卡那霉素（50iig/mL)的LB平板上，于37°C 培养过夜。次日，从LB平板上随机挑取5个菌落，接种于含卡那霉素（50 y g/mL)的LB培 养基中，于37°C培养16h，提取质粒，进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的质粒再进行酶切鉴 定，将酶切鉴定为阳性的质粒测序。
[0050] 5?重组蛋白的制备
[0051] 将测序正确的重组质粒pET-28a ( + ) -0MP28转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，经 IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE分析，用Ni-NTA琼脂糖亲合层析纯化，纯化的蛋白 即为0MP28蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。
[0052] 6?结果
[0053]6. 10MP28表达载体的构建
[0054] PCR扩增得到了编码0MP28的DNA片段，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小约760bp， 与预期的一致(见图1)。将该片段和pET-28a ( + )载体连接后，转化入大肠埃希菌DH5ci， 次日在LB平板上长出大量形状规则的菌落，挑取单菌落，经菌液PCR鉴定得到阳性克隆，经 质粒酶切鉴定，得到阳性克隆，测序结果证实为牛型布鲁菌0MP28的编码序列。
[0055] 6. 2重组蛋白的制备
[0056] 重组质粒pET-28a ( + ) -0MP28在大肠埃希菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达后， SDS-PAGE分析表明表达产物主要存在于裂解菌液的上清中，呈可溶性表达。Ni-NTA亲和产 物的表观分子量约为25ku(见图2)，与0MP28蛋白分子量大小的一致，纯化后的蛋白用BCA 法检测蛋白浓度为〇. 5mg/mL。
[0057] 实施例2抗原包被酶标板的制备
[0058] 1?试剂
[0059] (1)包被液：25mmol/L 碳酸盐缓冲液，pH9.6。Na2C03l. 59g，NaHC032. 93g，ddH20 加 至1000mL，4°C保存备用；
[0060] (2)洗涤液储存液（10*PBS) :NaC180g，KC12g，Na2HP04 ? 12H2029g，KH2P042g，ddH20 加至lOOOmL定容；
[0061] (3)洗涤液（PBST):含0? 05%Tween-20PBS，（pH7. 4)。取50mL10*PBS，450mL ddH20， 250uL Tween-20,常温保存；
[0062] (4)封闭液：称取5g脱脂乳，溶于lOOmL PBST洗涤液中，置于4°C保存备用。
[0063] 2?包被
[0064] 无菌条件下，将纯化的重组蛋白0MP28于包被液中按1 ii g/ml稀释，100 ii L/孔加 到96孔酶标板中，湿盒内37 °C包被lh。
[0065] 3?洗涤
[0066] 用PBST洗涤液，300 y L/孔，每次室温作用2min，洗涤4次。最后一次甩掉洗涤液 后，在吸湿纸上用力排干。
[0067] 4?封闭
[0068] 用封闭液按160ul/孔加入至酶标板中，37°C封闭30min，洗涤4次。最后一次甩掉 洗涤液后，在吸湿纸上用力排干，后自然晾干。
[0069] 5?包装
[0070] 将封闭好的酶标板放于铝箔袋中，加入包装为lg的干燥剂，用真空包装机将酶标 板包装好，贴标签。
[0071] 实施例3阳性对照血清、阴性对照血清制备
[0072]1?试剂
[0073] 布鲁菌标准阳性血清和阴性血清购自中国兽医药品监察所，硫柳汞购自国药集团 化学试剂有限公司。
[0074] 2.阳性对照血清制造
[0075] 在无菌条件下，将布鲁菌标准阳性血清（1ml干粉包装）用2ml高压好的蒸馏水稀 释，加入0. 01%硫柳汞以防腐，然后分装，贴好标签。
[0076] 3?阴性对照血清制造
[0077] 在无菌条件下，将布鲁菌标准阴性血清（1ml干粉包装）用2ml高压好的蒸馏水稀 释，加入0. 01%硫柳汞以防腐，然后分装，贴好标签。
[0078] 实施例4HRP标记的羊抗牛IgG、洗涤液、显色液、终止液制备
[0079] 1. HRP标记的羊抗牛IgG的制备
[0080] 对从美国ROCKLAND公司购买的anti-bovine HRP IgG F(c) (GOAT)进行分装，贴 好标签。
[0081] 2.洗涤液的制备
[0082] 无菌条件下，用0. 22 iim滤器过滤后的Tween-20加到经高压灭菌的20 XPBS中， 配成 1% 的 20XPBST 贮存液。20XPBS 的配方为：NaC1160g，KC14g，Na2HP04 ? 12H2058g， KH2P044g，ddH20 加至 lOOOmL 定容。
[0083] 3.显色液的制备
[0084] 对从北京康为世纪科技有限公司购买的TMB底物显色试剂盒(可溶型）进行分装， 其中的TMB液规定为底物溶液A、TMB-显色液规定为底物溶液B。
[0085] 4?终止液制备
[0086] 配置2mol/L硫酸，并进行分装。
[0087] 实施例5布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒说明
[0088] 1.临界值的确定
[0089] 选择70份IDEXX试剂盒检测为阴性的临床血清样本，按最佳反应条件进行测定， 读取0D450nm数值，其平均值X为0. 120,标准差SD为0. 044,即当S/P彡X+3SD=0. 25时， 判为阳性。其中，S/P=(样品0D45(lnm-标准阴性血清0D45(lnm)/ (标准阳性血清0D45(lnm-标准 阴性血清〇D45(lnm)。
[0090] 表170份阴性血清ELISA检测结果
[0091]
【主权项】
1. 一种布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，其利用大肠杆菌表达的 布鲁菌外膜蛋白0MP28作为抗原包被酶标板，用布鲁菌标准阳性血清和阴性血清分别作为 阳性对照血清和阴性对照血清，以HRP标记的羊抗牛IgG作为酶标抗体。
2. 根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述大肠杆菌表达的布鲁菌外膜 蛋白0MP28的制备方法如下： (1) 设计引物 根据牛型布鲁菌0MP28的基因序列设计引物： 上游引物为：5' -CGCGGATCCATGAACACTCGTGCTAGC-3' ； 下游引物为：5' -CCGCTCGAGTTACTTGAITTCAAAAACG-3' ； 在上、下游引物的5'端分别添加BamHI和XhoI酶切位点； (2) 0MP28基因的扩增 以牛型布鲁菌A544株基因组DNA为模板，扩增0MP28基因； (3) 克隆载体和表达载体的构建 用BamHI酶和XhoI酶将回收的0MP28PCR产物定向克隆于原核表达载体pET-28a，转化 大肠杆菌DH5a，筛选得到阳性重组质粒； (4) 重组蛋白的制备 将重组质粒pET-28a-0MP28转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达，用Ni-NTA琼 脂糖亲合层析纯化得到重组0MP28蛋白。
3. 根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述0MP28基因的扩增步骤中， PCR扩增的工作体系为 25iiL:DNA模板L0iiL，10iimol/L上游引物FL0iiL，10iimol/L 下游引物RLOuL，2XMasterMixl2.L，灭菌去离子水9.L;反应参数：95°C5min; 95°C30s，57°C30s，72°Clmin，35 个循环，72°C延伸 7min，冷却至 4°C。
4. 根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述筛选得到阳性重组质粒的 具体过程为，将转化后的大肠杆菌DH5a细胞涂布到含50yg/mL卡那霉素的LB平板上，于 37°C培养过夜，次日，从LB平板上随机挑取5个菌落，接种于含50iig/mL卡那霉素的LB培 养基中，于37°C培养16h，提取质粒，进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的质粒再进行酶切鉴 定，将酶切鉴定为阳性的质粒测序，得到阳性重组质粒。
5. 根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标板的制备方法如下： (1) 抗原包被：无菌条件下，将纯化的重组蛋白0MP28于pH9. 6的碳酸缓冲液中按 IUg/ml稀释，100iiL/孔加到96孔酶标板中，湿盒内37°C包被Ih; (2) 洗涤：以pH值为7. 4的PBST作洗涤液，300iiL/孔，每次室温作用2min，洗涤4次。 最后一次甩掉洗涤液后，在吸湿纸上用力排干； (3) 封闭：用含5%脱脂乳的PBST按160ul/孔，加入至酶标板中，37°C封闭30min，洗涤 4次。最后一次甩掉洗涤液后，在吸湿纸上用力排干，后自然晾干； (4) 包装：将封闭好的酶标板放于铝箔袋中，加入包装为Ig的干燥剂，用真空包装机将 酶标板包装好，贴标签。
6. 根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清和阴性对照血 清的制备方法如下： (1)阳性对照血清的制备：在无菌条件下，将布鲁菌标准阳性血清，用2ml蒸馏水稀释， 加入0.01%硫柳汞以防腐； (2)阴性对照血清的制备：在无菌条件下，将布鲁菌标准阴性血清，用2ml蒸馏水稀释， 加入0.01%硫柳汞以防腐。
7.根据权利要求1-6任一项所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还配以洗涤 液、底物溶液A、底物溶液B和终止液。
8.根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的制备方法如下：无 菌条件下,用0. 22 iim滤器过滤后的Tween-20加到经高压灭菌的20XPBS中，配成1%的 20 X PBST贮存液。
9. 根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，终止液为2mol/L硫酸。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体提供了一种布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒。所述ELISA试剂盒以大肠杆菌表达的布鲁菌外膜蛋白OMP28作为抗原包被酶标板，用布鲁菌标准阳性血清和阴性血清分别作为阳性对照和阴性对照，以HRP标记的羊抗牛IgG作为酶标抗体，配以稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液组装而成。本发明布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒具有安全、敏感、特异、简单、快速、稳定的优点，可满足我国对牛群中布鲁菌的抗体进行检测监测的防疫要求。
【IPC分类】C12N15-70, C12R1-01, G01N33-68
【公开号】CN104698182
【申请号】CN201310646920
【发明人】韩雪清, 王慧煜, 林祥梅, 贾广乐, 张小娟
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月4日