专利名称：增强的2-酮-l-古洛糖酸的生产的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及增强2-KL的工业生产，特别地涉及编码将2，5-二酮戊二酸从细胞的周质转运到胞质区的蛋白质的基因组的超表达。本发明提供用于在微生物中增强2-KLG生产的表达载体、方法和系统。
背景技术：
2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)可用Reichstein方法很容易地经一步化学法而被转变为L-抗坏血酸(维生素c)通常是众所周知的(Reichstein，T.等人，Helv.Chim.Acta，1934，17，311-328；Reichstein，T.等人，Helv.Chim.Acta，1933，16，561，1019)。有可表达异源酶以将开始的底物转变为2-KLG的重组微生物。重组DNA技术已被用于在草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)中以单个发酵的步骤将D-葡萄糖生物转变为2-KLG(Anderson，S.等人Science 230，144-149(1985))。然而，本研究针对的是增加2，5DKG还原酶或其他合成产物的表达而没有认识到在终产物的工业生产中底物转运的重要性。事实上，发明者的研究揭示了因还原酶超表达引起的2-KLG生产增加最小。因而需要一种方法来通过利用重组微生物的生物合成途径以增加2-KLG的工业生产，这用到除增加细胞内转变蛋白质的表达水平以外的方法。
生物膜的脂双层通常对离子和极性分子是非通透性的。这些生物膜构成了细胞的区室，使细胞的不同部分相互隔开。因而被细胞利用以合成各种产物的底物以及被细胞利用以生成能量或生长的代谢物可与利用它们的合成和/或代谢反应分隔开。至于产物的合成，不同的合成途径或其部分可发现于在细胞的不同部分。一些氧化反应可发生在细胞溶胶的外面。例如，膜结合蛋白质可用于将碳源氧化为其他中间物。腔内(Cystolic)反应或途径例如一些还原或脱氢作用也可用来将底物或中间物转变为另一种产物。当底物和合成装置位于膜的相反侧时，期望的产物的生产需要底物转位到合成反应的位置以使其能够转变为终产物。换句话说，在细胞膜内部生成的终产物需要从细胞内转位。由于细胞隔开的部分可能具有不同的环境参数例如溶质、离子、终产物等，浓度或者需要穿过通常非通透性的膜障碍物转运，所以需要一些形式的主动转运。
针对这些问题，出现了关于增加材料跨膜转运的研究。已用溶剂或裂解试剂来使膜破裂，以使得材料能够跨过膜。然而，这样的方法具有不利于宿主细胞生存力的作用。如果合成或代谢途径依赖于宿主细胞自身的代谢或分解代谢途径或由其提供能量，例如需要如NADH或NADPH的辅因子，那么破坏细胞的生存力即停止了宿主细胞进一步的或连续的合成生产。另外，虽然已在增加细胞生长方面探索了葡萄糖或其他糖类转运的增加(Parker，C.等人，Mol.Microbiol 15(5)795-802(1995))，但尚未认识到通过利用重组微生物的生物合成途径而改变细胞转运系统以增加化学终产物或中间物的工业生产。
Cornish(J.of Gen.Microbiol.，134；3111-3122(1988))讨论了放射土壤杆菌(Agrobacteriym radiobacter)葡萄糖转运和琥珀酰聚糖(succinoglucan)外聚糖(exopolysaccharide)生产之间的关系。Cornish提出葡萄糖的摄入是琥珀酰聚糖生产的主要动力学控制点，并且应该可能通过利用重组DNA方法获得更高的琥珀酰聚糖生产速率。然而Cornish的生产速率不符合工业生产规模需要。此外，葡萄糖转运中的高水平能量消耗和复杂的调节机制阻碍了而不是促使该转运的使用。
Volschenk，H.等人(Nat.Biotechnol.15253(March1997))描述了将苹果酸降解途径引入到酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)中，这是通过克隆和表达编码所述途径的异源DNA而耗尽酒中苹果酸水平来实现的。Volschenk主要关注从周围培养基中去除苹果酸，而并非任何期望的终产物的工业规模生产。
此外，有关转运系统涉及其中的起码知识很难保证能实现期望的终产物或中间物的增强生产。合成装置可能已经饱和，因而增加的底物的存在不一定导致期望的终产物增加的生产。另外，增加对除作为生产底物用途之外还被直接或间接用作代谢物的底物的转运可能不导致期望的增加的生产。
仅仅增加将底物转变为期望的终产物的酶的表达水平可能并不导致利用重组微生物的化学化合物增加的生产。需要有一种方法，能够利用重组微生物通过除增加细胞内底物表达水平之外的其它方法增加化学化合物的生产。
也需要一种方法，能够通过除增加细胞内胞质还原酶的表达水平之外的方式，提高利用重组微生物的生物合成途径工业生产2-KLG的水平。
发明概述微生物的2，5-DKG转运能力可成为期望的2-KLG生产的一个限制因子或瓶颈，特别是由于2-KLG生产是在细胞溶胶中分区室的并要求2，5-DKG从其生产、细胞外膜结合途径的位置进行转运。本发明提供了减轻所说的瓶颈的方法。
本发明提供了柠檬泛菌(P.citrea)PE1、PE6、YiaX2、PermA和PermB分离的核酸和氨基酸序列。柠檬泛菌PE1、PE6、YiaX2、PermA和PermB的氨基酸序列和核酸序列如
图1A-1E SEQ ID NO1和2所示。
本发明也提供了增强宿主细胞自2，5-DKG生物合成2-KLG的生产的改进方法。因此，提供了一种增强宿主细胞2-KLG生物合成的方法，该方法包含选择一种具有将2，5-DKG转变为2-KLG的合成途径的宿主细胞；在维持宿主细胞的完整性时增加该2，5-DKG向所说的宿主细胞中的转运；培养宿主细胞以生产该2-KLG；以及生产2-KLG。在另一个实施方案中，增加该2，5-DKG向所说的宿主细胞中的转运步骤包括将DNA转化入该宿主细胞的步骤，其中所述DNA编码一种或多种使该2，5-DKG转运到所说的宿主细胞的细胞溶胶材料中的蛋白质。所说的一种或多种蛋白质选自YiaX2、PE1、PE6、PrmA和PrmB。编码DNA也可在选自yiaX2、pe1、pe6、prmA和prmB的基因组中表达。这一种或多种蛋白质能够与SEQ ID NO_杂交。该蛋白质与SEQ IDNO或SEQ ID NO_具有至少50％或90％的一致性。在另一个实施方案中，该蛋白质包括一个包含至少31个残基的序列，该残基包括与PermA的甘氨酸119相应的甘氨酸残基或任选的与PermA的W136相应的色氨酸残基或任选的选自位于与PermA的G138相应位置的苯丙氨酸、位于与PermA的E141相应位置的谷氨酸和位于与PermA的R142相应位置的精氨酸的至少一个额外的残基。
本发明也提供了增强2，5DKG跨过内细胞膜转运到细胞溶胶中的方法，该方法包含选择一种宿主细胞；将编码一种或多种使2，5DKG转运到该宿主细胞中的蛋白质的DNA转化入该宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞选自细菌和酵母。优选地，宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)、泛菌属(Pantoea)和克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)。
本发明提供了一种增强2，5-DKG跨过内细胞膜向细胞溶胶中的转运的方法，包括选择一种宿主细胞和将编码一种或多种使2，5DKG转运到该宿主细胞中的蛋白质的DNA转化入该宿主细胞的步骤。
附图简述图1表示产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)YiaX2的DNA和氨基酸序列；PE1(环境通透酶)；PE6(环境通透酶)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)的PermA；柠檬泛菌的PermB；柠檬泛菌的YiaX2。
图2是一个表示从葡萄糖生产抗坏血酸前体2-KLG的合成途径的流程图。
图3是一个表示抗坏血酸前体2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)的合成途径的示意图。
图4是一个表示可由葡萄糖得到2-KLG的各种合成途径的流程图。Boudrant，J.，Enzym Microb.Tech.，1990，12，322-329。
图4A是一个表示D-山梨糖醇到2-KLG的合成途径的示意图，显示了该途径中反应相对于其他反应的细胞内定位和底物跨过细胞膜的转运。Saito，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.58(2/3)305-315(1998)。
图5表示D-葡萄糖(G)到2，5-DKG再到2-KLG的合成途径，显示了该途径中反应相对于其他反应的细胞内定位和各自的底物跨过细胞膜的转运。
图6是一个比较DKG转运速度与KLG生产速率的线图，显示了2，5-DKG的摄入量随时间的变化(nmoles/OD 600)(-◆-＝果糖饲料139-2a，0.0486x+0.67；-▲-＝葡萄糖饲料139-2a，y＝0.0497+0,5877；-●-＝种子烧瓶(seed flask)139-2a，y＝0.0075x+0.0569)。
图7是一个产酸克雷伯氏杆菌中抗坏血酸分解代谢的yia操纵子的示意图。
图8是一个表示由硅酮油转运测定测量的产酸克雷伯氏杆菌的2，5-DKG摄入量(nmol)图(-◆-＝实验者+异丙基-β-D-硫代半乳糖苷[IPTG]；-▲-＝ΔyiaaX2+IPTG； ＝实验者-IPTG)图9是一个表示对来自柠檬泛菌、产酸克雷伯氏杆菌和环境来源的通透酶的选择设计的示意图。
图10是一个表示产酸克雷伯氏杆菌菌株中2，5-DKG摄入活性的条线图(YiaX2、pcp1、pcp10、pcp32、pK1、环境来源#1和环境来源#6)。
图11是一个表示具有各种DKG通透酶(139-2A、139-2A+PCP32、139-2A+PCP10、139-2A+PK1、139-2A+PCP1)和在相同质粒构建体(pBCL 1920)中的139-2A+PE6的摇瓶的2，5-DKG摄入测定的条线图，在28℃测量了DKG摄入速率(g/l/hr)。
图12是一个表示由于超表达的DKG通透酶的比生产力增加/比9A-9B。生产速率(g/L/hr)的线图(-◆-＝野生型；-x-＝WT、prmA)图13是一个膜表面PermA转运蛋白的示意图。推定的跨膜结构域编号为I-XI。保守残基的位置以粗体显示。N是氨基端，C是羧基端。推定的柠檬泛菌通透酶A(SEQ ID_)跨膜结构域是用从http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframeO.html上可得到的工具推断的。
图14是一个相应于残基G119s到142的保守的氨基酸序列。
详述定义转运蛋白定义细菌通道转运蛋白指那些通常为TC分类#1.A的转运蛋白(Saier，M.等人，1998，微生物生理学进展(Advances inMicrobial Physiology(Poole，R.K.，d.)pp.81-136，AcademicPress，SanDiego，CA.)。(“TC”代表“Transport Council”，即一种考虑到转运蛋白的系统发育方面的分类系统。)这些转运蛋白通常通过一种非能量依赖性易化扩散机制用一种跨膜孔道来转运底物、离子或其他材料。
初级转运蛋白指那些通常为TC分类TC#3.A的转运蛋白(Saier，M.等人，1998)，即那些利用化学能完成底物的主动摄入和转运排出的，一般以ATP水解形式作为能量偶联方式。
基团转位系统指TC分类为TC#4.A中的转运蛋白(Saier，M.等人，1998)，即伴随转运而磷酸化其底物的转运蛋白。这类的成员通常是细菌特异性磷酸转移酶系统(PTS)的部分，且其特征在于与磷酸烯醇丙酮酸(PEP)利用的氧化相偶联。
次级转运蛋白指那些通常为TC分类#2.A的转运蛋白(Saier，M.等人，1998)，即那些通常利用化学渗透能例如以质子梯度的形式提供能量以跨膜转运底物、离子或终产物的转运蛋白。
主要易化物超家族(major facilitator superfamily，MFS)指通常为TC分类#2的次级转运蛋白(Saier，M.等人，1998)。
转运蛋白指任何允许化学化合物跨膜转位而从一个细胞或细胞区室进或出的大分子。转运蛋白已知为或被称为通透酶。虽然不限于一个特定的理论，但认为转运蛋白是一种与膜相互作用的蛋白质，该蛋白质的部分从膜的外表面伸出、穿过膜且从膜的内表面伸出。
主动转运指与能量消耗例如腺苷三磷酸(ATP)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的水解偶联的转运。
阴离子/阳离子同向转运蛋白(symporter)指利用化学渗透梯度来跨膜转运底物的转运蛋白(TC类14)。它们也指底物/H+同向转运蛋白。
TMS指跨膜结构域。
途径定义“胞质的”指位于内细胞膜内。
“外源底物”指在合成反应的隔膜相反面发现的材料，例如当底物将被细胞内合成途径或合成途径的细胞内部分转变为期望的终产物或中间物时，指内细胞膜外面。
“细胞外”或“内细胞膜外面”指位于与胞质相反的膜一侧的细胞位置，包括但不局限于周质。
“内细胞膜”指将胞质与周质分隔开的障碍物。
“膜”指对底物有内在非通透性的脂双层。
“细胞内”指位于最靠近或作为细胞溶胶的膜一面的细胞部分。细胞内也包括胞质。
“细胞内反应”指位于胞质内的细胞材料即包含在内细胞膜内的材料的合成反应或生物转变。
“限速步骤”指2-KLG生物合成途径的步骤，其中该步骤转变的增加可导致2-KLG生产的增加。
“增强生产”指期望的合成反应中间物、终产物或前体的增加的效价(总量)，通常以反应过程中获得的gm/l/hour的增加来测量。它也可指期望产物生产速度的增加，通常以g/l每单位时间的重组产物来测量，其中生产的终产物、中间物或前体作为DNA转化的结果而增加，该DNA编码至少一种在超表达的转运蛋白存在时增加底物跨膜转运的蛋白质。
“底物”指由合成反应进行生物转变的2，5-DKG，胞质反应位置与底物是由膜分隔的。
“合成反应”指底物到中间物或终产物的重组生物转变。
2，5-DKG还原酶指能够立体选择性地催化2，5-DKG到2-KLG的转变的蛋白质。
2，5-DKG转运蛋白指能够将2，5-DKG跨过内细胞膜转运以由2，5-KLG还原酶将其转变为2-KLG的蛋白质。
表达定义启动子指引导RNA聚合酶在适当位点启动基因转录以生成信使RNA的DNA元件，该信使RNA一旦被细胞的翻译装置翻译则能够形成多肽。
“上游激活序列”是正作用性DNA结合调节物的结合位点。如其名字所显示的，上游激活序列在转录起始位点的上游且是核酸。
调节区指DNA上调节基因表达的区域。这种修饰的一种机制是一些调节区充当蛋白质(也已知为阻抑物)的结合位点。一旦结合，阻抑物可妨碍RNA聚合酶转录基因的能力。
表达系统包括一种或多种蛋白质和/或核酸，当它们一起作用时可以增加宿主细胞中蛋白质的表达。表达系统可在一种或多种质粒中编码，且可与编码目的蛋白质的基因在或不在相同的质粒上。
短语“功能性连接的”或“功能性偶联的”表示调节元件(DNA或蛋白质)为了发挥其功能而物理地相互作用。这可以是蛋白质/蛋白质的、DNA/蛋白质的或DNA/DNA的相互作用。例如，DNA结合调节物与启动子相互作用，但是编码它们的基因可位于染色体上的不同位点。同样地，编码元件的基因相互间和与编码目的蛋白质的基因间可位于不同的质粒上而仍然一起发挥作用来调节蛋白质的表达。
一般地，当描述蛋白质和编码它们的基因时，基因的术语不是大写的而是斜体的，也就是permA。蛋白质的术语通常为正常文字，且首字母大写，也就是PermA。
生物体定义“细菌”包括裂殖菌纲(Schizomycetes)的微生物。细菌可为革兰氏阴性的或革兰氏阳性的。革兰氏阴性细菌包括属大肠杆菌属(Escherichia)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、耶尔森氏菌属(Yersenia)、志贺菌属(Shigella)、弧菌属(Vibrio)、不动杆菌属(Acinetobacter)、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)的成员。革兰氏阳性细菌包括属芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)的成员。
革兰氏阴性细菌可为泛菌(pantoeans)，是泛菌属成员的菌株。优选的细菌是柠檬泛菌。柠檬泛菌有时也被称为草生欧氏杆菌(Erwinia herbicola)或Acetobacter ceremius。
如此处所用的术语“分离的”或“纯化的”指除去至少一种与其天然联合的成分的核酸或氨基酸。
优选实施方案详述本发明的一个实施方案是用包括编码表达系统的核酸的质粒转化宿主细胞的方法。本发明的另一个实施方案是用包括编码一种或多种增加底物跨膜转运的蛋白质的DNA的质粒转化宿主细胞的方法。宿主细胞是本发明的质粒能够通过如转化而被插入的细胞。宿主细胞优选地为细菌，更优选地为泛菌属、大肠杆菌属、克雷伯氏杆菌属或芽孢杆菌属。
在另一个实施方案中，如果包括了调节元件，那么这样的表达系统的元件来自大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。在一个实施方案中，宿主细胞优选地为革兰氏阴性细菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是泛菌属。相同的宿主细胞可用另外一个包括编码一种或多种转运蛋白的核酸的质粒转化。优选地，该转运蛋白为编码的MFS转运蛋白，更优选地为阴离子/阳离子同向转运蛋白。可作为范例的转运蛋白包括那些柠檬泛菌或产酸克雷伯氏杆菌和异源来源的yiaX2、permA、permB、pe6、pe1编码或表达的蛋白。
本发明提供了增强宿主细胞2-KLG的生物合成生产的新方法，这是通过增加2，5-DKG的转运以改进目的终产物的合成途径和生产的瓶颈而实现的，特别是当将转运蛋白重组地引入宿主细胞并超表达时。
本发明的一个实施方案是用包括编码表达系统的核酸的质粒转化宿主细胞。宿主细胞是本发明的质粒能够通过如转化而被插入的细胞。宿主细胞优选地为细菌。在一个实施方案中，宿主细胞优选地为革兰氏阴性细菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是泛菌(pantoen)。优选地，宿主细胞是柠檬泛菌，且如果包括了调节元件，则这样的表达系统的元件来自泛菌属。相同的宿主细胞可用另外一个包括编码一种或多种转运蛋白的核酸的质粒转化。优选地，该转运蛋白为来自柠檬泛菌的yiaX2、permA、permB、pe6、pe1编码和表达的。
合成反应本发明提供了增加的2，5-DKG跨膜转运以增强2，5-DKG自2-KLG的生产。增加的转运提供了2，5-DKG跨过将2，5-DKG与还原反应的细胞内位置分隔的膜的转位(图2和3)。
本发明与抗坏血酸中间物合成一起是特别有用的，例如2，5-DKG向2-KLG的转变；山梨糖或山梨糖醇经山梨糖酮(sorbosone)向2-KLG的转变；5-酮-D-葡糖酸(5-KDG)到L-艾杜糖酸的还原；以及5-酮-D-葡糖酸到L-葡糖酸的还原。这些途径的每一个特征都在于合成途径的一部分即合成反应位于胞质内，例如，2，5-DKG被2，5DKG还原酶的还原；L-山梨糖酮被山梨糖酮脱氢酶向2-KLG的还原；5-酮-D-葡糖酸(5-KDG)被5-KDG脱氢酶向L-艾杜糖酸的还原；以及5-酮-D-葡糖酸被5-KDG还原酶向L-葡糖酸的还原。这些途径特征也在于必须跨膜转运底物如2，5-DKG、L-山梨糖酮等以被位于胞质内的合成反应进行生物转变。
底物是通常在没有一些主动转运机制时不能有效地通过膜的物质。优选地，这些底物包括但不局限于抗坏血酸中间物(2，5-DKG、山梨糖酮)。另外，底物是一种在工业规模上转运以用作合成用途而通常不被宿主细胞用作代谢用途的物质。工业规模指效价和容量的生产力大于1gm/升/小时，优选地大于2g/l/h，更优选地大于3g/l/h，并且更加优选地大于5g/l/h。在另一个实施方案中，生产力效价在2到14gm/l/小时之间，优选地为3到12g/l/h之间，更加优选地为5到10g/l/h之间，为一个经济上可行的工业生产方法。尤其优选地底物包括2，5-DKG和山梨糖酮。本发明的发明方面在这些实施方案中尤其有用。
在本发明的实践中尤其有用的一个反应是2，5-DKG的跨内细胞膜转运以被胞质内脱氢酶2，5-DKG还原酶将其进行胞质还原而生成2-KLG。(Boudrant，J.(1990)Enzyme Microb.Technol.1990322-329)。2，5-DKG是由2-酮-D-葡糖酸(2-KDG)被膜结合的2-酮葡糖酸脱氢酶转变而来的。2-KDG是从葡萄糖经过D-葡糖酸(GA)的氧化作用转变而来的。发明者认识到2，5-DKG跨内细胞膜转运到胞质还原为2-KLG的位点可通过DNA编码的2，5-DKG转运蛋白的增加来实现。
在本发明的实践中的尤其有用的另一个反应是山梨糖酮即经由山梨糖、山梨糖醇生产2-KLG的一个中间物的转运(Saito，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.58(2/3)309-315(19987))。从山梨糖醇和/或山梨糖向山梨糖酮的转变是由山梨糖醇或山梨糖转变为2-KLG的途径中的一个步骤(Boudrant，J.，1990；Saito(1997))。下面是对根据本发明的山梨糖酮转运蛋白工程化的讨论。
如Saito所描述的，D-山梨糖到2-KLG的途径包括L-山梨糖脱氢酶(SDH)将L-山梨糖氧化为L-山梨糖酮，随后是L-山梨糖酮脱氢酶将L-山梨糖酮氧化2KLG。已描述了一个由膜结合的脱氢酶将D-山梨糖醇转变为L-山梨糖酮的重组宿主细胞(Saito，Y.等人(1997))。然后L-山梨糖酮被从细胞周质转运以被胞质内的L-山梨糖酮脱氢酶还原。已认识到将山梨糖酮转运蛋白超表达而促进将山梨糖酮中间物转运到2-KLG转化途径中具有有利作用。
D-葡萄糖到2-KLG的一个可选择的途径包括将D-葡糖酸氧化为5-酮-D-葡糖酸(5KDG)，后者再被还原为L-艾杜糖酸(IA)或L-葡糖酸以氧化为2KLG。(Boudrant，J.，(1990))。也可通过5KDG转运蛋白的超表达促进5-酮-D-葡糖酸到细胞溶胶的转运，以便由酮还原酶还原。
在另一个实施方案中，合成反应可为胞质外的或相对于底物位于膜的外面。第一个反应的终产物可为中间底物，用于位于膜的相反面的第二个反应中。例如，在来自Japanese persimmon的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)T-100(FERM BP-4188)中自D-山梨糖醇合成2-KLG时，D-山梨糖醇被胞质内L-山梨糖醇脱氢酶转变为L-山梨糖可产生一种中间物，该中间物跨过细胞膜被转运出胞质，以被膜结合的L-山梨糖脱氢酶转变为L-山梨糖酮。因而，发明者预期可增加将胞质中间物即一种底物从内膜的胞质侧跨膜到膜外的转运以进行随后的转变。Saito，Y.，(1997)虽然一个优选实施方案包括位于单一的生物体里的合成反应或途径，但位于不同的生物体内的不同反应也是本发明者所预期的。例如，在从葡萄糖生产2-KLG的混合的培养系统中，葡萄糖到中间物2，5-DKG的转变可发生在一种生物体中(醋单孢杆菌属(Acetomonas)、醋杆菌属、葡糖杆菌属、欧氏杆菌属)，而该中间物向目的抗坏血酸中间物2-KLG的转变发生在第二个生物体中(短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属(Corynebacterium))。参见授予Sonoyama(1976)的美国专利第3,963,574号。也参见Hoshino，美国专利第5,312,741号。
因此，合成反应可生成一种自身可在由细胞膜分隔的另一个细胞位置被转变的中间物。在这个实施方案中，终产物可为随后的反应的中间底物。
确定限速步骤的方法在生产2-KLG中增加2，5-DKG跨过内细胞膜到胞质细胞位置的转运的一个原因是因为本发明者认识到它是2，5DKG向2-KLG转变的限速步骤。确定这样一个步骤是否限速步骤是通过分析该途径、估定每一步骤的生产以及改变可被该途径用于转变的2，5-DKG的量以确定是否这种增加2，5-DKG可导致该途径总产量的增加来完成的。在确定了2，5-DKG的增加可增强2-KLG的生产时，增加底物的转运将增强2-KLG的生产。
限速步骤的确定可通过比较微生物的生产力来进行。确定途径部分的限速状态的一个方法是在该途径的各个点比较增加了一种特殊化学化合物的存在之前或之后中间物的生产力。通过编码2，5-DKG还原酶的DNA的超表达增加还原酶的存在并不导致2-KLG生产的增加。图_。然而，增加在细胞溶胶存在的2，5-DKG的量导致了2-KLG生产的增加。因而本发明者认识到增加2，5-DKG的量是2-KLG生产中的一个限速步骤。
确定途径部分的限速状态的一个方法是在途径的各个点比较增加了一种特殊的生物转化物的存在之前或之后中间物的生产力。如果尽管增加了中间物或超表达了转变途径，而终产物的生产并没有增加，那么该步骤不是限速性的，因而影响该合成反应的具体酶的超表达可能不导致生产增加。个别中间物的量可由各种直接或间接方法确定。间接方法包括用线内(in-line)测量法如气体分压来测量呼吸参量的消耗或产生，如二氧化碳生产、氧气消耗。中间物的直接测量可通过各种本领域公知的分析技术来实现，它们描述于Lazarus，Analyt.Biochem 157，360-366(1986)及其中引用的参考文献描述(在此处引用作为参考)，包括但不局限于纸、气相、液相和薄层层析以及化学和酶促测定。高效液相层析方法学，尤其如Lazarus，1986提出的，是尤其有用的。本发明者所使用的一种方法包括Waters 2690 HPLC和Waters 410差示折光计(differentialrefractermeter)，设置用流速为1ml/分的50mM乙酸盐缓冲液作为洗脱介质和Dyonex lonpac AS-10离子交换柱(4×250mm)来分离并确定存在的化学化合物的量。
由本发明者使用的另一种确定在肉汤中生产的2-klg的纯度的方法是通过总碳分析的。
因而在一个实施方案中，转运的活性可通过测量在细胞外底物存在时产物的生产而在底物可被转变为产物的任何细胞中进行测量。例如，在天然地或重组地表达2，5-DKG还原酶的细胞中，细胞内2，5-DKG被转变为2-KLG。当提供细胞外2，5-DKG时，在有2，5-DKG通透酶的表达时细菌细胞生产2-KLG的能力是表达的通透酶将2，5-DKG转运入细胞的能力的量度标准，因而也是其2，5-DKG通透酶活性的量度标准。例如，细胞内2-KLG可用HPLC或本领域公知的其他灵敏检测方法检测。2，5-DKG的其他代谢产物也可经类似的方法检测。
2，5-DKG转运蛋白基于转运模式和能量偶联机制，有四种不同类型的功能性特征化的转运系统。第一种是细菌通道蛋白质(TC#1.A)，其通过一种能量非依赖性易化扩散机制利用跨膜孔道进行转运。第二种转运系统即易化物(faciliators)和/或次级转运蛋白(secondarytransporter)(第二类，TC#2.A)代表了转运蛋白的最大种类。第三类ATP驱动的初级主动转运蛋白利用ATP水解作为溶质主动摄入和/或排出的能量偶联模式。最后一类由在转运中使其底物磷酸化的转运蛋白组成(TC#4.A)。
在第二个家族中，类型II家族中最大的是主要易化物超家族(MFS)和氨基酸多胺胆碱(amino acid polyamine choline，APC)家族(Reizer等人)。这些第二转运蛋白超家族可进一步分为三类(1)质子动力(proton motive form，pmf)驱动的，(2)钠动力(sodium motive force，smf)驱动的，和(3)其他离子或溶质驱动的交换剂。这些转运系统催化溶质的单向转运、反向转运和/或同向转运。次级主动转运蛋白已在大肠杆菌、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、幽门螺杆菌(H.pylori)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、生殖道枝原体(M.genitalium)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、詹氏甲烷球菌(M.Jannaschii)中鉴定(Paulsen等人1998 J.Mol.Biol.277573-592)。这个种类的所有成员均为细菌特异性磷酸转移酶系统(phosphotransferasesystem，PTS)的部分。次级转运蛋白一般是多中心(polytopic)膜蛋白质，通常大多数初级载体有12TMS，即一种驱动基团转位的能量的化学形式，是ATP-依赖性系统，如同大多数ATP-结合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族成员一样，或是用PEP作为糖类摄入和磷酸化的磷酰基供体的PTS。次级转运蛋白与初级转运蛋白(ABC转运蛋白)区别在初级转运蛋白利用ATP，利用细胞的能量。另外，ABC转运蛋白的使用需要一种更加复杂的转运蛋白系统，即包含两个疏水的膜内在结构域和两个ATP-结合结构域(Hosie等人Molecul.Microbiol(2001)40(6)，1449-1459)。那些负责溶质摄入的ABC转运蛋白也需要溶质结合蛋白质(solute-bindingprotein，SBP)的存在。因而改进的ABC转运系统的基因工程需要比次级转运蛋白性质更复杂的表达和转化。
在一个实施方案中，编码至少一种可增加底物跨内细胞膜的转运的蛋白质的DNA选自醋杆菌属、假单胞杆菌属、杆菌属(Bacterium)、蓝球菌属(Cyanococcus)、微球菌属、短杆菌属、节杆菌属(Arthrobacter)、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)、醋单孢菌属、葡糖杆菌属和欧氏杆菌属。优选的生物体选自大肠杆菌、泛菌属和克雷伯氏杆菌属。泛菌属是用作宿主细胞的最优选的生物体。
尤其有用的转运蛋白包括那些由yiaX2(来自产酸克雷伯氏杆菌属)、pe1和pe6(来自环境来源)以及来自柠檬泛菌的yiaX2、permA和permB。yiaX2、permA和permB基因可被发现于各种细菌中，如欧氏杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、大肠杆菌、Agrobactor、耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、假单胞杆菌属、芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。物种包括如鼠疫耶尔森氏菌(Yersenia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yerseniapseudotuberculosis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
本发明提供了可被用作编码所述至少一种可增加底物在宿主细胞中跨膜转运的酶的DNA的YiaX2多核苷酸、PermA多核苷酸、PermB多核苷酸、Pe1多核苷酸和Pe6多核苷酸。YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的多核苷酸序列可由图13和14确定，该图表示柠檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6与克雷伯氏杆菌属YiaX2氨基酸的序列对比。
本发明包含分别编码转运蛋白YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物，由一种或多种与柠檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6分别具有至少65％、70％、80％或至少90％或至少95％的一致性的核苷酸序列编码，只要该同系物编码一种能够通过调节微生物中底物的转运而发挥功能的蛋白质即可，优选地为增加转运。如可由本领域的技术人员所理解的，由于遗传密码的简并性，多种多核苷酸即YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸变体可编码柠檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6转运蛋白。本发明包含所有这样的多核苷酸。
柠檬泛菌、产酸克雷伯氏杆菌和环境分离物YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6转运蛋白的微生物多核苷酸同系物可通过基因组或cDNA来源的微生物核酸的核酸杂交来鉴定。多核苷酸同系物的序列可由利用编码所述至少一种将2，5-DKG转运入宿主细胞胞质材料中的多核苷酸的探针、部分或片段的DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。因此，本发明提供了一种检测YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物的方法，包括使核酸样品与来自YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核酸序列的部分或全部进行杂交。
也包含在本发明的范围之内的是能够在中等到最大的严格性的条件下与图1所示YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核苷酸序列的部分或整体杂交的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸序列。杂交条件是基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)的，如Berger和Kimmel(1987，分子克隆技术指南，酶学方法(Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)，Vol152，Academic Press，San DiegoCALIF。)所讲授的，此处引用作为参考，并且杂交条件确定了如下所解释的定义的“严格性”。
“最大严格性”一般发生在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；“高严格性”约为比Tm低5℃到10℃；“中间严格性”约为比Tm低10℃到20℃以及“低严格性”约为比Tm低20℃到25℃。如可由本领域的技术人员所理解的，最大严格性杂交可被用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等的或低严格性的杂交可被用于鉴定或检测多核苷酸序列同系物。
如此处所用的术语“杂交”应包括“核酸的一条链通过碱基配对而与互补链结合的过程”(Coombs J(1994)生物技术词典(Dictionary of Biotechnology)，Stockton Press，New York N.Y.)。
如在聚合酶链式(PCR)中进行的扩增的方法由Dieffenbach CW和G S Dveksler描述(1995，PCR引物，实验室手册(PCRPrimer，a Laboratory Mannul)，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.)。来自图1A-1E的PermA核苷酸序列的至少约10个核苷酸和多达60个核苷酸，优选地约12到30个核苷酸，更优选地为20-25个核苷酸的核酸序列可被用作探针或PCR引物。
氨基酸序列如图1所示的柠檬泛菌PermA多核苷酸编码柠檬泛菌PermA。柠檬泛菌permA基因确定了一种436个残基且计算分子量为47801.94道尔顿的蛋白质。平均的亲水性为0.62，等电点为9.24。permA蛋白质是具有11个推定的跨膜螺旋的膜内在蛋白质。这些结构域与来自其他生物体的其他已知转运蛋白显示了显著的序列相似性，发现与来自假单胞杆菌属的KDG转运蛋白之间有最高的相似性。如图8B所示的31个残基的一段显示了高度保守的片段，其中柠檬泛菌permA转运蛋白第119位为甘氨酸(G)、第122位为谷氨酸(E)、第127位为苯丙氨酸(P)、第136位为色氨酸(W)、第138位为苯丙氨酸、第141位为谷氨酸(E)、第142位为精氨酸(R)。这个高度保守的片段与上表3和4的阴离子/阳离子同向转运蛋白(ACS)家族(Pao，S.S.，1998)的保守残基一致。图8显示了对应于PermA的残基119到141的保守区。推定的跨膜结构域(I-XI)以灰色阴影显示。图8B的跨膜结构域是由SOUCI程序确定的。
在本发明范围内的转运蛋白包括那些由来自柠檬泛菌、产酸克雷伯氏杆菌和环境来源的yiaX2、permA、pe1、pe6和permB所编码的。yiaX2、permA、pe1、pe6和permB基因可发现于多种细菌物种，例如欧氏杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、大肠杆菌、Agrobacter、耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、假单胞杆菌属、芽孢杆菌属。
本发明提供了YiaX2多核苷酸、PermA多核苷酸、PE1多核苷酸、PE6多核苷酸和PermB多核苷酸，它们可被用作在宿主细胞中编码所述至少一种可增加2，5-DKG跨膜转运的蛋白质的DNA。YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的多核苷酸序列可由图确定，后者显示了柠檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6与克雷伯氏杆菌属YiaX2的氨基酸序列对比。
本发明包含分别编码转运蛋白YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物，它们由一种或多种与柠檬泛菌YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6分别具有至少65％、70％、80％或至少90％或至少95％一致性的核苷酸序列编码，只要该同系物编码一种能够通过调节底物在微生物中的转运而发挥功能的蛋白质即可。如可由本领域的技术人员所理解的，由于遗传密码的简并性，多种多核苷酸即YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸变体可编码柠檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6因子的转运蛋白。本发明包含所有这样的多核苷酸。
柠檬泛菌、产酸克雷伯氏杆菌和环境分离物YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6转运蛋白的微生物多核苷酸同系物可通过基因组或cDNA来源的微生物核酸的核酸杂交来鉴定。多核苷酸同系物的序列可利用在图中公开的探针、部分或片段由DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。因此，本发明提供了一种检测YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物的方法，包括使核酸样品与来自YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核酸序列的全部或部分进行杂交。
也包含在本发明的范围之内的是能够在中等到最大严格性的条件下与图1的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核苷酸序列的部分或整体杂交的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸序列。杂交条件是基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)的，如Berger和Kimmel所讲授的(1987，分子克隆技术指南，酶学方法(Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)，Vol152，Academic Press，San DiegoCALIF。)，此处引用作为参考，并且杂交条件确定了如下所解释的定义的“严格性”。
“最大严格性”一般发生在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；“高严格性”约为比Tm低5℃到10℃；“中间严格性”约为比Tm低10℃到20℃以及“低严格性”约为比Tm低20℃到25℃。如可由本领域的技术人员所理解的，最大严格性杂交可被用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等的或低严格性的杂交可被用于鉴定或检测多核苷酸序列同系物。
如此处所用的术语“杂交”应包括“核酸的一条链通过碱基配对而与互补链结合的过程”(Coombs J(1994)生物技术词典(Dictionary Biotechnology)，Stockton Press，New York N.Y.)。
如在聚合酶链式(PCR)中进行的扩增的方法由Dieffenbach CW和G S Dveksler描述(1995，PCR引物，实验室手册(PCRPrimer，a Laboratory Mannul)，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.)。来自图1的PermA核苷酸序列的至少约10个核苷酸和多达60个核苷酸，优选地约12到30个核苷酸，更优选地为20-25个核苷酸的核酸序列可被用作探针或PCR引物。
II.表达系统本发明提供了在微生物包括细菌和酵母中增强目的异源或同源蛋白质的生产和转运的表达系统。
a.编码序列在本发明中，载体包含至少一个拷贝的编码转运蛋白的核酸，优选地包含多拷贝。在一个优选实施方案中，微生物是泛菌属。在另一个优选实施方案中，微生物是克雷伯氏杆菌属。在一个实施方案中，利用包含permA基因的多核苷酸来构建载体。这些多核苷酸区段可包含比permA更多量的残基。例如，pcp1、pcp10和pcp32是柠檬泛菌基因组操纵子或结构域的核苷酸片段。这些多核苷酸区段分别为约9kb、13kb和67kb。在一个优选实施方案中，编码柠檬泛菌PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6的多核苷酸，或者其片段，或者融合蛋白质或编码PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6的氨基酸变体的多核苷酸同系物序列可被用来生成重组DNA，从而在革兰氏阳性细菌中分别指导PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6或者其氨基酸变体的表达。在一个实施方案中，宿主细胞选自醋杆菌属、假单胞杆菌属、杆菌属(Bacterium)、蓝球菌属(Cyanococcus)、微球菌属、短杆菌属、节杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、醋单孢菌属和葡糖杆菌属。优选的宿主细胞选自大肠杆菌、泛菌属和克雷伯氏杆菌属。柠檬泛菌和克雷伯氏杆菌属是用作宿主细胞的最优选的生物体。泛菌属也已知为欧氏杆菌属。
如可被本领域的技术人员所理解的，生产具有非天然存在的密码子的多核苷酸序列是有利的。例如，可选择由特殊宿主细胞所偏好的密码子(Murry E等人(1989)Nuc Acids Res 17477-508)以增加表达的速率或生产具有想要的性质的重组RNA转录物，例如比从天然存在的序列生产的转录物更长的半衰期。
可依照本发明而被使用的改变的PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸序列包括不同核苷酸残基的缺失、插入或替代，导致分别编码相同或功能上相当的PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6同系物的多核苷酸。如在此处所用的，“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列的改变，其中不存在一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
如在此处所用的，“插入”或“添加”是与天然存在的革兰氏阳性PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6相比，分别导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加的核苷酸或氨基酸序列的改变。
如在此处所用的，“替代”分别由不同的核苷酸或氨基酸置换一个或多个核苷酸或氨基酸而产生。
编码的蛋白质也可显示产生沉默改变的氨基酸残基的缺失、插入或替代，导致功能上相当的革兰氏阳性PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6变体。细致的氨基酸替代是在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性的基础上进行的，只要变体保留了调节转运、优选地为增加转运的能力。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的极性头部基团和相似的亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明的PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸可被操作以修饰基因产物的克隆、加工和/或表达。例如，可用本领域公知的技术引入突变，如用定点诱变插入新的限制酶切位点来改变密码子的偏好性。
在本发明的一个实施方案中，可将PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸连接到异源的序列上以编码融合蛋白质。也可操作融合蛋白以便在PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸序列和异源蛋白质序列之间包含切割位点，从而PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6蛋白质可从异源部分上切割下来并纯化。
b.载体序列用于在微生物中表达本发明的转运蛋白的表达载体包含至少一种与选自PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6的转运蛋白因子相关联的启动子，该启动子在宿主细胞中是有功能的。在本发明的一个实施方案中，启动子是所选择的转运蛋白的野生型启动子，而在本发明的另一个实施方案中，启动子对转运蛋白而言是异源的，但在宿主中仍然是有功能的。
与编码目的蛋白质或多肽的异源核酸相关联的额外的启动子可通过重组DNA技术而被引入。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞能够过表达异源的蛋白质或多肽，并重组地引入编码一种或多种转运蛋白的核酸。在本发明的一个优选实施方案中，编码至少一种或多种增加底物转运的蛋白质的核酸可稳定地整合入微生物基因组。在另一个实施方案中，宿主细胞被加工成过表达编码一种或多种增加所说的底物转运入该宿主细胞的本发明蛋白质的DNA，且编码异源蛋白质或多肽的核酸是通过重组技术引入的。本发明包含能够使本领域技术人员所公知的转运蛋白超表达的宿主细胞，包括但不局限于那些在表1、2或3中鉴定的或本领域技术人员所公知的或将来鉴定的转运蛋白。
在一个优选实施方案中，表达载体包含多克隆位点盒，该盒优选地包含至少一个对载体是唯一的限制性内切酶位点，以使得对核酸的操作容易。在一个优选实施方案中，表达载体也包含一个或多个选择性标记。如在此处所用的，术语选择性标记指能够在革兰氏阳性宿主中表达、从而便于对那些含有载体的宿主进行选择的基因。这样的选择性标记的实施例包括但不局限于抗生素如红霉素、壮观霉素(aspectinomycin)、氯霉素和四环素。也提供了其中的转运蛋白由与SEQ ID NOS[_________]所示的DNA序列有至少90％的同源性的核酸编码的实施方案。优选地，同源性为至少95％，更优选地为至少98％。同源性可以通过将请求保护的氨基酸或DNA序列与另一个序列排列起来并以总序列的百分比确定有多少氨基酸或核苷酸相匹配而确定。同源性也可用商业上可获得的序列分析软件程序之一来确定，例如序列分析软件包6.0版(Sequence Analysis Software PackageVersion 6.0)中的TFastA Data Searching Program(GeneticComputer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，Madison，Wis.53705)。
可以利用如在此处所描述的杂交或利用简并引物的PCR来筛选同源序列。Chen和Suttle(1995)Biotechniques 18(4)609-610，612。
在本发明的几个实施方案中，也提供了可在严格的条件下分别与FIGS.和SEQ ID NOS所示的DNA或其片段杂交的核酸。严格的杂交条件包括本领域的技术人员所公知的严格的杂交和洗涤条件。杂交和适当的严格条件描述于Sambrook等人1989《分子克隆》(Molecular Cloning)2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York。
从具有编码转运蛋白质的转化DNA的宿主细胞中增加重组肽生产的方法增加底物从一个细胞位置到另一个的转运的特别有力的方法涉及从转化的宿主细胞基因组中缺失代谢转移(metabolicdiversions)及伴随提供可增加想要的底物的转运的DNA。这可通过向细胞提供缺失-转运蛋白嵌合体或融合蛋白质而方便地实现，其中缺失部分的代谢转移被最小化，而转运蛋白能力部分是超表达的。化学地融合的多肽或基因组的改组部分是可能发生的，但是重组蛋白质自然地是如此方式使用时最优选的。用于这样的嵌合体的适当通透酶片段的鉴定已在上面此处描述。
至于这些融合蛋白质的转运部分，任何含有足够的一级序列信息以赋予嵌合体以转运活性的通透酶衍生序列在这种情况中都是有用的。然而，经常优选地使用整个转运蛋白酶，因为这在方法学方面是更直接的。此外，可参看在各种发表的参考书目中提供的大量的信息以助于鉴定适当的转运蛋白或其片段。
转化本发明也涵盖增大或增加细胞生产生物活性多肽的能力，这样的多肽可增加底物从第一个细胞位置跨膜转运到第二个细胞位置。在一些情况，这可通过使与底物向另一个细胞位置转运以进行进一步生物转变有关的蛋白质超表达而实现，例如次级转运蛋白阴离子/阳离子同向转运蛋白(Saier，1988)，在一个实施方案中为阴离子/阳离子H+同向转运蛋白。本发明者预期的示例性同向转运蛋白包括来自产酸克雷伯氏杆菌和柠檬泛菌的通透酶YiaX2、PE1、PE6、prmA和prmB。
与维持宿主细胞的生存力和生产能力尤其是转运能力有关的转运蛋白的表达是重要的。在所述途径是需要NADPH或NADH的反应的情况下，宿主细胞持续的生存力是由想要的途径进行成功的连续生产所必要的。在确定维持生物体的生存力同时可被超表达的多拷贝数或启动子时应牢记某些需要考虑的事项和因子。通常，转运蛋白的过度表达对细胞是有害的，这是因为在膜中掺入转运蛋白的可用空间是有限的。因此，一种转运蛋白的非常过度的超生产可减少与其他养分从培养基的转运有关的其它转运蛋白在膜中的掺入。加工细胞类型特异性转录因子的超表达可增加或稳定工程改造的宿主细胞的转运蛋白性能。
细菌宿主细胞中H+同向转运蛋白的稳定超表达适用于几个目的。它可在维持微生物的生存力时增加转基因的表达。同向转运蛋白的超表达比ABC转运蛋白的超表达更简单，这是因为同向转运蛋白不需要ABC转运蛋白的多重成分的大量编码。第三，通过使次级转运蛋白而不是ATP或PTS偶联转运蛋白质超表达，可使宿主细胞的能量需求的转移最小化。
在本发明的一个实施方案中，编码本发明一种或多种转运蛋白的核酸是通过能够在宿主细胞中复制的表达载体而引入宿主细胞的。泛菌属的适当的复制型质粒描述于Sambrook等人1989《分子克隆》(Molecular Cloning)2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，在此特别地引入作为参考，这是基于泛菌属能维持与大肠杆菌相同质粒的复制的事实的。
在另一个实施方案中，编码一种或多种转运蛋白的核酸被稳定地整合到微生物基因组中。优选的宿主细胞来自泛菌属。另一个优选的宿主细胞是产酸克雷伯氏杆菌。在文献中已经描述了几个将DNA整合到基因组中的策略(参见如Balbas等人，1996，Gene 17265-69；LeBorge等人，1998，Gene 223213-219)。
柠檬泛菌的转化可采用对于大肠杆菌发展的规程由电穿孔方法来实现(Potter，H.，1988，Anal.Biochem.174361-373)。
III.转化体的鉴定将DNA引入到宿主中后，转化体是通过在载体中编码的抗生素抗性或通常通过选择在质粒中编码的功能来选择的。一旦转化体已经被与未转化的细胞区分开来，则可用标准规程来证实具有完整结构的质粒的存在(Sambrook等人，1989)。
YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸序列的存在可通过利用在图1中公开的多核苷酸序列的探针、部分或片段进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。
IV.转运测定利用HPLC方法学来确定抗坏血酸中间物水平的优选方法已在上面描述。
另外，许多种标记和缀合技术是本领域技术人员所公知的并可被用于各种核酸和氨基酸测定。生产经标记的杂交或PCR探针用于检测特定的多核苷酸序列的方法包括寡标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记或用标记的核苷酸进行的PCR扩增。或者，可将核苷酸序列或其任何部分克隆入载体以生产mRNA探针。这样的载体是本领域所公知的，在商业上可得到，且可以通过添加适当的RNA聚合酶如T7、T3或SP6和标记的核苷酸而在体外用于合成RNA探针。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)、Promega(Madison Wis.)和US Biochemical Corp(ClevelandOhio)供应用于这些程序的商业试剂盒和规程。适当的报告分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光的、化学发光的或产色的试剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。讲授这样的标记的使用的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。同样，重组免疫球蛋白可如美国专利号4,816,567所示而生产，在此处引入作为参考。同样，重组免疫球蛋白可如美国专利号4,816,567所示而生产，在此引入作为参考。
实施例实施例I材料与方法a.质粒、细菌菌株和培养基质粒pBCL1920、产酸克雷伯氏杆菌、柠檬泛菌1392A。柠檬泛菌1392A菌株是39140柠檬泛菌变型。pD92是代表含有DKG还原酶基因的载体而被描述的。美国专利号5,376,544。Murphy III培养基含有果糖0.5％、磷酸盐1.6％、MgSO4.7H2O 0.2％、Soytone 0.2％、柠檬酸盐0.01％、(NH4)2SO41％、ppm范围的痕量盐如Fe、Co、Mn、Zn和维生素如烟酸、叶酸和B12；M9培养基含有0.9％的磷酸盐、0.1％的NaCl、0.1％的NH4Cl、MgSO4 0.0005％、CaCl2 0.025％；发酵培养基含有磷酸钾(Potassium Phosphate)1％、MgSO4 0.15％、谷氨酸盐1.5％、果糖2.5％、硫酸铵0.1％和含有生物素、硫胺素、吡哆醇、核黄素、烟酸、叶酸和B12的维生素混和物，以及含有10-100ppm水平的铁、Zn和Mn离子的痕量金属混合物溶液；转运测定培养基含有100mM磷酸钾pH6.9；抗生素壮观霉素50μg/ml和四环素20μg/ml，IPTG 100μM。
b.DNA技术c.细胞生长使以重组方法构建的菌株以及野生型柠檬泛菌和产酸克雷伯氏杆菌生长在含有DKG作为唯一碳源的M9培养基或以果糖作为唯一碳源的MIII培养基中，或者具有混和碳源如0.1％到1％范围内的果糖、葡糖酸和DKG的MIII培养基中。使细胞在20-37℃之间生长，但优选地低于30℃。细胞优选地生长在中性pH，但是可以在pH5-8范围内。生长在来自种子瓶的发酵罐中的柠檬泛菌细胞使用以果糖或葡萄糖饲养的发酵培养基。
d.DKG摄入生化测定将含有细胞的发酵肉汤样品从各自的生长设备中取出并在冰水浴中骤冷。离心发酵肉汤并丢弃上清液。用0.95冰冷的盐溶液洗涤细胞沉淀，随后由DKG摄入测定缓冲液100mM冰冷的磷酸钾pH6.9洗涤两次。将细胞重悬于相同的测定缓冲液中至550nm的OD值为12，然后在室温或优选地在28℃温育。DKG摄入测定是通过将细胞与富C-14放射性同位素标记2，-5DKG混和而开始。DKG摄入的时间进程是用基于用冰冷的测定缓冲液真空/滤器骤冷来进行的。DKG摄入测量是由细胞中放射性同位素的掺入来完成的，将所获得的数据对时间绘图得到DKG摄入速率。
也进行了另一个用硅油对细胞DKG摄入和代谢研究的测定(Johnson，J.D.等人，J.Lab.Clin.Med.，1980，95429-439)。将100μl硅油加入到准备好进行测定的epitube中。将细胞和富14C(U)的2，5-DKG混和，然后在定期的时间间隔取出100μl的细胞/底物混和物并将其加入到含有硅油的epitube中，离心15秒，然后迅速在干冰/乙醇浴中冷冻。5分钟后，将含有细胞沉淀的epitube的顶端直接切入闪烁小瓶中。正好在试管剩余部分的冷冻部分上面再次切割并置入另一个含有闪烁液的小瓶中。在过夜以促进细胞沉淀从epitube顶部松散开之后记数。顶部记数的损失和沉淀中记数的出现的差异归因于细胞的代谢和释放的CO2。在摄入测定结束时，当细胞被透化时，低分子的细胞内容物泄露出来并提供了关于积累的输入底物和底物进一步代谢变为细胞成分的命运的信息。
e.DKG还原酶测定收集来自每个发酵罐的细胞沉淀并在-70℃冷冻约24小时。将在15和25小时时间点的沉淀在冰上解冻并用弗氏压碎器在pH6.5的50mM PIPES缓冲液中压碎。将抽提液在台式离心机中以14K rpm旋转2分钟，随后测量总蛋白质的浓度和还原酶的活性。所有样品是通过蛋白质的Bradford和BCA测定法来测量的，并根据需要稀释以进行精确的分级测定。该测定是相对于背景等级(backgroud rate)而测量的，其中的背景等级含有除2，5-DKG之外的所有成分(低于总等级的10％)。缓冲液含有50mM PIPES pH6.5、150μM NADPH和5mM 2，5-DKG。
也进行了利用硅油对细胞的DKG摄入和代谢分析的另一个测定(Johnson，J.D.等人，J.Lab.Clin.Med.，1980，95429-439)。将100μl硅油加入到准备好进行测定的epitube中。将细胞和富14C(U)的2，5-DKG混和，然后在定期的时间间隔(例如约每10秒钟)取出100μl的细胞/底物混和物并将其加入到含有硅油的epitube中，离心15秒，然后迅速在干冰/乙醇浴中冷冻。5分钟后，将含有细胞沉淀的epitube的顶端直接切入闪烁小瓶中。正好在试管剩余部分的冷冻部分上面再次切割并置入另一个含有闪烁液的小瓶中。在过夜以促进细胞沉淀从epi顶部松散开之后记数。顶部记数的损失和沉淀中记数的出现的差异归因于细胞的代谢和释放的CO2。在摄入测定结束时，当细胞被透化时，低分子的细胞内容物泄露出来并提供了关于积累的输入底物和底物进一步代谢变为细胞成分的命运的信息。
实施例II实施例II提供了底物的转运蛋白可能是全细胞生物转变的限速因子的基础本实施例解说了可被区室化为4个部分的从葡萄糖形成2KLG的关键步骤(图5)。利用三种周质酶在柠檬泛菌中以14-15g/l/hr的速率对关键中间物2，5-DKG进行生产(Sonoyama等人，Appl.Environ.Microbiol.，1982，431064-1069)。第二部分是需要DKG在细胞的胞质空间内转运的速率。第三个是用DKG还原酶将DKG转化为2KLG的速率(美国专利号5,032,514)。当DKG还原酶超表达时，DKG向2KLG的转变不是速率限制性的。在我们目前的2KLG生产发酵中，将诱导型质粒用于增加或减少相对于我们一般的发酵(目前使用pD92)而言的还原酶比活性，其中的DKG还原酶是在组成型启动子trp控制下的。诱导型质粒pD23是在taq启动子控制下的，可用IPTG诱导。运行了三个发酵罐，一个用pD92，两个用pD23且其中的一个用IPTG诱导。对照的pD92和诱导的pD23生产了几乎同样水平的2-KLG，而未诱导的pD23的产量则低得多。还原酶比活性的测定显示相对于对照pD92而言，未诱导的质粒生成的还原酶水平不到一半，而诱导的pD23则生成了多于两倍。这些结果显示，在我们生产2KLG的柠檬泛菌发酵中，还原酶活性的水平不是2-KLG生产的瓶颈。
菌株蛋白质浓度还原酶活性比活性pD92(对照) 3.2mg/ml 25.0u/ml 7.8u/mgpD23(未诱导的) 3.7mg/ml 12.0u/ml 3.2u/mgpD23(诱导的)3.9mg/ml 73u/ml19u/mg第四部分是在细胞内生成的并需要输出的2KLG的转运。2KLG在发酵中的生产速率(2.2g/l/hr-2.7g/l/hr)可认为与2KLG从细胞的输出速率相等。这是这样论证的，如果2KLG输出的速率是限制性的，那么细胞将在细胞内积累2KLG，这样细胞将不能以其代谢潜力发挥功能并最终死亡。然而，柠檬泛菌生产2KLG的细胞不展示这些情形的任何一个，并且细胞内2KLG的测量值保持在低于生产的2KLG最大浓度的十到二十分之一。因而可想象2KLG的输出也不是2KLG生产中的限速步骤。
实施例III实施例III提供了证实底物转运进入细胞以进行生物转变确实是限速步骤的证据将来自发酵过程的三个不同时间即种子烧瓶(seed-flask)阶段、果糖饲养阶段和葡萄糖饲养阶段的细胞沉淀收集并如在实验中描述进行加工。利用这些细胞类型的DKG摄入测定，确定出DKG摄入速率(引入DKG以转变为KLG)为0.5g/l/hr、2.7g/l/hr和2.75g/l/hr(图9)。DKG输入的速率与KLG输出的速率相等。因而这个结果证明DKG到KLG的生物转变的速率依赖于2，5-DKG进入细胞的输入速率。因而本发明将证明，通过以超表达来增加DKG摄入转运蛋白，将增强2，5-DKG的输入速率，并因而将增强2KLG的生产速率。本领域的专家可想象利用全细胞转变方法的各种生物转化中的关键限制因子实际上是底物进入细胞以进行生物转化的输入和输入速率。
实施例IV实施例IV说明利用DKG摄入测定发现产酸克雷伯氏杆菌中2，5-DKG转运蛋白的存在。WO 002170描述了来自产酸克雷伯氏杆菌的称为yia操纵子的鉴定和序列测定，该操纵子含有8个推定的开放阅读框。yia操纵子中各开放阅读框编码的这些多肽的功能没有在WO002170中描述。该操纵子的破坏去除了产酸克雷伯氏杆菌利用抗坏血酸作为唯一碳源的能力。已知抗坏血酸是一种对氧化不稳定的物质，它可通过空气氧化而分解为2，3-DKG(Kimaya，S.，Vitaminol.1961，719-26)。因而提出2，3-DKG才是生长的真正底物是合理的。Yia操纵子中称为yiaX2的一个开放阅读框编码转运蛋白型跨膜蛋白质，并因而被认为是2，3-DKG通透酶的候选物。根据寻求2，5-DKG通透酶的并行检索，从而认识到2，3-DKG和2，5-DKG是类似分子，可能yiaX2可转运2，5-DKG和其他糖类酮酸如2KLG。
为了确定yiaX2是否可转运2，5-DKG和2-KLG，将该基因从产酸克雷伯氏杆菌菌株M5a1的染色体中缺失(参见如Streicher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.681174-1177(1971))。称为MGK002的yiaX2缺失突变体是用本领域公知的标准分子生物学规程来构建的(参见如Hamilton等人，J.Bacterial.1714617-4622(1989))。另一种称为Tester菌株的产酸克雷伯氏杆菌菌株是通过将质粒编码的、受lac操纵子调节的yiaX2基因添加回产酸克雷伯氏杆菌菌株MGK002而创建的。利用MGK002和Tester菌株在+/-IPTG诱导下的DKG摄入测定证实yiaX2编码具有2，5-DKG转运活性的多肽(图9)。
实施例V实施例V提供了从微生物中筛选2，5-DKG通透酶的选择方法学有了yiaX2基因编码具有2，5-DKG转运活性的转运蛋白的信息，就可能设计出选择宿主以找到柠檬泛菌和其他生物学来源的2，5-DKG转运蛋白。构建有yiaX2基因缺失并添加了表达参与2，5-DKG到葡糖酸的分解代谢中的酶的基因的产酸克雷伯氏杆菌，其对于生物体的中央代谢而言是可评估的。能够分解代谢2，5-DKG到葡糖酸的酶是由在一些革兰氏阴性生物体中存在的tkr idnD idnO操纵子的tkr和idno基因编码的(Bausch，C.等人，J.Bacteriol.，1998，1803704-3710)。
结果所得的产酸克雷伯氏杆菌tester菌株是yiaX2[tkridno]，其除了不能将DKG输入到胞质外，含有所有以2，5-DKG作为唯一的碳源在其上生长所必需的成分。因此，编码2，5-DKG通透酶的核酸分子在tester菌株中表达后，应可以赋予tester菌株在2，5-DKG上生长的能力。这种选择方法学如图9所示。
用于构建柠檬泛菌基因组文库的克隆载体是质粒pCI1920(Lerner等人，Nucleic Acid Res.，1994，184621)，即携带有壮观霉素/链霉素抗性决定因子的低拷贝数表达载体。表达是由lacPO启动子/操纵基因区域驱动的，当由宿主提供了laclq基因产物时该区域可被该产物抑制。利用标准规程从柠檬泛菌(ATCC39140)中分离了基因组DNA并构建了基因组文库(Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningALaboratory manual)，Coid Spring Harbor Laboratory，NewYork(1992))。将扩增的文库以质粒DNA的形式贮藏以备将来用于寻找柠檬泛菌的2，5-DKG通透酶。
实施例VI实施例VI提供了通过使DKG转运蛋白在宿主细胞中超表达可以增强DKG向细胞的输入速率的证据。
将基因组文库引入tester菌株产酸克雷伯氏杆菌yiaX2[tkridno]菌株。用放射性标记的14C(U)DKG对在具有2.5％的2，5-DKg和0.1mM IPTG的M9-琼脂平板显示能够在2，5-DKG上生长的克隆检验DKG的摄入。发现各种克隆都比对照的tester菌株有改善的DKG摄入(图9)。将来自这些阳性克隆的基因组文库DNA转化入柠檬泛菌(139-2A)，并且进行DKG摄入测定以测量超过柠檬泛菌139-2A菌株的DKG摄入改善。在转化体中观察到了3到5倍的DKG摄入速率改善，该转化体通过基因组文库筛选和选择方法学而发现其含有编码DKG通透酶的质粒的额外拷贝(图10)。
实施例VII实施例VII提供了通过使DKG转运蛋白在宿主细胞中超表达可以改善2KLG的生产的证据。
当用低拷贝的载体pBCL 1920将编码柠檬泛菌DKG通透酶PermA的核酸分子(seq ID no2)亚克隆入适合从葡萄糖生物合成2KLG的柠檬泛菌菌株139-2A中时(美国专利号5,032514)，2KLG生产的生产速率从2.5g/l/hr提高到3.2g/l/hr，基于糖类的产量从45％提高到53％(图11)。
实施例VIII实施例VIII描述了来自柠檬泛菌的2，5-DKG通透酶PermA的特征。
本实施例描述了柠檬泛菌的PermA的膜拓扑结构。PFAM分析(Hirokawa，T.等人，Bioinformatics，1998，4(4)378)预测PermA含有11个跨膜结构域、8个初级结构域和3个次级跨越结构域(图12)。氨基末端位于周质而羧基末端位于胞质内。有两个大环和两个小环存在，且周质和胞质中都含有一个大环和一个小环。PermA是疏水性为0.62的膜蛋白质，其分子量为48道尔顿。基于累积比例分析，它是一种H+伴随性2，5-DKG同向转运蛋白(Lolkema，J.S.等人，1996，生物物理学手册(Handbook of BiologicalPhysics)，Chapter 11，229-260)。基于共有序列分析，它属于MFS的ACS家族(Pao，S.S.等人，Microniol.Molecular Biol.Rev.，1998，62；1-34)(图8a)。
在本领域的技术人员阅读过公开内容且不背离本发明的精神和范围后，前面的描述和实施例的各种其他的实施例和修饰对他们而言都是显然的，并且意图将所有这样的实施例或修饰都包括在附录权利要求书的范围内。此处参考的所有出版物和专利都特此整体引入。
权利要求
1.一种增强宿主细胞中2-KLG的生物合成生产的方法，该方法包含a)选择一种能在胞质中将2，5-DKG转变为2-KLG的宿主细胞；b)在维持宿主细胞的完整性时增加所说的2，5-DKG向该宿主细胞的转运；c)培养该细胞以生产所说的2-KLG；和d)生产2-KLG。
2.权利要求2的方法，其中所说的增加2，5-DKG向该宿主细胞的转运包括将DNA转化入该宿主细胞的步骤，其中所述DNA编码一种或多种将该2，5-DKG转运入所说的宿主细胞的胞质材料中的蛋白质。
3.权利要求2的方法，其中所说的一种或多种蛋白质选自YiaX2、PE1、PE6、prmA和prmB。
4.权利要求2的方法，其中所说的编码一种或多种蛋白质的DNA是从选自YiaX2、PE1、PE6、prmA和prmB的基因组中表达的。
5.权利要求2的方法，其中所说的蛋白质能够与SEQ ID NO[共有序列]进行[严格]杂交。
6.权利要求2的方法，其中所说的蛋白质与SEQ ID NO[共有通透酶序列]具有至少50％的同源性。
7.权利要求2的方法，其中所说的蛋白质与SEQ ID NO[共有通透酶序列]具有至少90％的同源性。
8.权利要求2的方法，其中所说的蛋白质与SEQ ID NO[整体通透酶序列]具有至少50％的同源性。
9.权利要求2的方法，其中所说的蛋白质与SEQ ID NO[整体通透酶序列]具有至少90％的同源性。
10.权利要求2的方法，其中所说的蛋白质包含一个含有31个残基的序列，所述残基包含对应于PermA的甘氨酸119的甘氨酸残基。
11.权利要求11的方法，其中所说的蛋白质进一步包含对应于PermA位置136的色氨酸残基(W)。
12.权利要求11的方法，其中所说的蛋白质进一步包含至少一个选自下组的氨基酸残基位于与PermA的G138相应的位置处的苯丙氨酸、位于与PermA的E141相应的位置处的谷氨酸(E)和位于与PermA的R142相应的位置处的精氨酸(R)。
13.
14.增强2，5-DKG跨内细胞膜转运入细胞溶胶的方法，该方法包含选择一种宿主细胞；和使编码一种或多种能将2，5-DKG转运入所说的宿主细胞的蛋白质的DNA转化入该宿主细胞。
15.权利要求14的方法，其中所说的宿主细胞选自细菌和酵母。
16.权利要求15的方法，其中所说的宿主细胞选自大肠杆菌、泛菌和克雷伯氏杆菌。
17.一种使2，5-DKG转运蛋白超表达的方法，包含下述步骤选择一种宿主细胞；和将编码一种或多种2，5-DKG转运蛋白的DNA转化入该宿主细胞。
全文摘要
描述了一种增强宿主细胞中2－KLG的生物合成生产的方法。这样的方法包括选择一种具有利用2，5－DKG生产2－KLG的细胞内合成途径的至少部分的宿主细胞；在维持宿主细胞的完整性时增加该2，5－DKG向所说的宿主细胞的转运；培养宿主细胞以生产该2，5－DKG；以及生产2－KLG。2，5－DKG的转运通过使编码一种或多种将2，5－DKG转运到宿主细胞内的酶的DNA转化到宿主细胞内而得到增加。
文档编号C12N15/09GK1527880SQ01815726
公开日2004年9月8日 申请日期2001年8月3日 优先权日2000年8月4日
发明者M·库玛, F·瓦勒, V·A·达特沃斯, J·A·赫啻, M 库玛, 赫啻, 达特沃斯 申请人:金克克国际有限公司, 微基因组公司