一种双酶法生产ε-己内酯工艺的制作方法
【专利摘要】一种以环己醇为起始原料，以一锅煮方式生产ε-己内酯的生产工艺，该工艺同时使用共价共固定化的醇脱氢酶和单加氧酶进行生物氧化反应，以空气为氧化剂，将环己醇直接氧化为ε-己内酯；反应温度为30-40℃，反应pH为7.0，反应介质为磷酸盐缓冲液(pH7.0)+乙酸丁酯2相体系。本发明工艺条件温和，收率高，无有毒有害溶剂，产品生物相容性好，可以用于生物医药材料。
【专利说明】-种双酶法生产ε-己内酯工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物催化氧化生产ε -己内酯的生产工艺，特别是一种以环己醇 为起始原料，用醇脱氢酶和单加氧酶2种酶为催化剂，用有机溶剂-水2相体系控制底物、 产物浓度，用空气作为氧化剂，一锅煮工艺生产ε -己内酯的技术。
【背景技术】
[0002] ε -己内酯是一种无毒的新型聚酯单体，在高分子材料的合成和改性方面具有不 可替代的作用。ε-己内酯主要用于合成不同用途的聚己内酯（PCL)，PCL具有独特的生 物相容性、生物降解性以及良好的渗透性，在材料领域有广泛应用。如PCL生物医用材 料可用于手术的缝合线及骨折内固定材料（具有形状记忆的PCL材料）。随着时间的推 移，聚酯材料会慢慢地降解被吸收，而不会对伤口和人体有伤害，可取代传统的手术方 法，大大提高手术的方便性，同时可减轻患者的痛苦。
[0003] ε -己内酯与各种单体共聚或PCL与其他树脂共混可提高材料的光泽度、透明性、 生物分解性和防黏性等。ε -己内酯还是一种优良的有机溶剂和重要的有机合成中间体，对 一些难溶性树脂表现出很好的溶解性，可与多种化合物反应制备具有独特性能的精细化学 品。此类产品可作为农膜、胶粘剂、肥料的控制释放体及可降解包装材料。目前年产量已 超过1万吨。
[0004] 由于合成ε-己内酯工艺技术难度高，迄今为止只有美国、英国、日本等国家的几 家公司能够生产ε-己内酯，而我国主要依赖进口。
[0005] 目前，己内酯的合成方法很多，其起始原料主要为环己酮，大致可分为以下 几种。
[0006] 1过氧酸氧化法 过氧酸氧化法就是用过氧酸作氧化剂氧化环己酮合成ε-己内酯，这种方法研究比 较成熟，已广泛使用，但是其合成前期过氧酸的浓缩以及后续纯化过程所产生的浓度过 高、易爆的过氧化物是该工艺实际应用的障碍，即该工艺存在无法避免的操作安全问题； 另外，后期的产品分离和羧酸的回收再利用也存在一定的困难。
[0007] 2 Η202 氧化法 该法用Η202将有机酸氧化成过氧酸，再用过氧酸氧化环己酮生成ε-己内酯。为了 缩短反应时间，需加入催化剂，包括有无机酸、有机酸和一些VI I I族金属以及钛硅沸 石和磺化树脂等。所用氧化剂为Η202，比较清洁，它避免了过氧酸的浓缩，从而解决了 过氧酸氧化法中无法解决的脱水问题。但是其反应过程中过渡态中间产物过氧酸在酸性和 较高温度下，特别是有一些金属离子及其化合物存在下很不稳定。另外，ε-己内酯 在酸性环境中易发生聚合、水解，反应时间长，收率低，一般〈90%。
[0008] 中国专利申请01814586. 8公开了采用有机酸生产ε-己内酯的工艺，最高收率 91. 2%，其反应温度高达250-325°C，耗能大；操作压力为0. 01-0. 7atm，，增加了设备投资。
[0009] 中国发明专利申请201110313026. 8公开了一种由环己酮催化氧化制备己内酯 的方法，产品收率为61. 3-89. 7%，由于使用苯甲腈、甲醇等有机溶剂，不可避免产生残留， 由于苯甲腈、甲醇的毒性，严重影响产品的生物相容性，限制了其在生物医学领域的应用。 [0010] 中国发明专利申请201010227171. X公开了一种制备己内酯和己二酸的方法，其 特征在于以可溶性锌盐改性的钛硅分子筛为催化剂，在温度为40?150°C和压力为0. 1? 3MPa的条件下，将环己酮、氧化齐IJ、溶剂和催化剂进行反应，产物分离后即同时得到己内酯 和己二酸。反应在较高温度、一定压力小进行，增加了设备投资、操作难度，能耗较大。而且， 由于使用了锌盐，产品中将有残留，影响了产品的生物相容性，限制了其在生物医学领域的 应用。此外，该工艺同时生产2种产品，己内酯需要另外增加分离步骤，增加了设备投资和 操作成本。
[0011] 3 02/空气氧化法该法与Η202间接氧化法类似，只是用氧气代替Η 202作为氧化 齐IJ。其优点在于这种方法比较清洁，缺点在于分子氧的活性较低，反应条件苛刻且产率 较低，至今该方法的效果欠佳。
[0012] 中国专利申请201110370189. X公开了一种由分子氧氧化环己酮制备ε-己内酯 的方法，使用氧气为氧化剂，其收率不高，最高收率仅85. 1%。由于使用了过氧化苯甲酰、偶 氮二异丁腈作为引发剂，不可避免将在产品中有残留，较严重影响其生物相容性，限制了其 在生物医学材料的应用。
[0013] 4生物酶氧化法 采用生物酶氧化环己酮合成ε-己内酯，其主要困难之一，是用酶催化反应时，需要昂 贵的辅酶循环系统，制约了该法的工业发展。相对来说，此类方法目前研究得还比较少。
[0014] 如果用微生物细胞为催化剂则可能存在以下不足：（1)、细胞内酶系复杂，可能使 产物降解；（2)、底物、产物扩散限制严重，底物要通过细胞壁，进入胞内反应，产物要通过 细胞壁，离开细胞，大大降低了细胞催化反应速度，一般而言，与游离状态时相比，酶在细胞 内的反应速度至少降低5倍。（3)、氧传递限制，细胞要用氧，反应也要用氧，氧负荷显著增 力口，加剧了氧传递限制；（4)、底物浓度低，因为细胞较酶更敏感，底物、产物可能对细胞抑 制，这就要求反应液中底物、产物浓度必须较低(例如底物、产物浓度小于lg/L)，而且与离 体酶相比，细胞催化时无菌条件要求高，使成本显著增加。
【发明内容】
[0015] 本发明将采用生物氧化生产ε-己内酯，工艺条件温和，收率高，无有毒有害溶 齐IJ，产品生物相容性好，可以用于生物医药材料。 现有的生物酶氧化工艺采用的起始原料是环己酮，除了提供氧分子外，还要求有机共 底物，用于原位辅酶循环，由于昂贵的辅酶循环，使得该工艺失去竞争性。 我们改变了出发原料，从环己醇出发，通过2步酶催化氧化，得到ε-己内酯。整个工 艺只需提供氧分子(空气）作为氧化剂，以一锅煮方式将环己醇直接氧化成为ε -己内酯。 在反应中，辅酶循环是自己闭环的，所以，不需要另外提供辅酶循环。换句话说，本工艺不需 要另外提供昂贵的辅酶循环，从而大幅度降低了生产成本。具体工艺过程如1图所示。 第一步氧化反应，环己醇作为底物被醇脱氢酶（PDH)氧化为环己酮，同时，将氧化型的 辅酶NAD(P)+还原成还原型辅酶NAD(P)H。环己酮是一个关键的中间体，它在第2个氧化 反应中被拜尔-维利格单加氧酶(具体是环己醇单加氧酶，CHM0,亦简称单加氧酶）原位催 化直接立体选择性的氧化成ε -己内酯，同时将还原型辅酶NAD(P)H氧化为氧化型的辅酶 NAD (P)+。此反应中，催化剂为CHMO,氧分子为共同底物，要求还原型辅酶NAD (P)H。于是，在 一个反应器偶合这2个氧化反应，就可以将环己醇直接氧化为ε -己内酯，无需另外提供辅 酶循环系统(如果2个反应单独进行，则需要另外提供辅酶循环系统)。本工艺除了环己醇， 只需提供空气，而环己醇是易得的化工产品。可见，将2步生物催化氧化反应结合起来，在 一个反应器中进行，即一锅煮反应，使辅酶循环互补、闭环，不再需要提供额外的辅酶循环 系统，从而大幅度降低生产成本；而且，反应起始原料是环己醇，较环己酮廉价易得；此外， 用空气作为氧化剂，进一步降低了生产成本。发明人经过大量实验，才得到这种巧妙结合的 工艺。催化反应可以使用游离酶或固定化酶。 在我们的实验中发现，底物环己醇、中间产物环己酮、产物ε -己内酯对2种酶均有一 定的抑制，并可导致酶的失活，其中，对CHMO的抑制和失活较严重，而对TOH的抑制和失活 作用很轻。所以，在反应中必须考虑酶的抑制和失活。为了增加酶的稳定性，采用固定化 酶。为了减少底物环己醇、中间产物环己酮、产物ε-己内酯对2种酶的抑制，可以采用非 水介质酶催化体系，例如有机溶剂-水不溶的2相体系，底物环己醇、中间产物环己酮、产物 ε -己内酯在有机溶剂的溶解度远远高于水，所以，它们主要存在于有机相，而酶在水相，从 而大幅度减少它们对酶的抑制和失活作用。 采用非水体系进行催化反应，具体采用乙酸丁酯-水2相体系。此外，环己醇、环己酮 在乙酸丁酯中溶解度小于ε-己内酯，于是，ε-己内酯几乎全部进人乙酸丁酯，对酶的抑 制和失活大幅度减少，而环己醇、环己酮在水中还一部分，与乙酸丁酯形成平衡，当反应消 耗了水中的环己醇、环己酮时，乙酸丁酯中的环己醇、环己酮会向水中转移，继续反应。GB 2760 - 96规定乙酸丁酯为允许使用的食用香料。作为香料，大量用于配制香蕉、梨、菠萝、 杏、桃及草莓、浆果等型香精。亦可用作天然胶和合成树脂等的溶剂。所以使用乙酸丁酯作 为溶剂是安全的。 反应需要2种酶：PDH，CHMO。这2种酶可以购买，也可以自己重组发酵生产。 将H)H、CHMO基因分别在大肠杆菌中表达，然后，培养大肠杆菌，破碎细胞，分离纯化， 分别得到所需纯度的Η)Η、(?ΜΟ。然后，可以进行共价固定化。 固定化载体，可以采用带环氧基、氨基等基团的载体，例如，氨基型SEPABEADS EC-HA(EA)和环氧型SEPABEADS EC-EP(HFA)系列聚甲基丙烯酸球状基质（Resindion S.r.l·，Mitsubishi Chem. Corp·，Japan);平均孔径为60_80nm这种经过筛分的孔径标 准使得SEPABEADS?，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，环氧基载体在温和的条件下与酶分子的氨 基结合。最适合的载体有多活性基团，实现多点共价连接提高酶的刚性。商业化的环氧基 载体，大孔(平均粒径1701m)且载体表面带有环氧基团。N，N-亚甲基-双-丙烯酰胺-甲 基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酰胺共聚合，用于酶的共价固定化。国 外已开发出工业化应用的含活性环氧基的固定化酶载体，如SEPABEADS EC、Eupergit C， Sepabeads EC，DilbeadsTM等，国内也有用于酶固定化的载体，例如鲁抗树脂-酶固定化载 体，可以用于酶固定化。多种酶经Eupergit C固定化保留酶的活力15-100%。 PDH基因可以从多种动物、植物、微生物克隆，例如：紫狼尾草Pennisetum purpureum, 紫苏peri 1 la,水稻，西红柿，醋酸杆菌，乳杆菌、大肠杆菌，芽孢杆菌，假单胞菌，white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium , Pseudomonas sp , Saccharomyces cerevisiae, 大鼠肝，果妮 Bactrocera oleae，乳杆菌（Lactobacillus kefir)。 CHMO有多种基因来源，例如：子囊菌属的Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011， 不动菌属 Acinetobacter sp. NCIMB 9871，霉菌 Exophiala jeanselmei,玫瑰色红球菌 Rhodococcus rhodochrous，节杆菌（Arthrobacter BP2 等。 将它们的基因表达在各种宿主，例如大肠杆菌，酵母等，具体菌株如E. coli BL21 (DE3)、C41 (DE3)，SHuffle (DE3)，TGI (pBV03)等，从而得到相应的酶。 微生物的培养包括种子培养，发酵罐批量培养，可以采用间歇操作、流加操作。 大肠杆菌在葡萄糖过量或缺氧的情况下出现葡萄糖效应产生乙酸，影响菌产量和蛋 白表达，因此，采用流加操作使葡萄糖保持在一定的水平可降低葡萄糖效应。常用的流加 方式有三种：恒速流加；变速流加；指数流加。以便控制葡萄糖浓度在较低的水平，减 少乙酸生成，应用较广。 用甘油作为碳源比用葡萄糖做碳源产生的乙酸少，但是，仅以甘油为碳源时，大肠杆菌 生长速度较慢。所以可以采用葡萄糖与甘油作复合碳源，同时，采用流加操作。 培养过程中所用的各种培养基如下： 牛肉膏蛋白胨培养基(营养琼脂）：蛋白胨l〇g ;牛肉膏3g ;氯化钠5g ;琼脂15?20g ; 蒸馈水lOOOmL。 LB培养基：蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，NaCl 1%; LA平板培养基：蛋白胨1%，酵母0. 5%，NaCl 1%，琼脂1. 5%。 种子培养基：蛋白胨1%，酵母粉〇. 5%，NaCl 1%。 发酵罐培养基：蛋白胨 1. 5%，酵母膏 0. 7%，NaCl l%，Na2HP04 0. 35%，KH2P04 0 . 4%，MgS04 7H20 0· 05%，葡萄糖 5%，甘油 L 5 %。 流加培养基（g/L):葡萄糖200,甘油100,酵母粉5,胰蛋白胨10，MgS047H20 20，TES 3 mL. 根据转基因载体的抗性，选择相应的抗生素，如氨苄青霉素，卡那霉素等，添加到各培 养基中，浓度为50-200 mg/L氨苄青霉素或其他抗生素。 在发酵培养液中，要加入微量元素营养液（TES)，pH7.0.组成为：TES(g/L，N-三 (羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸）：CaCl20.5, ZnS047H20 0.18, MnS04H20 0.1, Na2-EDTA 10.05，FeCl38. 35，CuS045H20 0.16, C〇C126H20 0.18。 采用由荧光假单胞菌得到CHMO基因，在大肠杆菌中表达，用IPTG诱导CHMO表达，经 斜面、摇瓶、2级种子培养、30m3大罐培养，0. ImM的IPTG用于诱导CHM0表达，培养温度 20-30° C，0D_为0. 5-0. 8,培养时间24-36h，得到含CHMO的菌体发酵液。大罐培养采用 流加操作。用3足过滤式离心机过滤发酵液，得到含CHMO的菌体，用酶解+超声波破碎方 法破碎细胞，用PEG4000/磷酸盐体系的双水相分离酶与细胞碎片，用双水相再分离纯化一 次，得到初步纯化的CHMO酶液，待用，用于固定化，1单位酶活相应于转化1 μΜ CH0/分钟。 采用由假单胞菌得到PDH基因，在大肠杆菌中表达，用自动诱导介质ΖΥΡ-5052诱导 PDH表达，用分子伴侣载体以增加表达量，经斜面、摇瓶、2级种子培养、30m3大罐培养，细胞 在30 -35° C培养24-36h ;得到含PDH的菌体发酵液。大罐培养采用流加操作。用3足过滤 式离心机过滤发酵液，得到含TOH的菌体，用酶解+超声波破碎方法破碎细胞，用PEG4000/ 磷酸盐体系的双水相分离酶与细胞碎片，用双水相再分离纯化一次，得到初步纯化的Η)Η 酶液，待用，用于固定化。1单位酶活相应于转化1 UMCHL/分钟。 然后，将得到的2种酶液直接进行双酶共价共固定化，即将2种酶同时共价固定化在同 一载体上，亦称共价共固定化酶。载体为环氧型SEPABEADS EC-EP (HFA)，经过大量实验，结 果表明，CHMO酶液/PDH酶液=4. 5,得到的固定化酶比活最高，比活为900mU/g干载体。本 发明用此方法生产得到的固定化酶，简称固定化酶1。固定化酶1为共价共固定化的醇脱氢 酶和单加氧酶。实验表明，固定化酶1可以重复使用10次，剩余活性为50%。使用温度： 30-40° C，pH7-7. 6。1单位酶活相应于以环己醇为底物，产生1 μΜ ε-己内酯/分钟。 生物催化氧化反应过程为：反应介质：70-80%磷酸盐缓冲液（pH 7. 0)+20-30%乙酸 丁酯，鼓泡塔反应器，，装料量为55-65%，在搅拌罐里加入反应介质和环己醇，使液体温度 在30-40° C，剧烈搅拌使其乳化后，加入鼓泡塔反应器；在鼓泡塔中加入固定化酶1，此固 定化酶可以从市场上购买，也可自己生产。本发明中所用固定化酶均为自己生产，生产过程 如前述内容中所述，这里不做赘述。即，所用固定化酶为前述的固定化酶1。加入等量NADPH 和NADP+，浓度为0. Ι-lg/L，反应开始进行，在鼓泡塔底部喷入空气，通气量为1-3ν/ (ν·分 钟）（通气量/(反应液体积分钟）），反应16-20小时，结束反应。滤出固定化酶，反应液离 心破乳，分出水相和有机相，蒸出有机相中溶剂，得到产物ε -己内酯。水相、固定化酶、有 机相均可重复使用。环己醇转化率90-95%，ε-己内酯收率90-95%。ε-己内酯的选择 性为100%。由于反应时间长，且有机溶剂对酶活有影响，固定化酶重复使用10次后，酶活 还剩50%。 实施例1
[0016] 生物催化氧化反应，反应介质：80%磷酸盐缓冲液（pH 7. 0)+20%乙酸丁酯，100L 鼓泡塔反应器，使液体温度在30-40° C，在搅拌罐中加入55L反应介质、3005g环己醇，剧 烈搅拌使其乳化后，加入鼓泡塔反应器；在鼓泡塔中加入固定化酶1 100U。固定化酶可以 从市场上购买，也可自己生产。本发明中所用固定化酶均为自己生产，为固定化酶1，生产 过程如
【发明内容】
中所述，这里不做赘述。即，所用固定化酶为前述的固定化酶1。加入等量 NADPH和NADP+，各25g，反应开始进行，在鼓泡塔底部喷入空气，通气量为l-2v/(v ·分钟)， 反应16-20小时，结束反应。滤出固定化酶，反应液离心破乳，分出水相和有机相，蒸出有 机相中溶剂，得到产物ε-己内酯。水相、固定化酶、有机相均可重复使用。环己醇转化率 90-95%，ε-己内酯收率90-95%，ε-己内酯的选择性为1〇〇%。 实施例2
[0017] 生物催化氧化反应，反应介质：70%磷酸盐缓冲液（pH 7. 0)+30%乙酸丁酯， 1000L鼓泡塔反应器，搅拌罐中反应器中加入600L反应介质、40. lkg环己醇，剧烈搅拌使其 乳化后，加入鼓泡塔反应器；在鼓泡塔中加入固定化酶1 600U。加入等量NADPH和NADP+， 各lkg，反应开始进行，在鼓泡塔底部喷入空气，通气量为1.5-3ν/ (ν·分钟)，使液体温度 在30-40° C，反应16-20小时，结束反应。滤出固定化酶，反应液离心破乳，分出水相和有 机相，蒸出有机相中溶剂，得到产物ε-己内酯。水相、固定化酶、有机相均可重复使用。环 己醇转化率90-95%，ε-己内酯收率90-95%，ε-己内酯的选择性为1〇〇%。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为反应路线简图。
【权利要求】
1. 一种以环己醇为起始原料生产ε-己内酯的生产工艺，其特征在于使用共价共固定 化的醇脱氢酶和单加氧酶进行生物氧化反应，以空气为氧化剂，以一锅煮方式，将环己醇直 接氧化为ε-己内酯；反应温度为30-40°，反应pH为7.0,反应介质为磷酸盐缓冲液（pH 7.0)+乙酸丁酯2相体系。
2. 权利要求1所述的生产工艺，其特征在于反应过程如下：反应介质：70-80%磷酸盐 缓冲液（pH 7. 0)+20-30%乙酸丁酯，鼓泡塔反应器，装料量为55-65% ;在搅拌罐里加入反 应介质和环己醇，使液体温度在30-40° C，剧烈搅拌使其乳化后，加入鼓泡塔反应器；在鼓 泡塔中加入固定化酶，此固定化酶是将醇脱氢酶和单加氧酶同时共价共固定化而得到；力口 入等量NADPH和NADP+，浓度为0. Ι-lg/L，反应开始进行，在鼓泡塔底部喷入空气，通气量为 1-3ν/ (ν·分钟）（通气量/ (反应液体积?分钟）），反应16-20小时，结束反应；滤出固定化 酶，反应液离心破乳，分出水相和有机相，蒸出有机相中溶剂，得到产物ε -己内酯；水相、 固定化酶、有机相均可重复使用。
【文档编号】C12P17/08GK104195194SQ201410404425
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】刘均洪, 张媛媛, 丁丽 申请人:青岛科技大学