一种采用q-pcr技术检测bcl11a基因表达水平的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用Q-PCR技术检测BCL11A基因表达水平的方法及其应用，设计了BCL11A和GAPDH的扩增引物与探针，优化了Q-PCR扩增体系。该发明证实了所建立的BCL11A基因表达水平的Q-PCR检测方法，可用于精确检测白血病病人样本中BCL11A的表达水平，并分析了BCL11A表达水平与治疗缓解率及预后的相关性。该发明所述方法可用于检测BCL11A基因的表达水平，为临床上对白血病患者进行诊断、治疗缓解和预后评价提供了依据。
【专利说明】—种采用Q-PCR技术检测BCL11A基因表达水平的方法及其应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种基因表达的检测方法，具体而言涉一种BCLllA表达水平的Q-PCR检测方法及其应用。
[0003]
【背景技术】
[0004]目前，广泛使用的检测基因表达的方法是利用SYBR Green染料进行基因相对表达水平的检测，虽然该方法实验设计简单，不需要设计探针和绘制标准曲线。但是，该方法在于可能会被非特异性的双链DNA产物所干扰，从而不能得到精确的检测结果。
[0005]因此，为了更加准确的检测病人样本中BCLllA的表达水平，更好的为基础和临床研究提供依据，我们针对BCLllA基因设计了特异的荧光探针和引物，成功摸索了 Q-PCR检测条件、并绘制了 BCLllA的qPCR检测标准曲线，建立了 BCLllA的Q-PCR检测方法。
[0006]利用该方法，我们成功检测了 7例正常人及22例AML (acute myelocyticleukemia,急性髓细胞白血病)病人骨髓样本中BCLllA的表达水平，并分析了 BCLllA表达水平与治疗缓解率及预后的相关性。
【发明内容】
[0007]为克服现有技术的不足，本发明的目的旨在提供一种能精确检测样本中BCLllA基因表达水平的Q-PCR检测方法，并揭示BCL11A在白血病患者中的表达规律，以及与治疗、预后的相关性。
[0008]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种采用Q-PCR技术检测BCLllA基因表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤:
I)设计Taqman探针及扩增引物:
使用 TaqMan real — time PCR专用引物探针设计软件Primer Express 3.0,以BCLllA基因和GAPDH内参基因为靶序列，选择合适的特异引物与探针，在GenBank数据库中比对筛选引物序列以保证其扩增的特异性，定量PCR扩增长度100-200bp，其中BCLlIA扩增片段为118bp，内参基因扩增片段是116bp。TaqMan探针5 ^端报告集团标记为FAM，3 ^端淬灭基团标记为非荧光染料ECLIPSE。
[0009]所述BCLllA基因Taqman探针的长度为15_45bp，取自所述BCLllA基因的定量PCR扩增靶标的正向引物和反向引物之间的一段DNA区域，该段DNA区域的序列为SEQ.1D.N0.7 ;所述内参基因GAPDH的Taqman探针的长度为15_45bp，取自所述内参基因的GAPDH的定量PCR扩增靶标的正向引物和反向引物之间的一段DNA区域，该段DNA区域的序列为 SEQ.1D.N0.8。
[0010]优选的，TaqMan探针和引物序列详见表1。
[0011]表1 TaqMan探针和引物序列
【权利要求】
1.用于采用Q-PCR技术检测BCLllA基因表达水平的Taqman探针及扩增引物，其特征在于: 所述BCLllA基因的定量PCR扩增靶标的正向引物序列为SEQ.1D.N0.1，所述BCLllA基因的定量PCR扩增靶标的反向引物序列为SEQ.1D.N0.2 ;以及，作为内参基因的GAPDH的定量PCR扩增靶标的正向引物的序列为SEQ.1D.N0.4，所述内参基因的GAPDH的定量PCR扩增靶标的反向引物的序列为SEQ.1D.N0.5; 所述BCLllA基因Taqman探针的长度为15_45bp，取自所述BCLllA基因的定量PCR扩增靶标的正向引物和反向引物之间的一段DNA区域，该段DNA区域的序列为SEQ.1D.N0.7 ；所述内参基因GAPDH的Taqman探针的长度为15_45bp，取自所述内参基因的GAPDH的定量PCR扩增靶标的正向引物和反向引物之间的一段DNA区域，该段DNA区域的序列为SEQ.1D.N0.8。
2.根据权利要求1所述的Taqman探针及扩增引物，其特征在于:所述BCLllA基因的Taqman探针的特征序列为SEQ.1D.N0.3 ;所述内参基因的GAPDH的Taqman探针的特征序列为 SEQ.1D.N0.6。
3.一种使用如权利要求1或2所述的Taqman探针及扩增引物的Q-PCR扩增体系，其特征在于:在PCR反应管中加入各成分，使得各成分终浓度为:1XPCR buffer,dNTP 0.2 mMeach、上下游Q-PCR扩增引物0.4 μ M、Taqman探针0.2 μΜ、1Χ参比染料ROX I1、模板DNA2μ L以及热启动DNA聚合酶0.05 U/ μ L，并用Η20补足到相应扩增体积。
4.一种使用如权利要求1或2所述的Taqman探针及扩增引物的采用Q-PCR技术检测BCLllA基因表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)设计Taqman探针及基因的扩增引物， 以BCLllA基因和GAPDH内参基因为靶序列，选择特异引物与探针，各特征序列如下: BCLllA基因的定量PCR扩增靶标的正向引物序列为SEQ.1D.N0.1 ； BCLllA基因的定量PCR扩增靶标的反向引物序列为SEQ.1D.N0.2 ； BCLllA基因的Taqman探针的序列为SEQ.1D.N0.3 ； GAPDH基因的定量PCR扩增靶标的正向引物的序列为SEQ.1D.N0.4 ； GAPDH基因的定量PCR扩增靶标的反向引物的序列为SEQ.1D.N0.5 ； GAPDH基因的Taqman探针的序列为SEQ.1D.N0.6 ； 2)扩增BCLllA及GAPDH标准质粒，梯度稀释，用作模板； 3)在PCR反应管中加入各成分，使其终浓度分别为:1XPCRbuffer、dNTP 0.2 mMeach、上下游Q-PCR扩增引物0.4 μ M、Taqman探针0.2 μΜ、1Χ参比染料ROX I1、模板DNA2μ L以及热启动DNA聚合酶0.05 U/μ L，并用Η20补足到相应扩增体积；将反应管放置于定量PCR仪进行扩增； 4)绘制BCLllA基因以及GAPDH内参基因的标准曲线，得到线性关系 Ct (GAPDH) =-4.2378*LgC0 (GAPDH) +52.171597 ；
Ct (BCLllA) =-3.294674*LgC0 (BCLllA) +39.751675 ； 5)收集样本，利用上述方法检测Ct值，根据所述线性关系求得BCLllA相对于GAPDH的表达水。
5.根据权利要求4所述的采用Q-PCR技术检测BCLlIA基因表达水平的方法，其特征在于: 所述GAPDH内参基因的标准质粒制备方法如下:扩增出GAPDH内参基因，连接到载体，转化、挑取阳性克隆株，测序鉴定； 所述BCLlIA基因的标准质粒制备方法如下:扩增出BCLlIA基因，连接到载体，转化、挑取阳性克隆株，并且测序鉴定。
6.根据权利要求4或5所述的采用Q-PCR技术检测BCLllA基因表达水平的方法，其特征在于:扩增BCLllA以及GAPDH的标准质粒，测定浓度，根据公式:拷贝数/μ L =(6.02Χ 1023Χ (质粒浓度ng/yLXlO—9)) / (质粒长度bp数X 660)，将两种质粒梯度稀释作为PCR扩增的DNA模板。
7.一种含权利要求1或2所述的Taqman探针及扩增引物的检测试剂盒。
8.如权利要求1或2所述的Taqman探针及扩增引物在检测患者样本中BCLllA基因表达水平的应用。
9.如权利要求3所述的Q-PCR扩增体系在检测患者样本中BCLllA基因表达水平的应用。
10.如权利要求4所述的采用Q-PCR技术检测BCLlIA基因表达水平的方法在检测患者样本中BCL11A基因表达水平的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104131111SQ201410404381
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】尹斌, 毛政伟, 郑彦文 申请人:苏州大学