专利名称：一种在酸性范围内催化活性提高的优化改良的大肠杆菌植酸酶appa-m及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种在酸性范围内催化活性提高的优化改良的大肠杆菌植酸酶APPA-M及其基因和应用。
背景技术：
植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物机体必需矿物元素，单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶(Wiytase，催化植酸及植酸盐水解的酶)，造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低，为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费及严重的环境问题。国内外大量的实验都证明，在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷和其他矿质元素的利用率，提高对淀粉，脂肪，蛋白质等营养物质的利用率，从而促进动物健康快速的增长，减少粪便中磷含量从而减轻环境的污染。一般认为，在饲料中添加植酸酶可以使磷的利用率提高20-60%。Simons et al. (1990)，在玉米-豆粕日粮中添加微生物植酸酶， 磷的利用率提高60%;WaldrOup et al. (2000)，在以豆饼为基础日粮的肉鸡饲料中添加植酸酶，大约有50%的植酸磷被释放。随着生物技术的发展，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶基因的大规模表达成为可能。目前来源于hcherichia coli，Aspergillus niger、 Aspergillus fumigatus等微生物的植酸酶已经在巴斯德毕赤酵母中得到高效表达，并成功的在饲料中应用。其中来源于大肠杆菌植酸酶APPA具有高比活性的优点，是目前应用的最为广泛的植酸酶。该基因全长1299bp，编码432个氨基酸，N端的22个氨基酸为信号肽。 其最适温度为阳到60°C，最适pH 4. 5到5，在pH 2到3时，酶活性比较低，只有最适pH条件下的30-40 %，不利于该植酸酶在胃环境中发挥水解植酸。动物饲养试验结果表明，饲料中添加的植酸酶水解植酸的主要部位因不同动物而异，猪主要在胃中，鸡主要在嗉囊中等。要提高猪饲料中植酸酶的水解活性，主要是要提高猪用植酸酶在胃环境下的植酸水解能力，其中提高植酸酶在酸性条件下的稳定性和催化活性是重点。因此，优化大肠杆菌植酸酶APPA，使其在整个酸性范围内具有高催化活性，有较大的应用潜力和产业价值。
发明内容
本发明的目的是通过对大肠杆菌植酸酶APPA的改造，使改造后的植酸酶APPA-M 在整个酸性范围内具有高催化活性，使其能够更好的在动物胃内发挥水解植酸的作用。本发明的目的是提供一种优化改良的植酸酶APPA-M及其基因。本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组菌株。本发明的再一目的是提供上述植酸酶APPA-M的应用。本发明优选釆用定点饱和基因突变的方法对大肠杆菌来源的植酸酶APPA活性中心的22个关键氨基酸进行改造，并经过高通量突变筛选的方法筛选得到在整个酸性范围内具有高催化活性的植酸酶APPA-M。本发明的植酸酶APPA-M和原有大肠杆菌植酸酶APPA 相比，有两个氨基酸发生了突变，突变位点分别是M216C和N306D。突变后的氨基酸序列(不包括信号肽序列)如SEQ ID NO. 1所示qsepelklesvvivsrhgvraptkatqlmqdvtpdawptwpvklgwltprggeIiaylghyqrqrIvad gllakkgcpqsgqvaiiadvdertrktgeafaaglapdcaitvhtqadtsspdpIfnplktgvcqldnanvtdaiIs raggsiadftghrqtafrelervlnfpqsnlclkrekqdescsltqalpseIkvsadnvsltgavslasClteif11 qqaqgmpepgwgritdshqwntllslhnaqfyllqrtpevarsratplldliktaltphppqkqaygvtlptsvlfi aghdtDlanlggaleInwtlpgqpdntppggelvferwrrlsdnsqwiqvslvfqtlqqmrdktpIsIntppgevkl tlagceernaqgmcslagftqivnearipacsl该植酸酶APPA-M的最适pH为4.5，在pH 2. 0时仍然具有80%的相对植酸酶活性， PH 3.0和4.0时，都具有约95%的相对活性。而未改良的APPA植酸酶在pH 2.0时，只具有35%的相对植酸酶活性，pH 3.0和4.0时，也只有不到60%的相对植酸酶活性。说明本发明的改良的植酸酶APPA-M在整个酸性条件环境中都具有极高的植酸水解活性，达到了在胃环境中PH条件下能较好水解植酸的要求。本发明还提供了上述优化改良的植酸酶APPA-M的基因序列，其编码上述植酸酶 APPA-M，具体地，其碱基序列可以如SEQ ID NO. 2所示cagagtgagcctgagttgaaactggaatccgttgtcatcgtctctagacatggtgttagagcaccaacc aaggccacccaacttatgcaagatgtcaccccagacgcttggccaacctggccagtcaagctgggttggttgacacctagaggtgg tgagetcattgettacttgggtcactaccaaagacagcgtcttgttgccgacggattgttggccaagaagggttgtccacaatctg gtcaagtagctattattgctgacgtcgacgaaagaacccgtaagacaggtgaagccttcgccgccggtcttgctcctgactgtgcca ttaccgttcacacccaagctgacacttcttctccagatccattgttcaaccctttgaagactggtgtttgccaattggacaacgc taacgttactgacgctatcttgtccagagctggaggatccattgctgacttcaccggtcacagacagactgccttcagagagttggaaag agttcttaacttcccacaatccaacttgtgccttaagcgtgagaagcaagacgaatcctgttccttgactcaagcattaccatctg agttgaaggtctccgccgacaacgtctctttgaccggtgctgtcagcttggcttcctgtttgactgaaatctttcttctgcaacaag ctcaaggtatgcctgagccaggttggggtagaatcaccgactctcaccaatggaacaccttgttgtccttgcacaacgctcaattctac ttgctgcagagaactccagaggttgctagatccagagccaccccattgttggacttgatcaagactgctttgactcctcacccacctcaaaagcaagcctacggtgttaccttgcccacttctgtcttgttcattgccggtcacgatactgatttggcaaatctcggcggtgct ttggagttgaactggactcttcctggtcaacctgataacactccaccaggtggtgagctcgttttcgaaagatggcgtagactatctgata actctcaatggattcaggtttcgttggtcttccaaactttgcagcagatgagagacaagactccactgtctttgaacacgcctccagg agaagtcaaattgaccttggctggatgtgaagagagaaatgctcagggtatgtgttccttggctggtttcactcaaatcgttaacgaa gctagaatcccagcttgttccttgtaa本发明还提供了一种优化改良大肠杆菌hcherichia coli的植酸酶APPA在酸性条件下酶活性的方法，具体地，首先通过三维结构分析，确定活性中心的关键氨基酸，它们分别是第16位的R、第20位的R、第90位的D、第92位的R、第1 位的N、第1 位的K、 第204位的N、第215位的S、第216位的M、第219位的E、第220位的I、第223位的L、第 250位的H、第253位的Q、第2M位的F、第257位的L、第258位的Q、第267位的R、第303 位的H、第304位的D、第305位的T、第306位的N。其次对这些氨基酸进行饱和突变，并分别构建这些点的饱和突变的表达文库，分别对每个突变文库中随机挑选300个克隆进行植酸酶活性的分析。最后对正突变进行优化组合。最终获得到在整个酸性条件下都具有80% 以上相对活性的植酸酶APPA-M，其保藏号为CGMCC 4434。本发明还提供了包含上述优化改良的植酸酶基因appa-m的重组载体，将本发明的优化改良的植酸酶基因appa-m插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的植酸酶基因appa-m插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒本发明还提供了包含上述植酸酶基因appa-m的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株GS115。本发明还提供了上述植酸酶APPA-M在饲料添加剂中的应用，主要涉及所述植酸酶在制备饲料添加剂中的用途，以及相应的饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分可以是所述植酸酶多肽、表达植酸酶多肽的宿主细胞。本发明利用基因工程手段对大肠杆菌植酸酶APPA的进行改良，以解决大肠杆菌植酸酶APPA在胃液酸性环境中不能较好水解植酸的不足，不能在动物体内充分发挥水解植酸的作用，经过优化改良的植酸酶APPA-M在酸性条件下的活性得到很大的提高，在pH 2. 0时，仍具有80%的相对植酸酶活性。并且通过高通量筛选，获得高表达量的菌株，进一步满足工业化生产降低成本的要求，因此，本发明的优化改良的植酸酶可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。
图1植酸酶APPA和APPA-M在不同pH值下的相对酶活曲线图。
图2植酸酶APPA和APPA-M在不同pH值下的稳定性。图3植酸酶APPA和APPA-M在不同温度下的相对酶活曲线图。图4植酸酶APPA和APPA-M在70°C的热稳定性。本发明所的携带改良植酸酶APPA-M的大肠埃希氏菌appa-m^scherichiacoli) 于2010年12月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCCNo. 4434。
具体实施例方式实验材料和试剂1、菌株与载体大肠杆菌菌株ToplO,Escherichia coli BL21 (DE3)、表达载体 pET_22b (+)(购自 Novagen公司)。毕赤酵母65115、载体？？扣9(购自hvitrogen公司)。2、酶类及其他生化试剂Fast pfu购自全式金公司，内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自hvitrogen公司。X-Gal、IPTG、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。3、培养基大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，NaCl，pH7.0)。酵母培养基为YPD (1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)。酵母筛选培养基为MD (葡萄糖20g/L， 琼脂粉 20g/L,生物素 4 X 10 VL, YNB 13. 4g/L)。酵母诱导培养基BMGY(1 %酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% ΥΝΒ、0. 00004 % Bi0tin、l%甘油(V/V))和BMMY(除以甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001) ；Kriegler,GeneTransfer and Expression :A Laboratory Manual (1990)；禾口 James M. Cregg, PichiaProtocols ( % 一版，1998)。实施例1、大肠杆菌植酸酶基因appa的合成将来自Escherichia coli菌株的植酸酶基因appa(Dassa，1990)去掉N-端信号肽序列，按照毕赤酵母密码子的偏爱性(赵翔，2000)，在不改变其氨基酸序列的前提下进行序列改造。改造中避免GT……AG这一形式的位点，尽量避免富含AT (e. g. ATTTA、AATAA、 AATTAA等)序列的出现，该些序列与mRNA的稳定性有关。将改造设计好的基因序列送南京金瑞斯公司进行全基因合成。实施例2、重组表达载体pET_22b (+) -appa-m的构建根据合成基因的序列设计PCR引物5’端含有Nco I内切酶位点，3’端含EcoR I 内切酶位点，引物序列如下5，端引物 pET-appa-F :GCACCCATGGGACAGAGTGAGCCTGAGTTGAAACTG3，端引物 pET-appa-R :GCACGAATTCTTACAAGGAACAAGCTGGGATTCTAG以合成基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体 pET-22b (+)上，得到重组载体 pET-22b (+) -appa-m。
实施例3、基因定点饱和突变(1)、活性位点的关键氨基酸的确定从蛋白质三维结构数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中，下载大肠杆菌植酸酶APPA的三维结构文件，其在PDB数据库中的编号为1DKQ。该PDB结构是酶于底物的复合物，在其结构含有底物IP6。使用PDBVi ewer对该结构进行分析，APPA共有 410个氨基酸残基，其15-23个氨基酸残基为酸性植酸酶所共有的保守序列RAGVRAPT。该蛋白共有两个结构域N端的134个氨基酸残基与C端的152的氨基酸残基共同组成alpha 结构域，其余中间1 氨基酸残基组成alpha-beta结构域，保守序列与活性中心位于两个结构域之间。通过分析，最终确定了 22个与底物结合相关的关键氨基酸，它们分别是第16 位的R、第20位的R、第90位的D、第92位的R、第1 位的N、第1 位的K、第204位的N、 第215位的S、第216位的M、第219位的E、第220位的I、第223位的L、第250位的H、第 253位的Q、第2M位的F、第257位的L、第258位的Q、第267位的R、第303位的H、第304 位的D、第305位的T、第306位的N。O)、基因位点的饱和突变目的基因突变位点统一为NNK，其中，N代表A，T，C，G等四种碱基，K代表G，T等两种碱基。正向引物在NNK右侧取18个碱基左侧取6的碱基，反向引物在NNK左侧取18 个碱基右侧取6的碱基构成，反向引物与正向引物有15bp的重复序列。PCR产物经DpnI酶切处理后转化E. coli BL21 (DE3)点击感受态细胞，每个突变位点的克隆数，基本都在2000 个以上。经随机挑取20个克隆测序，验证其阳性率，结果表明所长的克隆95%都为阳性克隆，为下一步挑取克隆进行植酸酶活性的测定奠定基础。实施例4高植酸酶活性菌株的初筛通过概率分析，每个饱和位点挑取300个克隆，可以包括饱和突变的20个氨基酸。 因此为了较快的从所有22个点的突变库中，筛选到酶活性提高的阳性克隆，本发明采用平板诱导筛选方法对目标克隆进行初步筛选。具体如下每个突变位点随机挑取300个克隆， 接种到PH为5. 5包含0. 5mM的IPTG，0. 的肌醇六磷酸，1. 5%琼脂糖的LB平板中，37°C 过夜培养。并将由IM CaCl2和0.211乙酸钠(pH为5. 5)组成的缓冲液倾倒于平板上。将平板在室温放置1小时，并根据澄清区初步鉴定植酸酶活性的有无和高低，并从中挑取澄清区明显大于原大肠杆菌植酸酶APPA的对照的克隆，共筛选到509个克隆。实施例5整个酸性条件下植酸酶活性高菌株的复筛经过第一轮初筛基本确定509个克隆，进一步通过96孔深孔培养平板进行培养筛选，每孔含500 μ L LB培养基，37°C摇床200rpm培养M小时后，转移50 μ L平台期生长菌液到新的96孔平板，平板每孔添加450 μ L LB培养基，含有终浓度为0. 5mM IPTG，37°C过夜摇床200rpm诱导表达植酸酶。取5 μ L含有过夜培养诱导表达的菌液上清液，加底物1. 5mmol/ L 植酸钠 65 μ L (用 0. lmol/L 的 pH 7. OTris-HCl 缓冲液配制)，37°C反应 20min，加 50 μ L 显色液(IOg四水合钼酸铵+32mL硫酸+73. 2g硫酸亚铁，加水定容至1L)，并在700nm下测其OD值，计算酶活。按照以上方法分别在pH 2.0，3.0，4.0，5.0分析不同克隆在整个酸性条件下的植酸酶活性。在以上4个pH条件酶活性都高的克隆，并且在这些pH条件下的植酸酶活性都比较相近的克隆挑选为阳性克隆，从96孔板上得到了得到5个阳性克隆，取阳性克隆质粒DNA进行基因测序。
测序结果确定氨基酸阳性突变位点，克隆1，2和4的突变位点都为第216位的M 替换为C ；克隆3和5的突变位点都为第306位的N替换为D。因此最终得到的阳性是两个其突变位点分为M216C和N306D，最后将这两个位点同时在原大肠杆菌植酸酶APPA上进行突变，并在大肠杆菌中进行表达，及在不同PH条件酶活性测定，与M216C和N306D两个克隆相比，新得到植酸酶基因在pH2. 0和pH 5. 0时酶活更高。将两个点结合在一起的突变在整个酸性条件下酶活性更高，因此最终获得的突变基因是M216C和N306D都突变的基因，并命名为 appa-m。实施例6植酸酶appa-m在毕赤酵母中的高效表达(1)表达载体的构建及在酵母的表达以突变了 M216C和N306D的大肠杆菌植酸酶基因appa-m为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物pIC9-appa-F和pIC9_appa-R，对appa-m的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体 pPIC9(Invitrogen, San Diego)，使植酸酶基因appa-m插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-appa-m，转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。约8微克的用限制性内切酶BglII进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GSl 15感受态细胞，涂布于组氨酸缺陷性的RDB平板，30°C培养2_3天，挑取在RDB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。酵母表达引物序列如下pIC9-appa-F GCACGAATTCCAGAGTGAGCCTGAGTTGAAACTGpIC9-appa-R :GCACGCGGCCGCTTACAAGGAACAAGCTGGGATTCTAG(2)转化子植酸酶的诱导表达及纯化转化子经BMGY培养2天后，转移到BMMY中经过两天的甲醇诱导后，对转化子进行植酸酶活性测定。96个转化子中有47个转化子被检测到植酸酶活性，在培养基上清的酶活单位范围约在35-380U/mL之间。挑选活性最高的转化子在摇瓶中大量培养，诱导两天后检测植酸酶活性。诱导上清液经过12000g离心10分钟，去除酵母菌体，收集含有植酸酶蛋白的上清液。对处理过的上清进行硫酸铵沉淀，硫酸铵粉末被加入到上清液中，到达80 %的饱和度，搅拌过夜。离心收集沉淀，沉淀用0. ΙΜ,ρΗ 8.0的Tris-HCl缓冲液溶解。用0. 22 μ m 的滤膜对上清液进行抽真空处理，去掉其他的杂质。将所获得的溶液装入透析带中，透析带悬浮在0. 1Μ，ρΗ8. 0的Tris-HCl缓冲液中，过夜透析处理，除去大量的盐离子。透析后的样品通过PEG 8000浓缩处理后，2mL的浓缩液通过阴离子交换HiTrap Q Sepharose XL FPLC column (AmershamPharmacia Biotech, Sweden) ii—^屯4t。 0· 1Μ，ρΗ8· 0 白勺 Tris—HCl L IM NaCl进行梯度洗脱，收集目的峰尖的洗脱液5mL。将收集液电泳检测，表明目的蛋白已被纯化。实施例7、对植酸酶APPA及APPA-M的部分性质分析(1)植酸酶APPA及APPA-M的最适pH和pH稳定性在不同pH条件下，对先前纯化的大肠杆菌植酸酶APPA及本发明纯化的改良后植酸酶APPA-M分别进行最适pH的测定，测定方法按常规方法进行测定，结果如图1所示。从图1可见，原大肠杆菌植酸酶APPA和改良后植酸酶APPA-M WpH反应曲线有明显的差异，总体上APPA-M在整个酸性条件下的相对植酸酶活性都明显高于原大肠杆菌植酸酶APPA。 例如在pH 2. 0时，APPA的相对活性是35%, M APPA-M是80% ；pH 3. 0是APPA的相对活性是40 %，而APPA-M是95 % ；pH 3. 0是APPA的相对活性是50 %，而APPA-M是98 %。将纯化好的原植酸酶APPA和改良植酸酶APPA-M，稀释到一定浓度，在pH 1-10的缓冲液中，37°C放置lh。然后再在37°C、pH 4. 5的条件下测定酶活，通过计算相对酶活来比较重组酶对pH的稳定性。结果如图2所示，从图2可见，这两个植酸酶APPA和APPA-M的 PH稳定性曲线基本没有改变，只是在pH 1. 0时APPA-M更稳定点。(2)植酸酶APPA及APPA-M的最适温度和热稳定性将纯化好的原植酸酶APPA和改良植酸酶APPA-M稀释到所示浓度，取50 μ L分别在30、40、45、50、55、60、70、80°C温度下测定酶活，计算相对酶活，以确定该酶的最适温度。 其结果如图3所示，这两个植酸酶APPA和APPA-M的最适温度曲线基本没有改变，最适温度均在50-60°C之间。将纯化好的原植酸酶APPA和改良植酸酶APPA-M稀释到所示浓度，取2mL在60°C 保温。接着分别在2、4、6、8、10min取出100 μ L酶液稀释到所示浓度。在37°C，pH 4. 5的条件下测定酶活，以未处理的原酶液作为100%的对照，其测定结果如图4所示。这两个植酸酶APPA和APPA-M的热稳定性曲线基本没有改变， (3)植酸酶APPA及APPA-M的比活性 为了确定原植酸酶APPA和改良植酸酶APPA-M的比活，首先通过Lowry方法确定了纯化的植酸酶的蛋白浓度。并且在37°C，pH 4. 5的条件下通过硫酸亚铁钼蓝法，分别对这两个酶进行酶活力的测定。通过计算，该原植酸酶APPA和改良植酸酶APPA-M的比活分别为 3135±83U/mg 和 3406 士 92U/mg。
权利要求
1.一种优化改良的大肠杆菌植酸酶APPA-M，其特征在于，其第216位氨基酸为半胱氨酸、第306位氨基酸为天冬氨酸。
2.一种优化改良的大肠杆菌植酸酶APPA-M，其特征在于，其具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
3.一种优化改良的大肠杆菌植酸酶基因appa-m，其特征在于，其编码权利要求1所述的大肠杆菌来植酸酶APPA-M。
4.一种优化改良的大肠杆菌植酸酶基因appa-m，其特征在于，其具有如SEQ IDN0. 2所示的核苷酸序列。
5.包含权利要求3所述的优化改良的大肠杆菌植酸酶基因appa-m的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组酵母表达质粒 pPIC9-appa-m0
7.表达在酸性范围内催化活性提高的优化改良的大肠杆菌植酸酶的大肠杆菌，其特征在于，保藏号为=CGMCC 4434。
8.包含权利要求3所述的优化改良的大肠杆菌植酸酶基因appa-m的重组菌株。
9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为毕赤酵母菌株GS115。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种在酸性范围的催化能力和比活性提高的植酸酶APPA-M及其基因和应用。为了提高大肠杆菌植酸酶APPA在酸性范围的催化能力和比活性，利用基因工程手段对大肠杆菌植酸酶APPA活性中心的22个关键氨基酸进行了饱和突变。当突变位点为M216C和N306D时，经过优化改良的植酸酶APPA-M其在酸性范围pH 2到5的催化活性得到了很大的提高，可在应用中显示出巨大的应用潜力。
文档编号C12N1/21GK102559632SQ201010602210
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者付大伟, 张菁, 詹志春 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司